发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的制作方法

专利名称：发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及到一种发酵法制备ε -聚-L-赖氨酸的方法。
背景技术：
1977 年日本科学家 Shima 和 SaKai 在白色链霉菌(Streptomyces albulus 346)发酵液中首先发现ε -聚-L-赖氨酸(简称ε -PL)。ε -PL是赖氨酸位上羰基和e位氨基结合的产物，它带正电荷，阴离子物质可与其结合，没有固定的熔点，250°C以上开始软化分解；成品为淡黄色粉末、吸湿性强、略有苦味，溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂；热稳定性高，120°C加热IOmin仍具有抑菌活性，遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可因结合而使活性降低，与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用有增效作用。ε -PL是含有25 30个赖氨酸残基的阳离子聚合多肽，当聚合度低于十肽时，会丧失抑菌活性。分子量在3600 4300之间的ε-PL具有高抑菌活性。l、e-PL的功能及应用(I) ε -PL 的抑菌性ε -PL的抑菌机理可能是因为它是阳离子表面活性物质，它能破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，还能与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致细胞死亡。ε -PL对细菌、真菌、酵母的最低抑制浓度不同，原因可能是它们细胞表面结构不同。ε -PL 既可以抑制革兰氏阳性菌生长又可以抑制革兰氏阴性菌生长，如革兰氏阳性菌中枯草芽孢杆菌、耐热脂肪芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中大肠杆菌、产气节杆菌等引起食物中毒和腐败菌，ε-PL对其都有强烈的抑制作用。刘慧等研究表明:ε-PL对革兰氏阳性微球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌及酵母菌生长有明显抑菌效果，ε -PL与醋酸复合试剂对枯草芽孢杆菌有明显抑制作用。Shima等采用Escherichia coli K-12研究了 ε-PL的分子量与抑菌性的关系，结果表明超过9个ε -赖氨酸残基才可以抑制微生物的生长，而化学改性a氨基会降低抑菌活性。ε -PL是一种阳离子聚合物，等电点是9.0,因此，在碱性的情况下，抑菌活性和抗噬菌体的活性是最低的。对于Ε.coli,在pH值5.0 8.0的时候,最低抑制浓度是25g/mL 50g/mL,而在pH值8.0时的最低抑制浓度大于200g/mL。同样的,如果存在像偏磷酸这种阴离子聚合物，也会降低ε-PL的抑菌活性，其原因ε-PL损失了阳离子电荷。(2) ε -PL 的应用①ε-PL在食品中的应用ε -PL是一种天然防腐剂，而且还是人体必需氨基酸-赖氨酸的聚合物，主要是作为食品添加剂应用于食品保鲜上。Neda等对ε-PL进行了毒理学研究，经慢性和亚急性喂饲小鼠实验证明了 ε-PL没有毒性，甚至当ε-PL达到高剂量水平时也不会产生任何的不利效果或基因突变。此外，ε-PL对生殖系统、神经系统、免疫系统，以及胚胎的发育、后代的生长，甚至第二代的胚胎发育都不会产生毒性，因此是一种安全的天然防腐剂。
ε-PL作为一种新型食品防腐剂除了单独使用外，还可以与其他食品添加剂混合使用，如甘氨酸、醋、乙醇、硫胺素(VB)等，并且混合使用后可以在很大程度上提高防腐能力，还能对不同类型食品起到保鲜作用。例如当ε-PL和甘氨酸混合用于浓缩牛奶的保鲜防腐时，会产生明显的协同增效作用，大大提高了抑菌能力。由于这种协同作用使得食品中的防腐剂添加量得以减少。徐红华等通过饱和试验研究了 ε -PL和甘氨酸在牛奶中的保鲜作用，结果发现单独使用ε-PL和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使用效果。当采用420mg/Le_PL和质量分数2 %甘氨酸配合使用时，抑菌效果最佳，可以保存I ld，还发现ε -PL和其他天然抑菌剂配合使用，也有明显的协同增效作用。②ε-PL在医学方面的应用ε-PL含有阳离子，与带有阴离子物质间有很强的静电作用力，并且对生物膜有良好的穿透力，因此ε -PL可以作为某些药物载体，在医疗和制药方面得到广泛应用。Sospedra等用以ε-PL为主链的分支聚合蛋白搭载生物大分子治疗肝炎病毒，取得良好疗效。Diederich等研究了电脉冲对不同分子量ε -PL修饰细胞膜的破坏程度，发现细胞膜吸附高分子量ε-PL会降低其破坏I临界电压。另外，在基因治疗、在基因芯片的制造(核酸生物芯片、氣基酸芯片、蛋白质芯片等)和某些药物的包装物制作等方面均有重要用途。2、ε-PL国内外研究现状(I) ε -聚-L-赖氨酸产生菌的分离筛选20世纪70年代末，Shima等首次从白色链霉菌(Steptomyces albulus)的发酵液中发现ε-PL。藤井正弘等 发现诺尔斯氏链霉菌(Steptomyces noursei)也可产生PL。Sz0kdin等发现一种丝状的麦角真菌(Claviceps purpurea)能够积累一种类似PL、含有大量赖氨酸的化合物-麦角胺(clavicepamines)，其化学结构与S.albulus的产物不同。从20世纪90年代末至今，筛选ε-PL高产菌株一直是研究的热点。2002年，日本学者Nishikawa等找到了一种有效的筛选方法，通过在培养基中加入一种酸性染料POLY R-478，可以在ε-PL产生菌的菌落周围看到明显的颜色浓缩圈，因而可以进行大规模筛选，克服了盲目性。Nishikawa采用这种方法，对日本各地土壤样品进行了大规模的筛选，获得了许多可以产生ε-PL的菌株，发现大多数ε-PL产生菌集中在链霉菌科(Streptomycetaceae)的几个不同的属和麦角真菌(ergot fungi)这两类微生物上，且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同(n = 10 36，10 24，8 9)，并且发现这些菌株大部分属于链霉菌。但由于P0LYR-478现已停产，菌株筛选又变得较困难。中国学者王晓丹等、张超等、朱宏阳等采用碱性染料亚甲基蓝，先后分离到了产ε-PL的菌株，但由于亚甲蓝对微生物毒性较高，而且出菌率较低，分离到的菌株均为放线菌，菌种单一，ε -PL产量较低。因此探索筛选培养基指示剂，研究建立高通量、高分辨、高灵敏e-PL产生菌筛选模型是目前ε-PL研究的难点之一。(2) ε -聚-L-赖氨酸发酵工艺研究现状采用Shima等分离的白色链霉菌变种，聚赖氮酸发酵产量为0.5g.T10 ε -PL产生菌株的摇瓶批式发酵产量较低，均在0.2 1.0g.L'岩田敏治等以Β21021菌株为研究对象，在3L发酵罐中采用氨水调控pH，补加葡萄糖和硫酸铵，发酵培养72h时，ε -PL产率为16.2g.L—1，而发酵培养168h时产率为31g.L—1，产率有了较大幅度的提高。Hiraki等以野生白色链霉菌S.albulus346为出发菌株，经诱变获得了抗S- (2_氨乙基)-L-半胱氨酸与甘氨酸的突变株并且90%为高产菌株，其中I株在试管发酵最高产量为2.1lmg.πιΓ1，比野生菌株高了 10倍，这株菌对天冬酰胺激酶有很高的特异性。在3L发酵罐中，120h产率Kahar等报道pH与葡萄糖对ε-PL发酵产量有很大的影响。发酵分两个阶段，PH高于5.0有利于菌体生长，而pH低于4.0对产ε-PL是关键。通过发酵控制，ε -PL的产量由起初的g.Γ1增长到48.3g.L'此外，由于白色链霉菌在发酵过程中形成菌丝球，高搅拌转速易将菌丝球剪切成丝状，使胞内物质渗入到发酵液中，影响ε -PL的提取。Kahar等采用气升式发酵罐，在动力消耗为0.3kW*m_3下，ε-PL产率为30g.L—1，而在搅拌罐中获得相同产量的ε-PL则需要消耗SkW.m_3，由此表明，采用气升式发酵罐生产ε -PL可以更有效地降低生产成本。目前在国内关于生物合成ε-PL的研究刚刚起步，姜俊云等采用5L自控式发酵罐研究了发酵过程中搅拌转速和PH对菌体形态以及ε -PL产量的影响，发现搅拌转速350r/min和控制pH时可获得最大的ε-PL产量2.958.!^，菌体量9.338.!^。朱宏阳等从土壤中分离到I株产ε-PL菌株PL6-3，其发酵产量为Ojlg.!/1。目前ε-PL发酵工艺为液体深层发酵，虽然单批次发酵可以达到较高产量，但重复性较差。其根本问题在于溶氧较低，达到高产需要较高的溶氧，合适的转速，但这两者本身是一对矛盾，只能应用多尺度发酵原理与过程控制思想，优化ε -PL发酵参数，提高发酵水平。(3) ε -聚-L-赖氨酸分离提取工艺研究开发现状ε -PL是一种胞外多肽类物质，提取工艺与胞外酶或蛋白质的提取基本相似，主要方法有盐析法、有机溶剂萃取法和离子交换法。通常情况下根据被提取物质的理化和生物学特性选择两种方法结合使用，ε -PL采用离子交换和有机溶剂萃取的方法。ε -PL在中性环 境中为阳离子高聚物，因此人们通常采用pH为8.5的AmberliteIRC-50(H+型)阳离子交换树脂，通过阳离子交换层析方法从发酵液中分离提取ε-PL，发酵液先过滤除去菌体，滤液进Amberlite IRC-50层析柱交换吸附，然后依次用0.2mol.Γ1的乙酸和水洗涤,再用0.1mol.Γ1的盐酸洗脱后，洗脱液用6mol.Γ1的NaOH中和，然后用活性炭脱色后，进行浓缩至小体积。最后使用乙醇和乙醚(2:1)混合液进行ε -PL沉淀。从方法论的角度看此法简便快捷，不足之处为ε-PL纯度不够77.9%。周俊等采用此法得到ε -PL粗品后，Sephadex G_25凝胶过滤ε -PL粗品用重蒸水配成4g.L—1溶液，过滤(0.22 μ m微滤膜)后，取滤液上样。周俊的方法优点是提取的ε -PL纯度较高88.3%。综合这两种分离提取方法，筛选更加有效的阳离子交换树脂，研究ε -PL分离过程，优化分离参数，减少步骤，整体提闻提取效率。综上所述，高产菌株的获得及高效、简单提取工艺的建立成为制约我国e-PLI业化生产的两大主要因素，在此背景下，本发明以自行诱变筛选获得的白色链霉菌为发酵菌株，进行了发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸工艺的开发。

发明内容
本发明的目的是提出一种发酵法制备ε -聚-L-赖氨酸新工艺，为解决缺少高产菌株的问题，本发明提供了一种白色链霉菌CQ0723。该菌株是以白色链霉菌为出发菌，通过微波诱变和激光诱变结合的方法而获得，目前已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为:CGMCCN0.6409。保藏日期从2012年08年07日起保存三十年。该菌株分类命名:白色链霉菌(Streptomyces albus), CQ0723。发酵法制备ε _聚-L-赖氨酸的方法，主要通过如下技术方案实现:(I)菌株发酵培养以自行诱变筛选获得取培养Id后的二级种子液1.5L接入装有30L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.5，30°C，250r/min,通气量1200L/h，培养3 5d。补料分批发酵过程中，将无菌的葡萄糖和硫酸铵混合液接至酸泵上，氨水接至碱泵上的方式来自动控制发酵液pH。在发酵的前期，搅拌转速为200r/min，发酵后期搅拌转速为300r/min，通气量1200L/h，将pH控制在4.0左右，培养8 IOd0(2)发酵液预处理发酵结束后，发酵液离心取上清，获得e_聚-L-赖氨酸粗提液。粗提液内加入lmol/L的盐酸，调节pH值至3.0，加热至90°C后冷却至室温，离心去沉淀，可有效去除发酵液内的杂蛋白，获得经预处理后的e-聚-L-赖氨酸溶液。(3)离子交换树脂分离用lmol/L的NaOH溶液调节经预处理获得e_聚-L-赖氨酸溶液pH至8.0，将调节后的e-聚-L-赖氨酸溶液过HD-2型离子交换树脂柱，收集洗脱液备用。(4)活性炭脱色洗脱液内加入5%的活性炭，加热至60°C，搅拌30min后冷却至室温，过滤获得e-聚-L-赖氨酸脱色液。(5)超滤选用截留分子量为6000Da的聚砜超滤膜对e_聚_L_赖氨酸脱色液进行超滤浓缩。(6)喷雾干燥超滤获得的ε -聚-L-赖氨酸超滤液浓缩至原体积的1/10后，进行喷雾干燥处理获得ε -聚-L-赖氨酸产品。四、本发明的优点本发明以自行诱变筛选获得高产ε-聚-L-赖氨酸白色链霉菌为发酵菌株，菌株发酵获得粗提液，后采用离子交换层析、脱色、超滤、乙醇沉淀等技术制备获得高质量ε -聚-L-赖氨酸产品。本发明主要优点如下:(I)采用微波诱变和激光诱变结合的方法，筛选获得高产菌株，发酵单位达55g/L以上。(2)发酵中采用了补料分批发酵法，通过pH的调节，有效提高了 e-聚-L-赖氨酸的发酵浓度。(3)采用离子交换层析、超滤相结合技术制备获得了 98%以上的高纯度产品，产品提取率达到75%以上。(4)采用的分离纯化方法具有能耗低， 设备结构简洁紧凑、操作方便、适合实现自动化生产的特点。五

图1:微生物发酵法生产e-聚-L-赖氨酸技术工艺流程路线图
六具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。实施例一(I)菌体保藏种子液与40%的甘油以1:1体积比混合，零下80°C冰箱内冷冻保藏。(2)培养基平板和斜面培养基(％ ):葡萄糖1.0,蛋白胨0.2,酵母抽提物0.1, Agarl.5。用2molLNa0H 溶液调 pH 至 7.5，120。。，灭菌 20min。种子培养基):葡萄糖5.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，FeSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，灭菌 20min。发酵培养基(％):葡萄糖 3.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 2，MgSO4.7Η200.05，KH2PO40.20，K2HPO40.12，FeSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，灭菌 20min。补料培养基):葡萄糖80，(NH4) 2S048.0，二者分别于120°C灭菌20min后，无菌条件下混合备用。(3)种子培养一级种子液培养:取I环斜面孢子种接于装有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min条件下摇床培养2d。二级种子液培养:将培养2d后的一级种子液按5%的接种量接入装有25L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.8，于30°C，200r/min,通气量1000L/h,培养Id。(4) 50L发酵罐内菌株发酵培养取培养Id后的二级种子液1.5L接入装有30L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.5，30°C，250r/min，通气量1200L/h，培养4d。在补料分批发酵过程中，将无菌的葡萄糖和硫酸铵混合液接至酸泵上，氨水接至碱泵上的方式来自动控制发酵液pH。在发酵的前期，搅拌转速为200r/min，让pH自然下降，发酵后期搅拌转速为300r/min，通气量1200L/h，将pH控制在4.0左右，培养10d，菌株发酵浓度为55.4g/L。(5)预处理发酵结束后，发酵液离心取上清，获得e_聚-L-赖氨酸粗提液。粗提液内加入lmol/L的盐酸，调节pH值至3.0，加热至90°C后冷却至室温，离心去沉淀，可有效去除发酵液内的杂蛋白，获得经预处理后的e-聚-L-赖氨酸溶液。(6)离子交换树脂分离用lmol/L的NaOH溶液调节经预处理获得e_聚-L-赖氨酸溶液pH至8.0，将调节后的ε -聚-L-赖氨酸溶液以4mL/min的速度上样至HD-2型离子交换树脂柱，保持柱内pH值为8.0至树脂吸附饱和，后用纯水对饱和树脂进行洗涤至洗涤液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液为洗涤液，洗脱速度为2.5mL/mi n,收集洗脱液备用。(7)活性炭脱色
洗脱液内加入5%的活性炭，加热至60°C，搅拌30min后冷却至室温，过滤获得e-聚-L-赖氨酸脱色液。(8)超滤选用截留分子量为6000Da的聚砜超滤膜对e_聚_L_赖氨酸脱色液进行超滤浓缩，将e-聚-L-赖氨酸脱色液稀释一半后，导入膜压滤装置进行循环浓缩超滤，收集超滤液。超滤操作条件为:操作压力0.025MPa，操作温度25°C。(9)喷雾干燥超滤获得的e-聚-L-赖氨酸超滤液浓缩至原体积的1/10后，进行喷雾干燥处理获得ε -聚-L-赖氨酸产品，产品纯度可达到98.2%，收率可达到75.1%。实施例二(I)菌体保藏种子液与40%的甘油以1:1体积比混合，零下80°C冰箱内冷冻保藏。(2)培养基平板和斜面培养基):葡萄糖1.5，蛋白胨0.3，酵母抽提物0.2，Agarl.5。用2molLNa0H 溶液调 pH 至 7.5，120。。，灭菌 20min。种子培养基):葡萄糖6.0，酵母膏 0.6，(NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，FeSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，灭菌 20min。发酵培养基(％):葡萄糖4.0，酵母膏 0.6，(NH4)2SO4L 2，MgSO4.7Η200.05，KH2PO40.20，K2HPO40.12，FeSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，灭菌 20min。补料培养基):葡萄糖90，(NH4) 2S048.0，二者分别于120°C灭菌20min后，无菌条件下混合备用。(3)种子培养一级种子液培养:取I环斜面孢子种接于装有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min条件下摇床培养2d。二级种子液培养:将培养2d后的一级种子液按5%的接种量接入装有25L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.8，于30°C，200r/min,通气量1000L/h,培养Id。(4) 50L发酵罐内菌株发酵培养取培养Id后的二级种子液1.0L接入装有20L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.5，30°C，250r/min，通气量1200L/h，培养4d。在补料分批发酵过程中，将无菌的葡萄糖和硫酸铵混合液接至酸泵上，氨水接至碱泵上的方式来自动控制发酵液pH。在发酵的前期，搅拌转速为200r/min，让pH自然下降，发酵后期搅拌转速为300r/min，通气量1200L/h，将pH控制在4.0左右，培养8d，菌株发酵浓度为55.2g/L。(5)预处理发酵结束后，发酵液离心取上清，获得e_聚-L-赖氨酸粗提液。粗提液内加入lmol/L的盐酸，调节pH值至4.0，加热至90°C后冷却至室温，离心去沉淀，可有效去除发酵液内的杂蛋白，获得经预处理后的e-聚-L-赖氨酸溶液。(6)离子交换树脂分离 用lmol/L的NaOH溶液调节经预处理获得ε -聚-L-赖氨酸溶液pH至8.0，将调节后的ε -聚-L-赖氨酸溶液以4mL/min的速度上样至HD-2型离子交换树脂柱，保持柱内pH值为8.0至树脂吸附饱和，后用纯水对饱和树脂进行洗涤至洗涤液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液为洗涤液，洗脱速度为2.5mL/min,收集洗脱液备用。(7)活性炭脱色洗脱液内加入6%的活性炭，加热至60°C，搅拌30min后冷却至室温，过滤获得ε -聚-L-赖氨酸脱色液。(8)超滤选用截留分子量为6000Da的聚砜超滤膜对ε -聚-L-赖氨酸脱色液进行超滤浓缩，将ε -聚-L-赖氨酸脱色液稀释一半后，导入膜压滤装置进行循环浓缩超滤，收集超滤液。超滤操作条件为:操作压力0.025MPa，操作温度25°C。(9)喷雾干燥超滤获得的ε -聚-L-赖氨酸超滤液浓缩至原体积的1/10后，进行喷雾干燥处理获得ε -聚-L-赖氨酸产品，产品纯度可达到98.5%，收率可达到75.0%。实施例三(I)菌体保藏种子液与40%的甘油以1:1体积比混合，零下80°C冰箱内冷冻保藏。(2)培养基平板和斜面培养基(％):葡萄糖2.0，蛋白胨0.5，酵母抽提物0.3，Agarl.5。用2molLNa0H 溶液调 pH 至 7.5，120。。，灭菌 20min。种子培养基(%):葡萄糖 8.0，酵母膏 1.0, (NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，FeSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，灭菌 20min。发酵培养基(％):葡萄糖 5.0，酵母膏 1.0，(NH4)2SO4LO, MgSO4.7H200.05,KH2PO40.20，K2HPO40.12，FeSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，灭菌 20min。补料培养基(% ):葡萄糖100，(NH4) 2S048.0，二者分别于120°C灭菌20min后，无菌条件下混合备用。(3)种子培养—级种子液培养:取I环斜面孢子种接于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min条件下摇床培养2d。二级种子液培养:将培养2d后的一级种子液按5%的接种量接入装有25L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.8，于30°C，200r/min,通气量1000L/h,培养Id。(4) 50L发酵罐内菌株发酵培养取培养Id后的二级种子液1.25L接入装有25L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.5，30°C，250r/min,通气量1200L/h，培养4d。在补料分批发酵过程中，将无菌的葡萄糖和硫酸铵混合液接至酸泵上，氨水接至碱泵上的方式来自动控制发酵液pH。在发酵的前期，搅拌转速为200r/min，让pH自然下降，发酵后期搅拌转速为300r/min，通气量1200L/h，将PH控制在4.0左右，培养9d，菌株发酵浓度为55.8g/L。(5)预处理发酵结束后，发酵液离心取上清，获得ε-聚-L-赖氨酸粗提液。粗提液内加入lmol/L的盐酸，调节pH值至3.5，加热至90°C后冷却至室温，离心去沉淀，可有效去除发酵液内的杂蛋白，获得经预处理后的e-聚-L-赖氨酸溶液。
(6)离子交换树脂分离用lmol/L的NaOH溶液调节经预处理获得ε -聚-L-赖氨酸溶液pH至8.0，将调节后的ε -聚-L-赖氨酸溶液以4mL/min的速度上样至D113型离子交换树脂柱，保持柱内pH值为8.0至树脂吸附饱和，后用纯水对饱和树脂进行洗涤至洗涤液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液为洗涤液，洗脱速度为2.5mL/min,收集洗脱液备用。(7)活性炭脱色洗脱液内加入10%的活性炭，加热至60°C，搅拌30min后冷却至室温，过滤获得ε -聚-L-赖氨酸脱色液。(8)超滤选用截留分子量为4000Da的聚砜超滤膜对ε _聚_L_赖氨酸脱色液进行超滤浓缩，将ε -聚-L-赖氨酸脱色液稀释一半后，导入膜压滤装置进行循环浓缩超滤，收集超滤液。超滤操作条件为:操作压力0.025MPa，操作温度25°C。(9)喷雾干燥超滤获得的ε -聚-L-赖氨酸超滤液浓缩至原体积的1/10后，进行喷雾干燥处理获得ε -聚-L-赖氨酸产品，产品纯度可达到98.5%，收率可达到75.4%。实施例四(I)菌体保藏种子液与40%的甘油以1:1体积比混合，零下80°C冰箱内冷冻保藏。

(2)培养基平板和斜面培养基):葡萄糖1.0，蛋白胨0.2，酵母抽提物0.1，Agarl.5。用2molLNa0H 溶液调 pH 至 7.5，120。。，灭菌 20min。种子培养基):葡萄糖5.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，FeSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，灭菌 20min。发酵培养基(％):葡萄糖 3.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 2，MgSO4.7Η200.05，KH2PO40.20，K2HPO40.12，FeSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，灭菌 20min。补料培养基(％):葡萄糖80，(见14)23048.0，二者分别于1201:灭菌201^11后，无菌条件下混合备用。(3)种子培养一级种子液培养:取I环斜面孢子种接于装有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min条件下摇床培养2d。二级种子液培养:将培养2d后的一级种子液按5%的接种量接入装有25L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.8，于30°C，200r/min,通气量1000L/h,培养Id。(4) 50L发酵罐内菌株发酵培养取培养Id后的二级种子液1.5L接入装有有30L培养基的50L发酵罐中，初始pH为6.5，30°C，250r/min,通气量1000L/h，培养4d。在补料分批发酵过程中，将无菌的葡萄糖和硫酸铵混合液接至酸泵上，氨水接至碱泵上的方式来自动控制发酵液pH。在发酵的前期，搅拌转速为200r/min，让pH自然下降，发酵后期搅拌转速为300r/min，通气量1000L/h，将PH控制在4.0左右，培养9d，菌株发酵浓度为55.lg/L。(5)预处理
发酵结束后，发酵液离心取上清，获得ε-聚-L-赖氨酸粗提液。粗提液内加入lmol/L的盐酸，调节pH值至4.0，加热至90°C后冷却至室温，离心去沉淀，可有效去除发酵液内的杂蛋白，获得经预处理后的e-聚-L-赖氨酸溶液。(6)离子交换树脂分离用lmol/L的NaOH溶液调节经预处理获得ε -聚-L-赖氨酸溶液pH至8.0，将调节后的ε -聚-L-赖氨酸溶液以4mL/min的速度上样至HD-2型离子交换树脂柱，保持柱内pH值为8.0至树脂吸附饱和，后用纯水对饱和树脂进行洗涤至洗涤液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液为洗涤液，洗脱速度为2.5mL/min,收集洗脱液备用。(7)活性炭脱色洗脱液内加入5%的活性炭，加热至60°C，搅拌30min后冷却至室温，过滤获得ε -聚-L-赖氨酸脱色液。(8)超滤选用截留分子量为6000Da的聚砜超滤膜对ε _聚-L-赖氨酸脱色液进行超滤浓缩，将ε -聚-L-赖氨酸脱色液稀释一半后，导入膜压滤装置进行循环浓缩超滤，收集超滤液。超滤操作条件为:操作压力0.025MPa，操作温度25°C。(9)喷雾干燥超滤获得的ε -聚-L-赖氨酸超滤液浓缩至原体积的1/10后，进行喷雾干燥处理获得ε -聚-L-赖氨酸产品， 产品纯度可达到98.6%，收率可达到75.2%。
权利要求
1.一种发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征是发酵菌株为白色链霉菌(Streptomyces albus) CQ0723，其菌种保藏编号为 CGMCC N0.6409。
2.一种发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于菌株CQ0723发酵获得发酵液，后预处理、离子交换层析、脱色、超滤、乙醇沉淀等技术制备获得高质量e-聚-L-赖氨酸成品。
3.如权利要求2所述的一种发酵法制备聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于菌株发酵相关培养基如下: 平板和斜面培养基):葡萄糖1.0-2.0 (g/L)，蛋白胨0.2-0.5 (g/L)，酵母抽提物0.1-0.3 (g/L)，Agarl.5 (g/L)。用 2molL NaOH 溶液调 pH 至 7.5，120。。，灭菌 20min。
种子培养基):葡萄糖 5.0-8.0 (g/L)，酵母膏 0.5-1.0 (g/L)，(NH4)2SO4L 00 (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)，K2HPO40.8 (g/L)，MgSO4.7Η200.02 (g/L)，FeSO4.7Η200.02 (g/L)，pH 值 6.8，120°C，灭菌 20min。。发酵培养基(％):葡萄糖 3.0-5.0 (g/L)，酵母膏 0.5-1.0 (g/L)，(NH4) 2S041.0-1.2 (g/L)，MgSO4.7H200.05 (g/L)，KH2PO40.20 (g/L)，K2HPO40.12 (g/L)，FeSO4.7H200.003 (g/L)，ZnSO4.7H200.008 (g/L)，pH6.5，120。。，灭菌 20min。
补料培养基(% ):葡萄糖 80-100 (g/L)，(NH4) 2S048.0-10.0 (g/L)，二者分别于 120。。灭菌20min后,无菌条件下混合备用。
4.如权利要求2所述的一种发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于发酵培养工艺为:装液量为40% 60% (L/L)，接种体积为2% 5% (L/L)，空气通气量1000 1200L/h，初始pH为6.5，在发酵的前期，搅拌转速为200r/min，发酵后期搅拌转速为300r/min，通气量1200L/h，将pH控制在4.0左右，培养8 IOd0
5.如权利要求2所述的一种发酵法制备聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于预处理过程中粗提液内加入lmol/L的盐酸，调节pH值至3.0-4.0，加热至85_90°C后冷却至室温，离心去沉淀。
6.如权利要求2所述的一种发酵法制备聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于离子交换层析过程中使用的离子交换树脂可以为HD-2，HZD-5、D113。
7.如权利要求2所述的一种发酵法制备聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于活性炭脱色过程中，洗脱液中活性炭加入的比列为5-10% (Μ/V)。
8.如权利要求2所述的一种发酵法制备聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于超滤过程中使用的超滤膜为聚砜超滤膜，截留分子量为4000-6000Da。
9.如权利要求2所述的一种发酵法制备聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于采用喷雾干燥最终制备获得的ε -聚-L-赖氨酸产品，产品纯度可达到98%以上，收率可达到75%以上。
全文摘要
本发明公开了一种发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的方法，属于生物技术领域。本方法的主要步骤为菌株发酵获得粗提液，后采用离子交换层析、脱色、超滤、乙醇沉淀等技术制备获得ε-聚-L-赖氨酸成品，经检测其纯度达到98％以上，产品收率高于75％。本发明采用微生物发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的工艺，具有能耗低、设备结构简洁紧凑、方法易行、操作安全方便等特点，易于进行产业化推广。
文档编号C12R1/47GK103194500SQ201210361520
公开日2013年7月10日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者王秀英 申请人:四川金稞生物科技有限公司