专利名称：一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母的方法
技术领域：
本发明是一种对黄酒酿酒酵母进行选育，提高筛选效率，获得快速发酵黄酒酿酒酵母菌的方法，属于微生物育种领域。
背景技术：
黄酒是我国民族特色酒精饮料的典型代表，与啤酒和葡萄酒并称世界三大古酒。麦曲糖化，酒母发酵的独特酿造方式使得黄酒酿造技术成为中华民族智慧的杰出代表(曲被誉为中国的第五大发明)。随着现代黄酒酿造技术的发展，传统的缸坛发酵的操作方式逐步被以大罐发酵为代表的现代化、机械化黄酒生产技术所取代。黄酒酿造机理的明晰也逐 步确立了黄酒酵母在黄酒发酵过程中的关键作用。黄酒酵母菌株的性能往往成为影响黄酒发酵效率，黄酒品质的重要因素，因此优良黄酒酵母的开发对于提升黄酒生产效率，促进黄酒品质具有重要意义。当前国际与我国政策的规定，对于食品生产用菌的改造仅限于用传统手段，如菌种诱变，细胞融合等。虽然细胞融合能突破种间甚至属间进行育种，但就单一提高菌株某方面特性，诱变方式具有细胞融合无法比拟的优点，如高效简单，成本低。目前我国对于黄酒酵母菌种的研究工作相对滞后，对黄酒酵母的选育多采用自然分离筛选，传统诱变，TTC筛选等操作方式[[I]谢广发，郑志强快速发酵黄酒酵母的筛选[J].中国酿造，2010，221 (8) :12-14. [2]王梅，张彭湃，帅桂兰等.TTC在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒，2001，28(5) :62-64. [3]王晓娟.低产尿素黄酒酵母的选育及黄酒发酵工艺研究[D].新疆新疆农业大学，2009. [4]张建炜，肖冬光，张翠英等.优良黄酒酵母单倍体的分离筛选[J]. 2010，191 (5) :36-41.]，缺少一种有效的筛选指标，故存在技术手段单一，盲目性大，过程繁琐，筛选工作量大，效率低下等缺点，这也造成我国黄酒酵母菌种的改良选育成果较少。
发明内容
本发明的主要目的在于克服我国现阶段对于黄酒酿酒酵母育种中存在的手段单一，盲目性大，过程繁琐，筛选工作量大，效率低下等缺点，提供一种筛选快速发酵优良黄酒酿酒酵母的方法。本发明的技术方案一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母iSaccharomycescerevisiae)的方法，由以下步骤组成
(I)将被筛选的黄酒酿酒酵母接种至含有对酵母致死剂量克霉唑的药物筛选培养基
中；
(2 )挑取可在筛选培养基中生长的菌落后进行发酵试验(还原糖利用能力、发酵力、发酵速率的测定)，发酵速率提升的黄酒酿酒酵母即为所选育的菌株。药物筛选培养基成分为2%葡萄糖，2%琼脂，0. 67%YNB，致死剂量克霉唑(不同酵母致死剂量不一致)，用去离子水定容至100% ;其中被筛选的酵母包括经过基因修饰的黄酒酿酒酵母或未经基因修饰的黄酒酿酒酵母。所述方法所获得的快速发酵黄酒酿酒酵母菌株cerevisiae)XY-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC No.6329，该菌株具有克霉唑药物抗性的特点，也具有发酵速率提升的特点。所述方法所获得的黄酒酿酒酵母具有I种以上药物抗性即多药物抗性，或药物抗性增强的特性。本发明的有益效果利用药物抗性作为筛选指标，能有效提高筛选效率。因此药物抗性酿酒酵母是快速发酵酿酒酵母筛选的新方法，提高了筛选效率，对优良酵母的筛选具有一定的指导意义，为我国酿酒酵母的育种提供了重要资料。生物材料样品保藏一种酿酒酵母菌株cererisiae) XY-3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北 辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为=CGMCC No. 6329，保藏日期2012年7月12日。
图I实施例所获得优良酵母XY-3与原始酵母XY发酵速率比较。图2实施例所获得优良酵母XY-3与原始酵母XY酿酒小试中乙醇与甘油变化曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，具体实施例应理解为仅为举例说明，而非限定性，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。本发明的技术路线为对原始黄酒酿酒酵母菌株XY (某浙江地区某黄酒厂生产所用酵母)进行UV诱变，筛选克霉唑抗性(CTT)酵母菌，并对CTT酵母进行两级筛选，最终筛选出高效发酵速率酵母。实施此方法具体步骤如下
(I)糖液培养基制备称取糯米500g浸泡3d后蒸熟，依次加水1L，糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶各200ii L，麦曲45g后混匀，60°C水浴IOh后取清液，_20°C保存待用。(2)不同浓度梯度CTZ平板配制浓度分别为0, 5mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L,30mg/L，40mg/L的CTZ平板，其它物质浓度为2%葡萄糖，2%琼脂，0. 67%YNB(Yeast NitrogenBase without amino acids)。(3) XY生长曲线测定将活化后的黄酒酿酒酵母XY以5%的接种量接种至IOOmLYPD, 30°C摇床培养，定时测量OD600,绘制细胞生长曲线，以确定XY对数生长期时间。(4)CTZ致死浓度试验将活化后的黄酒酿酒酵母XY培养至对数期，涂布不同浓度梯度的CTZ平板，30°C培养，观察酵母生长情况。(5 )UV诱变时间试验用UV灯对数期黄酒酿酒酵母XY照射不同时间，计算不同时间的死亡率。取细胞致死率70%左右所对应UV照射时间为诱变条
件。(6)CTZr酵母获得及抗性稳定性检测以上述确定的UV照射时间对XY进行诱变，诱变后的酵母涂布于含致死浓度CTZ平板，避光培养。将CTT菌传代后种点种CTZ平板上，以原始菌株为对照，比较菌落大小，淘汰抗性不稳定菌株，共获28株CTT菌。此步骤能淘汰大量负突变株。(7)经糖液发酵后筛选出XY-3，XY-16，XY-18，XY-28进入下一轮发酵筛选。(8)快速发酵酵母二级筛选及发酵力稳定性检测测量各菌株发酵力及发酵速率，确定快速发酵黄酒酿酒酵母。将获得的酵母传20代，检测各代酵母与原始菌XY发酵力并比较。最终获得优良菌XY-3。(9)黄酒酿造小试取IOOOg糯米浸泡后蒸熟后加入水IOOOmL,麦曲125g，液化酶与糖化酶各300iiL，酵母200mL后拌匀。30°C前酵4d，17°C后酵10d。定时取样，测量乙醇浓度及甘油浓度。(10)乙醇及甘油浓度测量方法利用HPLC检测，液相条件为柱Bio-Rad AminexHPX-87H，柱温60°C，流动相3mmol/L H2SO4,流量0. 6mL/min,检测器为示差折光检测器 (RID)0(11)其它药物抗性测试结果
权利要求
1.一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母cererisiae)的方法,其特征在于包括以下步骤 (I)将被筛选的黄酒酿酒酵母接种至含有对酵母致死剂量克霉唑的药物筛选培养基中； 药物筛选培养基成分为2%葡萄糖，2%琼脂，O. 67%YNB，致死剂量克霉唑，不同酵母致死剂量不一致，用去离子水定容至100% ;其中被筛选的酵母包括经过基因修饰的黄酒酿酒酵母或未经基因修饰的黄酒酿酒酵母； (2 )挑取可在筛选培养基中生长的菌落进行发酵试验，进行还原糖利用能力、发酵力、发酵速率的测定，发酵速率提升的黄酒酿酒酵母即为所选育的菌株。
2.用权利要求I所述方法所获得的快速发酵黄酒酿酒酵母菌株cerevisiae) XY_3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 6329，该菌株具有克霉唑药物抗性的特点，也具有发酵速率提升的特点。
3.用权利要求I所述方法所获得的黄酒酿酒酵母，其特征在于具有I种以上药物抗性即多药物抗性，或药物抗性增强的特性。
全文摘要
本发明涉及一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的方法。属于微生物育种领域。其主要步骤是通过前处理得到稳定的药物(真菌抑制剂)抗性酵母菌，再从抗性酵母中筛选获得快速发酵黄酒酿酒酵母。本发明是筛选稳定的药物抗性黄酒酿酒酵母的方法，此方法能减少普通筛选工作时带来的盲目性，提高筛选效率，对优良酵母的筛选具有一定的指导意义，为我国黄酒酿酒酵母的育种提供了重要资料。
文档编号C12N1/18GK102827783SQ20121036016
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者徐岩, 黄笃厚, 陈双 申请人:江南大学