专利名称：一种调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYB1基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYBl基因及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
林业具有巨大的生态价值，但对环境要求有差异。近年来随着分子标记辅助选择技术的运用以及基因工程研究的兴起，为改良林木奠定了基础。但目前林木抗虫、抗干旱、耐盐碱关键功能基因的发掘与利用滞后、开展分子标记辅助育种、功能基因的克隆、转基因育种，进行林木新种质的创造等方面的研究成为必然趋势。绒毛白蜡是木犀科的重要组成成员，是世界上重要的树木之一。由于绒毛白蜡具有耐干旱和盐碱的特点，已被广泛种植在各个地区。耐绒毛白蜡具有耐盐、美观、分布广等特点，但是国内对白蜡的研究主要侧重于白蜡苗木繁育、造林技术等方面，抗逆性更强的优良株系的筛选及分子机理研究很少，可利用的抗逆基因更少。因此，挖掘绒毛白蜡的重要基因并用于遗传改良具有重要的研究价值。植物在生长发育过程中经常遭受到许多生物和非生物因素的胁迫，在抗逆反应过程中，植物通过其信号传导途径有效地调控体内相关功能基因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，形成高效有序的信号调控网络，以降低或消除给植株带来的危害。而转录因子在植物的生长发育和防卫反应的表达调控中有着非常重要的作用，可参与植物防卫反应的各种信号途径，从而调节植物的生长发育和对环境的反应等。由于一个逆境相关转录因子可以调控多个下游功能基因的表达，因此利用转录因子来改良树木的抗逆性比单个下游功能基因的转基因应用能获得更加理想的综合效果。转录因子是指那些专一性地结合于DNA特定序列上、能激活或抑制其他基因转录的蛋白质。MYB转录因子是一种特异性的转录因子，当植物在干旱、低温及盐等逆境胁迫下，MYB转录因子被诱导表达，与相应`元件特异结合，启动下游与抗逆性相关的功能基因的表达，导致基因产物的累积，调节植物体内各种生理生化反应，最终使植物对环境胁迫的抗逆性得到提高。许多研究表明，转录因子在遗传工程中具有强大的功能，过量表达相关的基因编码的转录因子能有效提高植物的抗逆性。目前，关于MYB转录因子基因的研究主要集中在草本植物中，有关木本植物的MYB转录因子基因的克隆及表达的研究较少。在含有单个MYB结构域的MYB蛋白的研究中，Dong等人在马铃薯中发现StMYBlR-1转录因子，该基因激活干旱诱导相关基因，通过调节细胞内水分缺失达到抗旱目的。对于MYB家族中种类最多的R2R3-MYB成员其研究相对要丰富很多，目前发现的与植物耐逆相关的基因有很多。仅在拟南芥中就发现了许多与生物和非生物胁迫相关的基因，如AtMYB41基因就属于R2R3-MYB类，该转录因子具有多重调控作用，能对ABA、干旱、高盐和低温各种胁迫刺激做出反应。拟南芥的AtMYB2和AtMYB60也被证实参与植物的耐旱胁迫过程。拟南芥的AtMYB2转录因子，在逆境下表达增强，同时也增强了干旱应答基因rd22和AtADHl的表达；在干旱胁迫下AtMYB2也作为ABA诱导的转录激活子发挥功能。AtMYB60则通过脱落酸信号级联反应来调节植物气孔运动、干旱胁迫及其抗病性。关于单子叶植物中MYB基因参与抗逆胁迫的研究也较多。如从水稻中克隆得到的OsMYB2和0smyb4基因。它们分别参与了水稻的不同抗逆调控。研究发现OsMYB2基因在盐、低温和干旱条件下可被诱导表达；过量表达水稻中的0smyb4基因可显著提高转基因植物对干旱、高盐、UV辐射等的耐受性。此外，蒴苣苔中的BcMYBl基因经实验发现该基因在干旱诱导条件下可强烈表达，同时还可对PEG、高盐、低温等胁迫产生一定程度的应答。近年来，发现了在植物抗逆胁迫中发挥作用的具有3个重复结构域的R1R2R3-MYB转录因子。如从水稻中克隆到的R1R2R3-MYB转录因子基因OsMYB3R-2，在拟南芥中过量表达该基因后，发现转基因植株相比对照植株对低温、干旱和高盐的耐受性显著提高。此外，还有许多MYB基因受低温或者高温的诱导，如AtMYB15基因可增强转基因植株的耐冻性而AtMYB68基因则在高温诱导下表达。这些结果表明，MYB转录因子作为功能基因表达的调节开关，可以对不同的基因进行精确的调节，在植物逆境信号传递过程中发挥着关键的作用，所以通过增强某个转录因子的作用，可促使多个与抗逆有关的功能基因表达，这是使植物抗逆性状获得综合改良的一条非常有效的途径。并且MYB类转录因子在胁迫信号传递过程中起重要作用，它可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达，这对从整体上增强植物的抗逆性，提高其稳定性，将有巨大的应用前景，对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值。因此，克隆新的具有自主知识产权的MYB类转录因子基因，研究其基本的生物学特性和功能，将为研究整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为利用植物基因工程的方法改良作物抗逆性，创造新的抗逆树种提供物质基础。但目前没有关于绒毛白蜡MYB转录因子的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYBl基因及其应用。一种调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYBl基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。一种由上述FvMYBl基因编码的多肽，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种插入上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的载体。一种重组细胞,插入了上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID N0.1序列的载体。上述FvMYBl基因、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。有益效果本发明从绒毛白蜡中克隆了调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYBl基因，该基因的表达受盐胁迫的影响；本 发明所述的FvMYBl基因对从整体上增强植物的抗逆性，提高其稳定性，将有巨大的应用前景，对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值，为研究整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为利用植物基因工程的方法改良作物抗逆性，创造新的抗逆树种提供物质基础。
图1是盐胁迫条件下绒毛白蜡不同器官表达FvMYBl基因量的半定量PCR电泳其中:第一行电泳图是白蜡FvMYBl基因的半定量PCR结果；第二行电泳图是以白蜡@ -actin基因作为半定量的内参对照进行的PCR扩增结果；1、根，2、子叶，3、茎，4、叶，5、300mM盐胁迫处理24h后的根，6、300mM盐胁迫处理24h后的子叶，7、300mM盐胁迫处理24h后的茎，8、300mM盐胁迫处理24h后的叶；图2是转基因烟草的PCR检测电泳图；其中:M、DL2000 ;1、阳性对照；2、水对照；3_16、FvMYBl转基因植株；17、阴性对照。
具体实施例方式下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围不限于此。实施例1、实验方法与步骤1.1基因的分离以绒毛白蜡3周苗龄的幼苗叶片为材料，称取0.2g新鲜材料于加有液氮的研钵中迅速研磨；充分研磨至细粉状后，将其装入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理好的1.5ml离心管中，加入600iil 65°C预热好的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(由DEPC水配制)，立即剧烈涡旋30 sec ;65°C温浴2 5min，期间涡旋3 5次；稍冷却后，加入等体积氯仿/饱和酹，剧烈润旋60sec ；4°C, 12000rpm离心15min ;取上清液移至新的1.5ml离心管中,加入等体积预冷的异丙醇，_20°C沉淀2h ;4°C，12000rpm离心15min，弃上清；依次用70%乙醇、无水乙醇洗涤，晾干后加入30 50 ill DEPC水溶解，制得RNA溶液。对溶解后的RNA进行纯化，反应体系如下:RNA溶液20 50 ii g，IOXDnase IBuffer5 u I, Dnase I (5u/ul) I u I, Rnase I Inhibitor (40u/ul) 0.5 u I,最后加 DEPCH2O至总体积50 iil，于37°C反应Ih ;之后加入350 ill DEPC H2O ;加入等量(400 yl)的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)，混匀；离心，取上层水相到新离心管中；加入等量(400 u I)的氯仿，充分混匀；离心,取上层水相到新离心管中；加入1/10体积(IOii I)的3MNaAC (pH 5.2);加入2.5倍体积的冷无水乙醇，_20°C过夜；离心回收沉淀，70%乙醇洗涤干燥；加20 ill DEPCH2O溶解后，电泳检测。利用3’ RACE方法扩增FvMYBl基因的cDNA序列。具体操作方法如下:首先，将mRNA 反转录成第一链 cDNA，使用 Takara 公司 RNA LA PCRTM Kit (AMV)试剂盒进行反转录，反应体系为10yl。依次加入2iil MgCl2,10XRNA PCR Buffer Iu I,dNTP Mixture(各 IOmM)Iy I,Rnase Inhibitor 0.25 u I,Reverse Transcriptase 0.5 uI,OligoDt-Adaptor Primer 0.5 u I, Total RNA(I u g/ u I) 4.75 u I 体系混勻后，按以下条件进行反转录:30°C IOmin, 50°C 30min,99°C 5min,5°C IOmin0 以第一链 cDNA 为模板进行3’ RACE扩增，所用引物为:Fv-outer:5' -GTAGGGAAAGGAGATTGGAGAGGGAT-3' SEQ ID N0.3Fv-1nnerj' -TTGATATTACCACTGATACGGTTTTG-3' SEQ ID N0.4 PCR 反应体系中，依次加入 10 X PCR Buffer 2 u 1,2.5mM dNTP 4u I, cDNA I u I,特异性引物 0.5iil (10mM)，通用引物 0.5iU (10mM),LA Taq DNA 聚合酶 0.lyl，加 ddH20M 20 μ 1PCR反应条件:预变性94°C 5分钟；变性94°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 2分钟，32个循环；终延伸10分钟，4°C保存。PCR产物于1被％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后连于T3 Easy vector(购自北京全式金生物技术有限公司)。连接体系5 μ 1，其中1μ I Τ3 Easy vector,4y I PCR产物。于25°C连接20分钟，将连接产物转化DH5a感受态细胞。筛选阳性克隆后送测序。根据GenBank数据库中EST序列信息及拟南芥、苹果、大豆和水稻氨基酸比对确定所获得的EST序列5'端包含FvMYBl基因起始密码子ATG。将测序得到的3’ RACE序列与其拼接得到FvMYBl的全长cDNA序列。1.2基因的表达分析通过半定量RT-PCR方法对FvMYBl基因进行了盐胁迫下的组织特异性表达分析。具体方法如下:以白蜡各组织总RNA反转录的cDNA为模板，根据文献设计白蜡β -actin序列的特异引物，β -actin-F:5/ -GCAGGGCGTGATTTAACTG-3' , SEQ ID N0.5β -actin-R:5/ -CTCCGATCCAGACACTGTACT-3' SEQ ID N0.6根据克隆到的FvMYBl序列，设计特异目的基因RT-PCR反应引物:FvMYBl-RT-F:5/ -GCTATTGTTGTTGGGTGGT-3' , SEQ ID N0.7FvMYBl-RT-R:5/ -GCTATTGTTGTTGGGTGGT-3' SEQ ID N0.8以提取绒毛白蜡各器官的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共25个循环;于72。。延伸IOmin01.3植物表达载体的构建通过构建pROKI1-FvMYBl载体转化烟草进行基因功能的验证。具体操作方法如下:采用引物:FvMYBl-S:5 -GCTCTAGACTAGCATTCGTTAATATACTTTTTA-3> SEQ ID N0.9FvMYBl-A:5’ -CGCGGATCCACAGACATCAATAACATTATTCCCA-3’ SEQ ID N0.10以包含目的基因的质粒为模板，扩增包含完整读码框的FvMYBl基因。PCR 反应体系中，依次加入 10XPCR Buffer 2 μ 1,2.5mM dNTP 4 μ 1，cDNA I μ I,特异性引物 0.5μ I (IOmM)，通用引物 0.5μ I (IOmM)，LA Taq DNA 聚合酶 0.1μ 1，加 ddH20 至20 μ I。PCR反应条件:预变性94°C 5分钟 ；变性94°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C I分钟，32个循环；终延伸10分钟，4°C保存。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后连于T3 Easy vector (购自北京全式金生物技术有限公司)。连接体系5μ 1，其中1μ I Τ3 Easy vector,4y I PCR产物。于25°C连接10分钟，将连接产物转化DH5a感受态细胞。PCR筛选阳性克隆后送测序。用Fermantus公司生产的BamHI和Xba I酶，分别酶切包含目的基因片段的质粒和载体pROKII质粒，操作如下:酶切体系各100 μ 1，包括10 μ I 10XFD Green Buffer, 40 μ I包含目基因的质粒 / 载体 pR0KII，5y I FD BamHI, 5 μ I FD Xba I 和 40 μ I ddH20。于 37°C水浴15min。酶切产物用济南英伦生物科技有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收基因片段，操作如下:将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入1.5ml离心管中。加入3倍体积的溶胶液，于50 55°C水浴至胶融化。加500 u I平衡液到吸附柱中，于12000rpm离心lmin。将混合液转入平衡好的吸附柱内，于12000rpm离心lmin，弃去套管内废液。向吸附柱内加A 600 u I漂洗液,于12000rpm离心lmin,弃去废液。重复漂洗一次，弃去废液，12000rpm离心2min。将吸附柱室温下吹干，然后将吸附柱转移至无菌的1.5ml离心管内。向吸附柱内加入 30 u 165°C预热的 Elution Buffer, 12000rpm 离心 lmin 回收 DNA 溶液。将回收的基因片段连接入植物表达载体pROKII中，操作如下:连接体系20iU，包括3 ill回收的pROKII载体，8 ill回收的基因片段，2 ill 10 X T4连接酶缓冲液和IiU T4连接酶，最后加ddH20至20 iil，16°C过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，PCR筛选阳性克隆后，酶切鉴定并送测序。1.4烟草的遗传转化将构建好的重组载体转入农杆菌LBA4404 (购自Biovector公司)中，操作如下:200 u I感受态细胞中加入I U I重组质粒，冰浴30min。液氮冷冻lmin ;37°C水浴2 3min。加入800iil YEB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，pH = 7.2)，28°C摇菌3 5h, 6000rpm离心5min ;100 ii I YEB重悬沉淀后涂布于含100 u g/ml卡那霉素,50 u g/ml利福平的平板上，28°C培养2 3天。采用烟草叶盘法进行农杆菌的转化。操作如下:烟草种子用75%乙醇消毒lmin，无菌水冲洗3 5次；用20%次氯酸钠对种子消毒IOmin,无菌水冲洗3 5次，均匀播种于1/2MS基本培养基上，使其发芽；待种子发芽(约两周)后，将其转移到含1/2MS培养基的组培瓶中，生长4 5周后用于转化；挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于5ml含有50 ii g/ml卡那霉素,50 u g/ml利福平的YEP液体培养基中，28°C，200rpm过夜培养。按1:50接种于50ml含相同抗生素的新鲜YEP培养基中，至OD600为0.4 0.5，离心收集菌体后，等体积重悬于MS液体培养基中。取烟草叶片，剪成小块(0.5X0.5cm)，将剪好的烟草叶片浸于重悬液中5 lOmin，期间振荡，叶盘取出后用无菌滤纸吸干表面水分，将其排列在MS分化培养基上，280C，暗培养两天。暗培养两天后，将叶片排列在MS选择培养基上，280C，光照培养16h/d，每隔两周更换一次培养基。待其长出丛生芽时，将其切下放入伸长培养基上，使其伸长。丛生芽长至3 5cm时，转移到生根培养基，促其生根。待根系发育好后，移入灭菌营养土中，覆膜3 5天；长至一定程度移至大盆中，常规管理。实 验中烟草组织培养所用各种培养基如表I所示。表I烟草组织培养中所用培养基
权利要求
1.一种调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYBl基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种由权利要求1所述FvMYBl基因编码的多肽，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一种插入权利要求1所述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的载体。
4.一种重组细胞，插入了权利要求1所述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或含有SEQ IDN0.1序列的载体。
5.权利要求1所述FvMYBl基因、权利要求3所述载体或权利要求4所述重组细胞在经济作物生产改良中的 应用。
全文摘要
本发明涉及一种调控绒毛白蜡耐盐性的FvMYB1基因及其应用，属于分子生物学技术领域。一种控制绒毛白蜡耐盐特性的FvMYB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过构建过量表达载体转化植物材料，表明该基因的过量表达可以提高植物的耐盐性，这为进行白蜡非生物胁迫的研究奠定了理论依据和基因来源。
文档编号C12N15/29GK103173464SQ20131008897
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者毕玉平, 李田, 彭振英, 范仲学 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心