专利名称：一种识别hiv-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于单链抗体技术领域，尤其涉及一种识别Hiv-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法。
背景技术：
bl2单抗是第一个被证明具有广谱中和活性的单抗，它的Fab片段来源于噬菌体展不文库(Burton DR, Barbas CF, Persson MA, et al.A large array of human monoclonalantibodies to type lhuman immunodeficiency virus form combinatorial librariesof asymptomatic seropositive individuals.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 (22):10134-10137.)，为人源化的单抗，其识别表位位于HIV_lgpl20上，与⑶4受体分子结合部位部分重叠，为高度保守的构象依赖型的表位。bl2的晶体结构显示，它可以通过伸出的较长的⑶RH3环结合gpl20的⑶4识别位点，阻止HIV-1与靶细胞上的受体结合，表现出病毒中和作用，从而抑制HIV-1的感染。bl2抗体可以中和约75%的B亚型的病毒分离株，是目前已知的在体内和体外均能特异性结合gpl20保守区域的广谱中和性抗体。与完整抗体相比，单链抗体(scFv)保留了亲本抗体的全部抗原结合特异性，具有分子量小、免疫原性低、组织穿透性好、易于与靶部位结合等优点。但是由于scFv是将抗体轻链和重链可变区人为拼接获得的重组蛋白，在高效的原核表达系统中往往以不溶性的包涵体形式存在。需要在变性剂存在条件下溶解、纯化，然后经复性才能得到可溶性的具有抗原结合能力的单链抗体蛋白；而经过变性、复性过程获得的单链抗体一般产量较低，活性也会受到影响。已有文献报道(Klein JS, Gnanapragasam PN, Galimidi RP, etal.Examination of the contributions of size and avidity to the neutralizationmechanisms of the ant1-HIV antibodies bl2 and 4E10.Proc Natl Acad Sci USA,2009，106(18):738 5-7390)中提及的bl2scFv也是从包涵体中经溶解、纯化和复性获得的。scFv的可溶性和抗体可变区本身的序列、重链和轻链的拼接方式、表达条件等诸多因素相关。
发明内容
针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法。本发明实施例是这样实现的，一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤:根据大肠杆菌密码子偏爱性将氨基酸序列翻译、优化成基因序列；依据bl2抗体轻链及重链基因序列设计并合成引物；分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段；用重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列；
将ScFv基因序列和pET28a分别用NcoI和XhoI双酶切，连接电泳回收片段，获得表达质粒；将重组质粒pET28-bl2-scFv转化表达菌株BL21，在对数生长晚期加诱导剂，室温诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮；用超声破碎仪在冰浴条件下超声破碎收集菌体，分别收集上清和沉淀，10%SDS-PAGE分析蛋白表达及分布情况；取固化N1-NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM-300mM咪唑洗脱并收集结合蛋白。具体操作步骤，首先依据bl2抗体轻链及重链基因序列设计。然后合成引物，分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段，在轻链上游引物Y端引入NcoI酶切位点，通过G4SLight-R和G4SH-F弓丨物在轻链和重链之间弓I入三次重复的GGGGS间隔序列，在重链下游引物5'端引入XhoI酶切位点，最后通过重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列。引物的序列如下:轻链上游引物Ncobl2L-F: TTGTCCATGGAGATCGTGCTGACCCAATC,下游引物G4SLight_R:
GCTCCCGCCACCTCCAGAGCCTCCGCCACCAGATGGTGCGGCCAC ；重链上游引物G4SH-F:GGAGGTGGCGGGAGCGGCGGTGGAGGGTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAG，下游引物 XhoH-R: TTGTCTCGAGAGAGGCGCTGCTCACGATCAC。进一步，PCR产物进行NcoI和XhoI双酶切，回收目的基因片段就得到了 bl2的scFv基因，其线性结构表示为:scFv-VL-(G4S) 3-VH。进一步，将pET28a用NcoI和XhoI双酶切，电泳回收大片段。scFv基因片段与其在T4DNA连接酶的作用下16°C进行过夜连接，然后转化，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定和测序。进一步，将重组质粒pET28-bl2-scFv 转化表达菌株 BL21 (DE3)，37°C、250r/min 过夜振荡培养，用过夜菌1: 50转接入LB培养基，37°C 250r/min培养至OD6tltl = 0.6 1.0，大约需要2.5h，留取部分菌液做未诱导对照，其余加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,室温诱导4小时。诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮。进一步，用超声破碎仪在冰浴条件下超声破碎收集菌体lOmin，超声功率为30W，超声间隔时间为10s，裂解的菌液4°C 12000rpm/min离心15min，分别收集上清和沉淀，10%SDS-PAGE分析蛋白表达及分布情况。进一步，取Iml固化N1-NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用50mM咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM-300mM咪唑洗脱并收集结
合蛋白。进一步,结合缓冲液为20mmol/L磷酸钠,500mmol/L氯化钠，pH7.8。进一步，洗漆缓冲液为20mmol/L磷酸钠,500mmol/L氯化钠，pH6.0。本发明采用化学合成的方法获得bl2抗体重链和轻链的可变区，用重叠PCR方法拼接得到scFv基因，利用原核表达系统，在室温和IPTG终浓度为0.5mM的条件下，诱导表达的bl2-SCFv大约有70%以可溶性蛋白的形式存在，用镍柱一步纯化便可获得高纯度的可溶性scFv，从IL培养液中能获得约2mg纯化的可溶性蛋白。降低诱导温度与IPTG的浓度，延长表达时间，可能有助于进一步增加可溶性蛋白的产量。经Elisa、免疫荧光和流式细胞术检测，纯化的蛋白与分泌表达和细胞膜表面的gpl20都具有良好的结合活性。在该单链抗体的设计中，没有在抗体重链和轻链可变区引入氨基酸的突变，但是为这些氨基酸编码的核苷酸序列和拼接的方式是自主设计的，这种基因的组合方式和我们采用的表达条件可能是实现bl2-SCFv可溶性表达的原因。本发明获得的bl2单链抗体可溶性好，表达量尚佳，纯化过程简单，抗原结合能力好。用基因工程的方法在体外大量制备该抗体，可用于艾滋病的被动免疫防治；在基于包膜蛋白的HIV-1重组疫苗的设计中，也可用于bl2抗原表位的检测，在HIV-1的被动免疫治疗和免疫原检测中具有一定的应用前景。
图1为本发明提供的单链抗体bl2_SCFv的纯化图;Μ.蛋白分子量标准；1.纯化前的大肠杆菌细胞裂解液中的可溶性蛋白；2.纯化蛋白过程中未挂柱的蛋白；3-4.低浓度咪唑洗脱的非特异结合的蛋白；5-6.高浓度咪唑洗脱获得的纯化蛋白；图2为Elisa检测单链抗体bl2_SCFv与HIV-1 gpl20抗原结合的活性图；图3为免疫荧光和流式细胞术检测单链抗体bl2_SCFv与细胞膜表面表达的HIV-1gpl20抗原结合的活性图；A.免疫荧光检测单链抗体bl2-SCFv对细胞表面表达的gpl20的识别未表达gpl20的细胞不被bl2-SCFv识别；C.流式细胞术检测单链抗体bl2_SCFv对细胞表面表达的gpl20的特异性识别。黑色:未表达gpl20的细胞；红色:表达gpl20的细胞。
具体实施例方式为了使本发明的目 的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。(I)可溶性抗原的检测如附图2所示，用真核表达的gpl20蛋白包被酶标板，用一系列二倍比例倍比稀释的bl2-SCFv孵育，同时设立不加单链抗体的阴性对照。横坐标表示倍比稀释之后的蛋白浓度取对数lg2后的数值，纵坐标表示OD45tl的吸收值。结果表明，当bl2-SCFv的稀释度达到1/64，即蛋白浓度约为8 μ g/mL时，其OD45tl的数值仍大于阴性对照数值的2.1倍以上，可以认为其为阳性，表明bl2-SCFv与gpl20具有较强的结合活性。具体的实验条件[gpl20蛋白用包被缓冲液(0.05mol/L Na2CO3,0.05moI/LNaHCO3,pH9.6)稀释，96孔酶标板中每孔加入100 μ L溶解的gpl20蛋白溶液，4°C过夜包被。用TBST (0.1 % Tween的TBS)洗板3次，每次5分钟，每孔加入100 μ L含5%脱脂奶粉的TBST于37°C封闭2h。TBST洗板三次后，每孔加入100 μ L 二倍比例倍比稀释的含待检测的蛋白样品bl2-SCFv，从1/2，1/4，1/8直到1/128，总共7个浓度梯度，初始蛋白浓度为250 μ g/mL，每个稀释度做2个复孔，37°C孵育2小时，同时设立不加单链抗体的阴性对照。TBST洗板三次后，每孔加入IOOuLl: 1000稀释的抗His鼠单克隆抗体，37°C孵育1.5小时，TBST洗板3次后，加入IOOyLl: 2000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，37°C孵育1.5h。TBST洗板3次后,加TMB显色,显色5min后,加2mol/L H2SO4终止显色,450nm测定吸光值。]本实施例中我们米用了杆状病毒表达体系获得的昆虫细胞培养液中分泌表达的gpl20 抗原(Chen HY, Xu XD, Bishop A, et al.Reintroduction of the 2G12 epitope inan HIV-1 clade C gpl20.AIDS, 2005,19 (8):833-835.)。用 Elisa 方法，本抗体适用于真核表达系统获得的具有CD4结合活性的溶液中gpl20抗原的检测。(2)细胞表面抗原的检测如附图3所示，用bl2_SCFv与细胞膜表面表达了 HIV-1 gpl20的昆虫细胞孵育，后用抗His鼠单克隆抗体，再用FITC标记的山羊抗鼠IgG孵育。在荧光显微镜下可观察到，表达gpl20的细胞表面发绿色荧光，不表达gpl20的细胞没有荧光信号(图3A，B)。流式细胞仪检测结果显示，表达gpl20的细胞荧光强度明显高于不表达gpl20的对照细胞(图3C)，说明bl2-SCFv可以特异性地识别细胞膜表面的gpl20。具体实 验条件[离心收集细胞表面表达有gpl20的细胞，不表达gpl20的细胞做为阴性对照，用1: 50稀释的bl2-SCFv蛋白室温孵育I小时。PBS洗3次，加入IOOyLI: 200用PBS稀释的抗His鼠单克隆抗体，室温孵育lh。PBS洗3次，加入100 μ LI: 100用PBS稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG，室温孵育Ih。PBS洗3次，加入100 μ L4%多聚甲醛固定lOmin，后离心收集沉淀，沉淀用50 μ L PBS悬浮，在荧光显微镜下观察。 流式细胞术分析使用CyFlow Cube6型流式细胞仪，激发波长488nm，绿色荧光信号在FLl通道检测(发射波长530nm)，收集数据使用CyView 8.5软件。每个样品至少使用4X IO4个细胞收集数据,离线数据分析用FCS Express4软件。]本实施例中我们采用了杆状病毒表达体系获得的昆虫细胞表面表达的gpl20抗原(Chen HY,Xu XD,Bishop A,et al.Reintroduction of the 2G12epitope in an HIV-1clade C gpl20.AIDS，2005，19(8):833-835.)。用免疫荧光和流式细胞术方法，本抗体适用于真核表达系统获得的具有CD4结合活性的细胞表面gpl20抗原的检测，包括HIV-1病毒感染的组织和细胞的检测。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种识别Hiv-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤 根据大肠杆菌密码子偏爱性将氨基酸序列翻译、优化成基因序列； 依据bl2抗体轻链及重链基因序列设计并合成引物； 分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段； 用重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列； 将scFv基因序列和pET28a分别用NcoI和XhoI双酶切，连接电泳回收片段，获得表达质粒; 将重组质粒pET28-bl2-scFv转化表达菌株BL21，在对数生长晚期加诱导剂，室温诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮； 超声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，10% SDS-PAGE分析蛋白表达及分布情况；取固化Ni-NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM-300mM咪唑洗脱并收集结合蛋白。
2.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，依据bl2抗体轻链及重链基因序列设计并合成引物，轻链上游引物Ncobl2L-F TTGTCCATGGAGATCGTGCTGACCCAATC, 下游引物G4SLight-R:GCTCCCGCCACCTCCAGAGCCTCCGCCACCAGATGGTGCGGCCAC ； 重链上游引物G4SH-F GGAGGTGGCGGGAGCGGCGGTGGAGGGTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAG,下游引物 XhoH-R TTGTCTCGAGAGAGGCGCTGCTCACGATCAC。
3.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段，在轻链上游引物5'端引入NcoI酶切位点，通过G4SLight-R和G4SH-F引物在轻链和重链之间引入三次重复的GGGGS间隔序列，在重链下游引物Y端引入XhoI酶切位点，最后通过重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列，PCR产物进行NcoI和XhoI双酶切，回收目的基因片段就得到了 bl2的scFv基因，其线性结构表示为SCFv-VL-(G4S)3-VH。
4.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，将pET28a用NcoI和XhoI双酶切，电泳回收大片段。scFv基因片段与其在T4DNA连接酶的作用下16°C进行过夜连接，然后转化，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定和测序。
5.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，将重组质粒pET28-bl2-scFv转化表达菌株BL21 (DE3)，37°C、250r/min过夜振荡培养，用过夜菌I : 50转接入LB培养基，37 °C 250r/min培养至OD6tltl = O. 6 1.0，大约需要.2.5h，留取部分菌液做未诱导对照，其余加入IPTG至终浓度为O. 5mmol/L，室温诱导4小时，诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮。
6.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，用超声破碎仪在冰浴条件下超声破碎收集菌体lOmin，超声功率为30W，超声间隔时间为10s，裂解的菌液4°C 12000rpm/min离心15min，分别收集上清和沉淀，10 %SDS-PAGE分析蛋白表达及分布情况。
7.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，取Iml固化Ni-NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用50mM咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM-300mM咪唑洗脱并收集结合蛋白。
8.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，结合缓冲液为20mmol/L磷酸钠,500mmol/L氯化钠，pH7. 8。
9.如权利要求I所述的识别HIV-I受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，洗漆缓冲液为20mmol/L磷酸钠,500mmol/L氯化钠，pH6. O。
全文摘要
本发明公开了一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，采用化学合成的方法获得b12抗体重链和轻链的可变区，用重叠PCR方法拼接得到scFv基因，利用原核表达系统，在室温和IPTG终浓度为0.5mM的条件下，诱导表达的b12-scFv大约有70％以可溶性蛋白的形式存在，用镍柱一步纯化便可获得高纯度的可溶性scFv，从1L培养液中能获得约2mg纯化的可溶性蛋白。本发明获得的b12单链抗体可溶性好，表达量尚佳，纯化过程简单，抗原结合能力好。用基因工程的方法在体外大量制备该抗体，可用于艾滋病的被动免疫防治；在基于包膜蛋白的HIV-1重组疫苗的设计中，也可用于b12抗原表位的检测，在HIV-1的被动免疫治疗和免疫原检测中具有一定的应用前景。
文档编号C12N15/11GK103255138SQ201310088900
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者陈红英, 许晓东, 杨雄 申请人:西北农林科技大学