专利名称：多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程、病毒学领域，具体涉及一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用技术领域。
背景技术：
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD),是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触性人畜共患传染病，在国际上受到高度重视。该病毒属于小RNA病毒科FMDV属，有O型，A型，C型，SAT I型，SAT II型，SATIII型及Asia I型等7个血清型，70多个亚型，各型之间无交叉反应。流行病学调查和实验感染证明，有100多种动物可以感染。口蹄疫已被世界动物卫生组织(world organization of animal health, 0ΙΕ)列为 A 类动物传染病之首。( 一 ) 口蹄疫的发生和危害:口蹄疫的发生早在五六百年前就已经有记载，在14-15世纪就有类似口蹄疫的牛病的描述。最早对于口蹄疫发生和流行的描述，应追溯到1546年,意大利学者GirolamoFracastor较为详细地记录了 1514年在意大利Friul1、Venice、Verona等地先后暴发口蹄疫的情况。自意大利发生口蹄疫以来，口蹄疫在欧洲大陆流行了几百年，17-18世纪，口蹄疫在法国、意大利、德国 、瑞士、奥地利等国经常大规模流行。英国也在1839年发生了口蹄疫。此后欧洲在1845-1894年之间均有口蹄疫的广泛流行。1991年保加利亚发生了一次规模较大的疫情。2001年口蹄疫在英国流行，同年9月欧洲各国声称口蹄疫在欧洲已经被消灭，然而在2007年8月英国由于实验室管道泄漏，再次出现口蹄疫。根据联合国粮农组织(foodand agriculture organization of the UnitedNation, FA0)和OIE发表的家畜卫生年鉴统计资料，1951-1953年亚洲每年都曾发生口蹄疫的大流行，1959年亚洲有16个国家或地区发生口蹄疫，1977年有13个，1979年多达30个，1982-1983年有27个，1984年有16个，1985年有10个，1987年又上升为22个，1989年仍有17个国家或地区流行口蹄疫。到了 90年代后，亚洲口蹄疫疫情更为严峻。最严重的是1997年和2000年中国台湾和日本、韩国暴发大规模口蹄疫，损失严重。中北美国家是世界上最早消灭口蹄疫的国家和地区，美国于1929年、加拿大于1952年、墨西哥于1954年宣布消灭口蹄疫。此前美国历史上口蹄疫曾发生了 9次，墨西哥在1926年和1946年曾2次暴发口蹄疫，经过采取许多周密而有效的措施扑灭了疫情。南美国家口蹄疫的疫情较为严重，多年来造成很大的经济损失。不过经过南美各国在防制方面的努力，1981年智利宣布为无口蹄疫国家；到90年代，OIE曾将乌拉圭、阿根廷、巴拉圭、巴西划为“疫苗免疫的无口蹄疫国家或地区”。几年之后，口蹄疫又入侵阿根廷南部地区，只有智利一直保持着无口蹄疫国家的地位。口蹄疫的发生和流行对当地的发展有着巨大的危害，以我国台湾地区1997年3月的疫情为例。这场口蹄疫风暴前后历时3个多月，共波及6147个养猪场，1011674头猪发病，184231头猪死亡，扑杀了 600万头猪，直接经济损失高达15.52亿美元，相关行业的间接经济损失为62.08亿美元，国民经济总产值损失达104.76亿美元。( 二)RNAi技术在抗病毒上的应用:由于病毒的入侵，很有可能造成宿主细胞的复制、代谢及其它正常生理功能受到影响，甚至使宿主细胞死亡，最终导致宿主的发病乃至死亡。目前抵抗和消除病毒感染给宿主带来的不良后果，主要依赖于抗病毒的药物和干扰素，然而病毒为了生存会在进化中不断形成新的耐药性，而且某些药物和干扰素对动物机体会产生很大的副作用。RNAi能阻断病毒感染途径，或抑制其作用过程中关键蛋白质的表达，是对抗病毒感染最有效的方式。因此，RNAi的出现给抗病毒研究提供了新思路，为病毒病治疗带来了新希望。然而，科学家们至今已针对FMDV不同基因在细胞和动物等不同水平对RNAi抗FMDV效果进行了研究和探索。据报道，在长期使用SiRNA抑制病毒复制的治疗过程中会使病毒基因变异而产生RNAi抗性，导致病毒逃逸。而为了解决这一问题，人们开始针对病毒基因组保守区或同时以不同基因序列作为靶基因。
发明内容
本发明的目的在于公开了 一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，利用该多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体可生产转基因动物，用于对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。本发明的另一个目的在于公开了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法。本发明的第三个目的在于公开了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:—种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体,其中,所述表达载体为载体一或载体二，其中载体一为 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ;或载体二为LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP0上述技术方案所述的一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其中，多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体中Consl如序列I所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。上述技术方案所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，包括下述步骤:(I)、根据GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守区，化学合成3个shRNA串联的 Consl-Cons2-Cons3 片段，连入 pMD_18T 载体，得到 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP载体；其中Consl-Cons2-Cons3中在Consl的5’端设有XbaI\SacI双酶切位点，在Consl和Cons2之间设有Clal/Xhol双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII\MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP\NotI双酶切位点；(2)、以水牛基因组为模板，以SEQ N0.4/SEQ N0.5为引物扩增出水牛7SK的启动子bu7SK ;以水牛基因组为模板，以SEQ N0.6/SEQ N0.7为引物扩增出水牛U6的启动子buU6 ;以牛基因组为模板，以SEQ N0.8/SEQ N0.9为引物扩增出牛U6的启动子boU6 ；(3)、对步骤⑵中得到的启动子片段和步骤⑴得到的载体分别进行双酶切后连接，依次将启动子bu7SK、启动子buU6和启动子boU6连入步骤(I)的pl8T-Consl-Cons2-Cons3_LoxP 载体中，得到载体 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6_Cons3-LoxP ；(4)、用 Xbal/Notl 双酶切载体 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LοχΡ,得到 Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP-NotI ；以慢病毒载体质粒pSicoR为载体骨架，用Xbal/Notl双酶切载体骨架后，用T4连接酶将Xba1-bu7SK_Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI 连接入 Xbal/Notl 双酶切后的 pSicoR 质粒中，得到多个抗口蹄疫 shRNA 串联表达载体一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ；(5)、将载体一与慢病毒包装质粒pNRF和pVsvg在293T细胞中共转染，得到载体二 LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。上述技术方案所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，其中，步骤(3)具体方法如下:(a)、首先用内切酶 Xbal/SacI 将 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切开，将 bu7SK启动子用 T4 连接酶连接至 Consl 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP ；(b)、其次用内切酶 Clal/Xhol 将 Pl8T-1xi7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切开，将buU6 启动子用 T4 连接酶连接至 Cons2 的 5’端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2_Cons3-LoxP ；(c)、最后用内切酶Mlul/Bglll 将 pI8T-1xi7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3_LoxP 切开，将boU6启动子用T4连接酶连接至Cons3的5’端，得到pl8T-bu7SK-Consl-buU6_Cons2-boU6-Cons3_LoxP。上述技术方案所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体在检测由该载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制方面的应用或者在构建转基因小鼠方面的应用。
上述技术方案所述的应用，其中，检测步骤为:用载体二转染BHK-21细胞获得转基因细胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分别感染转基因细胞BHK-LV和非转基因BHK-21细胞，在不同时间点通过实时定量PCR测定病毒拷贝数，以制作病毒复制曲线，将转基因细胞BHK-LV与非转基因BHK-21细胞的病毒复制曲线做比较，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在BHK细胞中对口蹄疫病毒复制的抑制作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述应用为在小鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测；本技术方案的具体操作方法为:用所述载体二注射到乳鼠颈后皮下，24h后再颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述应用为在转基因乳鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测；本技术方案的具体操作方法为:颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一在转基因乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。本发明具有以下有益效果:本发明利用水牛7SK、U6及牛U6启动子串联表达针对口蹄疫病毒基因的3个shRNA，构建了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体及慢病毒表达载体，用慢病毒载体生产抗口蹄疫的转基因细胞及嵌合体小鼠，并采用原核注射法，将非慢病毒多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体转入动物基因组中，使转基因动物对口蹄疫病毒有一定抵抗能力，建立了抗口蹄疫转基因动物。通过对抗口蹄疫转基因细胞和嵌合体小鼠的分析检测，确定细胞中有shRNA的表达，且转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显抑制作用，嵌合体乳鼠对口蹄疫病毒也具有明显的抵抗力。通过对抗口蹄疫转基因乳鼠的分析检测，确定转基因乳鼠对口蹄疫病毒有一定抵抗力，尤其是在LD50滴度上相比普通乳鼠，死亡率较低。本发明通过多个针对口蹄疫病毒不同保守区的shRNA在细胞和动物体内进行表达，既能有效减少口蹄疫病毒的免疫逃逸，又能达到广谱抑制口蹄疫病毒的效果。因此，应用本发明可望通过转基因家畜的制备，对现有普通品种进彳丁改良从而提闻易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。
:1、图1为pl8T_3shRNA质粒启动子酶切鉴定电泳图；2、图2为载体一酶切鉴定图；3、图 3 为载体一目的片段 bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP 测序图；4、图 4 为多个抗口蹄疫 shRNA 串联表达载体一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2_boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP 的结构图；5、图5为包装慢病毒载体转染后72h荧光细胞照片；6、图6为图5的常光照片；7、图7为纯化后慢病毒滴度测定时第八孔荧光照片；8、图8为图7的常光照片；9、图9为生产的转基因细胞BHK-LV的荧光照片；
10、图10为图9的常光照片；11、图11是应用茎-环法进行实时定量PCR检测3个抗口蹄疫shRNA在转基因细胞BHK-LV中的表达图；12、图12是FMDV在转基因细胞BHK-LV中的复制曲线；13、图13是经载体二慢病毒载体预处理后的乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力检测图；14、图14为F2代转基因小鼠与普通小鼠交配获得F3代后代PCR检测；15、图15为F2代转基因小鼠之间交配获得F3代后代PCR检测；16、图16是转基因乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力检测结果图；17、图17是接种口蹄疫病毒72h后，转基因小鼠各组织病毒含量测定结果图。
具体实施方式
:为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、该表达载体的构建方法以及该表达载体的应用作进一步的说明。一、实验材料和方法所用载体、细胞系和试剂来源:pMD18T载体(购自Takara公司)，pSicoR、pNRF和pVsvg载体由本实验室保存，Consl-Cons2-Cons3-LoxP序列合成由南京金斯瑞公司完成，水牛7SK、U6和牛U6启动子由发明人自行克隆。引物合成以及序列测定由上海生工有限公司完成，Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶、QRT-PCR相关试剂均购自Takara公司，小提质粒以及胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，去内毒小提质粒试剂盒购自OMEGA公司，细胞转染以及胞质内注射用外源基因胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，293T细胞系为申请人保存，BHK-21细胞系由中国农科院兰州兽医研究所提供，细胞、乳鼠用口蹄疫病毒由中国农科院兰州兽医研究所提供。所用基因组提取、总RNA提取、PCR扩增、反转录、酶切、胶回收、连接、转化、质粒提取、脂质体转染法、显微注射法、QRT-PCR等实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》(2000年，科学出版社)或相应的试剂盒说明书。转基因小鼠的生产由广州赛业公司代理。实施例1:抗口蹄疫shRNA设计和多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体及慢病毒载体的构建:根据NCBI上公布的各血清型口蹄疫的全基因组序列(AF189157、AY304994、AY593751和AF274010)，利用BLAST软件进行多重序列比对，在3B和3D基因中选择三段保守区域:(1)3B 区域中 5，-CCT GTC GCT TTG AAA GTG AAA GC-3，位于 4900_4922nt ； (2) 3D区域中 5，-GAG ATT CCA AGC TAC AGA TCA CTT TAC CTG CGT TGG GTG MC GCC GTG TGCGGTGAC GC-3，位于 6934-6992nt ； (3) 3D 区域中 5，-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTTGAG CC-3，位于6892-6917nt。三段根据口蹄疫病毒基因组中3B和3D保守区域设计的shRNA的双链DNA序列如序列表1-3所示，其中Consl为序列1，Cons2为序列2，Cons3为序列3 ；化学合成3 个 shRNA 串联的片段 Consl-Cons2_Cons3,其中 Consl-Cons2_Cons3 中在Consl的5’端设有XbaI\SacI双酶切位点，在Consl和Cons2之间设有Clal/Xhol双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII\MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP\NotI双酶切位点，该片段包含酶切位点的完整序列为EcoRl-Xbal-Sacl-Consl-Cla1-Xho1-Cons2-Bgl I 1-Mlu1-Cons3-LoxP-Not 1-HindI II ;经 EcoRI/Hindl 11 双酶切，连入 pMD_18T 载体构建成P18T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP，酶切体系如表I所示，T4连接体系如表5所示:。表I EcoRI/Hindlll 酶切体系`(IX)
权利要求
1.一种多个抗口蹄疫ShRNA串联表达载体,其特征在于:所述表达载体为载体一或载体二，其中载体一为 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ;或载体二为 LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
2.根据权利要求1所述的一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其特征在于:多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体中Consl如序列I所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。
3.权利要求1或2所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，包括下述步骤: (1)、根据GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守区，化学合成3个shRNA串联的 Consl-Cons2-Cons3 片段，连入 pMD_18T 载体，得到 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 载体；其中Consl-Cons2-Cons3中在Consl的5’端设有XbaI\SacI双酶切位点，在Consl和Cons2之间设有Clal/Xhol双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII\MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP\NotI双酶切位点； (2)、以水牛基因组为模板，以SEQN0.4/SEQ N0.5为引物扩增出水牛7SK的启动子bu7SK ;以水牛基因组为模板，以SEQ N0.6/SEQ N0.7为引物扩增出水牛U6的启动子buU6 ；以牛基因组为模板，以SEQ N0.8/SEQ N0.9为引物扩增出牛U6的启动子boU6 ； (3)、对步骤⑵中得到的启动子片段和步骤⑴得到的载体分别进行双酶切后连接，依次将启动子bu7SK、启动子buU6和启动子boU6连入步骤(I)的pl8T-Consl-Cons2-Cons3_LoxP 载体中，得到载体 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6_Cons3-LoxP ；(4)、用Xbal/Notl 双酶切载体 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到 Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP-NotI ；以慢病毒载体质粒 pSicoR 为载体骨架，用Xbal/Notl双酶切载体骨架后，用T4连接酶将Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI连接入Xbal/Notl双酶切后的pSicoR质粒中，得到多个抗口蹄疫shPRNA 串联表达载体一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ； (5)、将载体一与慢病毒包装质粒pNRF和pVsvg在293T细胞中共转染，得到载体二LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP0
4.根据权利要求3所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)具体方法如下: (a)、首先用内切酶Xbal/SacI 将 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切开，将 bu7SK 启动子用 T4 连接酶连接至 Consl 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP ； (b)、其次用内切酶Clal/Xhol 将 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切开，将 buU6启动子用 T4 连接酶连接至 Cons2 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3-LoxP ; (c)、最后用内切酶Mlul/Bglll 将 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3-LoxP 切开，将boU6启动子用T4连接酶连接至Cons3的5’端，得到pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2_boU6-Cons3-LoxP。
5.由权利要求1或2所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体在检测由该载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制方面的应用或者在构建转基因小鼠方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测步骤为:用载体二转染BHK-21细胞获得转基因细胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分别感染转基因细胞BHK-LV和非转基因BHK-21细胞，在不同时间点通过实时定量PCR测定病毒拷贝数，以制作病毒复制曲线，将转基因细胞BHK-LV与非转基因BHK-21细胞的病毒复制曲线做比较，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在BHK细胞中对口蹄疫病毒复制的抑制作用。
7.根据权利要求5所述的应用，其中，所述应用为在小鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测。
8.根据权利要求7所述的检测，其特征在于:用所述载体二注射到乳鼠颈后皮下，24h后再颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。
9.根据权利要求5所述检测方法，其中，所述应用为在转基因乳鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测。
10.根据权利要求9所述的检测，其特征在于:颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一在转基因乳鼠中对口蹄疫病 毒抵抗作用。
全文摘要
本发明一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用，属于基因工程、病毒学领域。本发明构建了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，并利用慢病毒介导方法将该载体转入BHK-21细胞中获得对口蹄疫病毒复制有抑制作用的转基因细胞，后将该慢病毒载体注入动物皮下，获得抗口蹄疫嵌合体动物。此外，利用多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体制备出抗口蹄疫转基因小鼠，对O型口蹄疫病毒具有一定抗性，在5LD50病毒滴度下乳鼠的存活率获得明显提高。因此，应用本发明可望通过抗口蹄疫转基因家畜的制备，对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。
文档编号C12Q1/68GK103184235SQ20131008910
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者石德顺, 张晓溪, 崔奎青, 刘庆友, 李湘萍 申请人:广西大学