专利名称：一种筛选中等直链淀粉含量水稻的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种辅助筛选中等直链淀粉含量水稻的方法及其专用引物。
背景技术：
水稻是世界上主要粮食作物之一。我国水稻播种面积为2800-3200万公顷，占全国粮食播种面积的27% ;水稻单产水平达5. 8-6. 3吨/公顷，稻谷总产量为I. 8-2. O亿吨，占粮食总产的39% (农业部，2007中国农业发展报告，中国农业出版社，2008，pp6-ll)。水稻生产在我国农业生产和农村经济发展中起着十分重要的作用，也是我国粮食安全、社会稳定和国民经济发展的基础。随着生活水平的提高，人们对大米的要求不仅仅在于满足温饱，而对ロ感和营养提出了越来越高的要求。直链淀粉含量是指直链淀粉占精米粉干重的百分率，它是鉴定稻米品质的主要指标之一，它与米饭的胀性、柔软性、光泽度、粘性有密切关系。不同水稻品种直链淀粉含量相差较大，水稻直链淀粉含量一般分为糯(0飞%)、低(8 15%)、中(15 24%)和高(>24%)四种类型。低直链淀粉含量的稻米煮饭胀性小，饭较湿粘有光泽；高直链淀粉含量的稻米煮饭胀性大，饭干松而色淡，冷后质硬；中等直链淀粉含量的稻米饭介于中间，较蓬松而软，符合大部分人的食味习惯(吴洪恺，博士学位论文，扬州大学，2006)。水稻胚乳中直链淀粉的合成是由蜡质基因(Waxy，/&)编码的颗粒结合淀粉合成酶(granule binding starch synthase,GBSS)控制的，该基因同时可控制水稻花粉和胚囊中直链淀粉的合成，是ー个组织和发育特异性表达的基因。已有研究表明，脸基因变异是导致水稻直链淀粉含量变异最主要的原因，也是稻米食味品质的主要决定因素。选育优质不育系和恢复系来改良和提闻杂交水稻的稻米品质，是一条行之有效的技术路线。多年的育种理论和实践证明，杂交稻稻米品质与母本(不育系)的关系更为密切。但就目前生产上来看，父本(恢复系)的稻米品质相对较好，而米质优、配合力強，有应用价值的优质不育系却为数不多，这在相当程度上阻碍了优质杂交稻新组合的选育和推广。为此，改良或选育具有中等直链淀粉含量的水稻育种材料尤其是不育系，已成为当今水稻品质育种的首选目标。众所周知，直链淀粉含量肉眼无法鉴定，化学測定方法烦琐，需要样品量大，耗时耗材，育种低世代选育难度较大。利用分子标记技术可以提高选择效率和节约成本。在前人的研究中，发现阪基因的第一个内含子的ー个SNP位点Inl是影响直链淀粉ー个重要因素，并开发出了分子标记，但是这个位点的变异只能区分出低直链淀粉含量基因型，不能把中等直链淀粉和高直链淀粉基因型分开，因此在实际育种中有很大的局限性。MingHsuanChen 等(Journal of Cereal Science, 2008 (47) : 536 - 545)利用脸基因的 Inl 和 Ex6 两个位点的SNP来分析171个水稻品种，发现使用这两个SNP可以将非糯水稻品种分为三类InlG-Ex6A为高直品种，InlG_Ex6C为中直品种，InlT_Ex6A为低直品种。因此，只要检测Ex6C就能知道是否是InlG-Ex6C基因型和中直品种。而InlG_Ex6C基因型的水稻品种大多为美洲品种，因此在我国水稻品种中引入中等直链淀粉基因型对于改善我国水稻稻米品质
3具有重要的意义。对于SNP的检测现在主要方法是测序法、毛细管电泳法和HRM法，所需相关仪器昂贵，成本太高，不适合普遍性推广；本发明拟采用等位基因特异性PCR的方法，设计四条引物，通过普通的PCR方法就能检测，简便快捷，成本低廉。通过基因的分子标记，可以在基因型水平上直接进行鉴定和辅助选择，可以大大提高对目标性状的选择效率，缩短育种周期。利用分子标记技术，加快了中直基因选育的进程，节省成本，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的是提供ー种辅助筛选中等直链淀粉含量水稻的方法及其专用引物。本发明所提供的辅助筛选水稻的引物Wx_Ex6，包含序列表中的4条核苷酸序列Wxin阳性水稻检测有1025bp和766bp的两个条带，阴性水稻检测有1025bp和310bp的两个条带的条带，对Wxin杂合水稻检测有1025bp、766bp和3IObp的三个条带。本发明所提供的辅助筛选水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，是由序列表中WxMF、WxMR、WxHF和WxHR的核苷酸序列的4条引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有766bp的条带，则该待测水稻为候选水稻。可通过浓度为I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。所述PCR扩增体系可为水稻基因组DNA模板50ng，Taq DNA聚合酶I U，I. 5μ I10XPCR缓冲液(IOOMm Tris-HCl (pH8. 3), 500Mm KCl),25mM MgCl2 O. 9ul,2. 5 mmol eachdNTPs 0. 6ul，四条引物各0. 2μ Μ，最后用ddH20补充反应体系至15 μ I。所述PCR 反应条件可为先 95°C 5min;随后 95°C 30sec，55°C 30sec, 72°C40sec，共35个循环；然后72°C 5min。由于水稻中图位克隆的基因还很少，所以绝大部分分子标记辅助选择都是用的连锁标记，在实际应用中会有一定的交换和误差。本发明根据水稻中直(中等直链淀粉，下同)基因Wxin的核苷酸序列设计的基因内功能性共显性标记。共显性标记与显性标记相比，可以排除实验中假阴性的影响，同时可以检测基因是否纯和，具有更好的准确性和精确性。本发明标记的隐性条带和阳性条带差异较大，可以用I. 5%左右的琼脂糖电泳检測，比一般的PAGE电泳检测的方法更简单方便，同时节省成本。本发明的特异引物是由本发明的辅助筛选水稻的方法可用于选育中等直链淀粉含量水稻，降低成本，缩短育种周期，具有准确性高，操作简单，成本低廉，周期短的特点，适于推广应用，为选育中等直链淀粉含量水稻种质提供了一种快捷的选择方法。
图I为本发明的分子标记Wx-Ex6对实施例2中巨风A//天丰A/J521的F6代育种群体分子检测示意图。下面结合附图及具体实施对本发明作进ー步说明。
具体实施例方式实施例I
用本发明中的专用引物Wx-Ex6对200份中国栽培稻微核心种质和95份国外引进种核
4心种质进行了分子检测，其中包含111个籼稻品种和89个粳稻品种。DNA提取采用常规的CTAB提取法。PCR扩增体系为水稻基因组DNA模板50ng，Taq DNA聚合酶I U，I. 5μ I 10XPCR缓冲液(IOOMm Tris-HCl (pH8. 3), 500Mm KCl),25mM MgCl2 O. 9ul,2. 5 mmol each dNTPs 0. 6ul，四条引物各0.2 μ Μ，最后用ddH20补充反应体系至15 μ I。PCR 反应条件可为先 95で 5min;随后 95で 30sec,55°C 30sec,72°C 40sec，共35个循环；然后72°C 5min。PCR产物检测将PCR产物，上样于I. 5%琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物带型。分子结果表明，200份核心种质中有17个品种的扩增产物中有766bp的条带，即这17个核心种质表现为中直等位基因型ry'比例为8.5%，其中籼稻品种2个(占籼稻品种总数的I. 80%):包协-7B、盐水赤;粳稻品种15个(占粳稻品种总数的16. 9%):台东陆稻、高阳淀稻、木樨球、肥东塘稻、本邦谷、黑芒稻、葡萄黄、半节芒、中楼一号、兴国、叶里藏花、百歌稻、毫巴永、冷水谷、拉木加。说明中直基因型在中国水稻品种中是ー种很稀少的基因型。对这17份品种进行直链淀粉含量(AAC)测定表明，他们的AAC介于15. 0%和21. 6%之间，平均值20. 0%，这与分子检测的结果是完全吻合的。95份国外引进种核心种质中，有18个是中直的，他们的AAC介于15. 4%和21. 5%之间，平均值17. 6%。其中55个亚洲品种、10个欧洲品种和10个美洲品种中各有4个是中直的，10个非洲品种6个是中直的，10个大洋洲没有中直的。非洲的中直比例最大，大洋洲最少。说明利用非洲稻等国外引进中等直链淀粉水稻来改良国内水稻品种，不仅可以针对性改良品质，还可以拓宽我国水稻的遗传背景，打破目前杂种优势利用的瓶颈，进ー步提高水稻产量。实施例2
首先在田间种植上述巨风A//天丰A/ J521的F6代育种群体，共114个株系J521含有中直品种Lemont的血缘，巨风和天丰则都是高直品种。在苗期采用本发明方法及提供的分子标记Wx-Ex6进行检测。DNA提取、PCR扩增体系和PCR产物检测PCR产物检测方法与实施例I相同。对这114个株系提取DNA，进行上述检测过程，如图I所示，最左边的条带是分子量对照Marker DL2000, Pl就是阳性亲本Lemont的带型，条带大小是1025和766bp ；P2就是阴性亲本巨风A的带型，条带大小是1025和310bp ；1-20是待检测的20个水稻株系，表现和Pi条带大小一致的是ry"阳性水稻，和P2条带大小一致的的是Zfy'"阴性水稻，同时具有1025、766和310bp三个条带的是ry"杂合水稻。图I中P为中直纯和阳性，N为阴性，H为中直杂合阳性，图I中有9个株系呈中直阳性，其中6个株系为纯和，3个株系为杂合。按本发明及图I所示检测方法，对114个株系进行上述检测，结果显示50个株系的扩增产物中有766bp的条带，即表现为中直基因型ry'其中47个纯和，3个杂合。对这个50个阳性株系和114个株系中的另外5个阴性株系进行了直链淀粉測定。结果发现，阴性单株的直链淀粉含量都在24%以上，属于高直类型；47个中直纯和阳性株系的直链淀粉含量在16. 0-20. 9%之间，平均值为17. 7%，3个中直杂合阳性株系的直链淀粉含量分别为16. 2%、17. 2%和17. 6%，50个株系都属于中直类型。标记和表型吻合度为100%，说明分子标记辅助选择的结果是有效的。阳性株系的直链淀粉含量有一定的波动，说明稻米直链淀粉含量由
5主效基因ぬ控制，但是还受到其他微效基因的影响，这与前人研究的结果也是一致的。
权利要求
1.ー种辅助筛选中等直链淀粉含量水稻的引物，包含序列表中的4条核苷酸序列WxMF CAACCCATACTTCAAAGGAACATC, WxMR GGCGGTGATGTACTTGTCC, WxH CTGGAGAAGGTGGAGTC和 WxHR GATCTTGAGATCAATTGTAACTCACGAT
2.ー种辅助筛选中等直链淀粉含量水稻的方法，以待检测水稻的基因组DNA为模板，用序列表中 WxMF :CAACCCATACTTCAAAGGAACATC、WxMR :GGCGGTGATGTACTTGTCC、WxHF CTGGAGAAGGTGGAGTCAT 和 WxHR GATCTTGAGATCAATTGTAACTCACGAT 的核苷酸序列的 4 条引物进行PCR扩增，检测扩增产物带型，如该待测水稻的扩增产物中有766bp的条带，则该待测水稻为候选中等直链淀粉含量水稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增体系为水稻基因组DNA模板 50ng，Taq DNA 聚合酶 I U, I. 5μ I 10父？0 缓冲液(100馳1^8-!1(1 (pH8. 3), 500MmKCl),25mM MgCl2 O. 9ul,2. 5 mmol each dNTPs 0. 6ul，四条引物各 0. 2 μ M，最后用 ddH20补充反应体系至15 μ I。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件为先95°C5min ；随后 95°C 30sec，55°C 30sec, 72°C 40sec，共 35 个循环；然后 72°C 5min。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述检测扩增产物带型的方法是进行I. 5%琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
本发明公开了一种辅助筛选中等直链淀粉含量水稻的方法与其专用引物。辅助筛选水稻的引物，是由序列表中序列WxMF、WxMR、WxHF和WxHR的核苷酸序列组成的四条引物。该辅助筛选水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，用序列表中序列WxMF、WxMR、WxHF和WxHR的核苷酸序列组成的四条引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物有766bp的条带，则该待测水稻为候选水稻。本发明的辅助筛选中等直链淀粉含量水稻的方法可用于选育中等直链淀粉含量水稻，缩短水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适应于推广应用，为选育中等直链淀粉含量水稻品种提供了一种快捷的检测方法。
文档编号C12N15/11GK102912014SQ201210361030
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者游艾青, 周雷, 陈志军, 马银花, 陈少愚, 杨国才, 李三和, 刘凯, 胡刚, 闸雯俊 申请人:湖北省农业科学院粮食作物研究所