专利名称：一种don 降解酶的编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种DON降解酶的编码基因和应用。
背景技术：
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalnol，D0N)，又称呕吐毒素(vomitoxinorvomitingtoxin, VT),是单端孢霉烯族毒素中的一种,在自然界中广泛存在，主要由镰刀菌属的黄色镰刀菌和禾谷镰刀菌产生，是镰孢菌、头孢菌和木霉菌等真菌的次级代谢产物之一。DON为雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，NIV)的脱氧衍生物，可溶于极性溶剂和水，如含水甲醇、含水乙醇或乙酸乙酯等，但不溶于乙醚和正己烷。DON属天然产物，通过人工合成途径极难获得。DON具有较强的热抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯中可长期保存。DON非常耐 存贮，结构式如下。
八8> e、Z
0 / 1 OE 0H CH3'HDON作为常见的真菌毒素之一，自然发生于食品污染物，污染粮食最为普遍，主要污染谷物及其制品。而且可能与人的食道癌及大骨节病的发生有关系。我国粮食中DON的污染呈高污染率、高浓度的趋势。为了阻止霉菌毒素在食物链中传播，我国规定猪、犊牛、泌乳期动物配合饲料中DON含量不得超过Img · kg—1，牛和家禽的配合饲料中DON的含量少量超过5mg · kg'德国在2005年提出除了面包中DON的最大建议量为500 μ g -kg^1外，谷物及食品中DON的最大量为750μ g · kg'加拿大和美国规定供人食用小麦中DON的限量标准为2mg · kg—1，婴儿食品为Img · kg'DON的结构中12-13环氧环是引起DON毒性的主要基团，如果该基团被破坏，将极大的降低DON的毒性，签于此，本专利通过克隆及表达塔宾曲霉(H6)中DON降解酶基因，生产DON降解酶来对DON的结构中12-13环氧环进行水解，以降低DON的毒性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种DON降解酶的基因。本发明的另一目的是提供该基因编码的DON降解酶。本发明的又一目的是提供该基因的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现
一种DON降解酶基因，缩写为eh基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明所述的eh基因编码的DON降解酶，缩写为酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。含有本发明所述的DON降解酶的表达载体。含有本发明所述的DON降解酶的工程菌。本发明所述的DON降解酶基因在制备DON脱毒剂(即DON降解剂)中的应用。本发明所述的DON降解酶在降解DON中的应用。本发明所述的表达载体在制备DON脱毒剂(即DON降解剂)中的应用。有益效果 本发明以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为唯一碳源，通过富集培养从土壤中分离到一株可以生物转化DON的真菌塔宾曲霉H6 (CCTCC NO :M2012128)。通过克隆塔宾曲霉H6中DON降解酶-环氧化物水解酶基因并表达，获得了 DON降解酶，可用于制备DON脱毒剂或降解剂，为实际生产中DON的降解提供有效的生物脱毒办法，对于霉菌毒素的脱毒具有重要意义。本发明还具备DON降解酶基因克隆表达方法简便可行，DON降解酶基因表达蛋白特异性强的优点。
图I H6菌中eh基因RT-PCR扩增结果，其中，M表示Marker，泳道1-2表示RT-PCR产物。图2 pMD-EHa/DH5 α质粒PCR结果，其中，M表示Marker，泳道1-4表示质粒PCR结果。图3 pET-EHse表达载体及含有该载体的E. coli BL21PCR鉴定结果，其中M表示DNA分子量标准；1 4泳道.E. coli BL21菌液PCR结果；1’ 4’ . pET-EHse质粒PCR结果O图4 pET-EHse在BL21中表达的SDS-PAGE电泳图M.蛋白分子量标准(低);1 3.未经IPTG诱导培养4h的BL21，pET32a( + )/BL21，pET-EHse/BL21 ；4 6.经终浓度为 Immol · L-1IPTG 诱导 4h 后的 pET_EHse/BL21，pET32a(+ ) /BL21, BL21。图5优化培养条件后的可溶蛋白与包涵体蛋白SDS-PAGE分析M.蛋白分子量标准(低)；1.可溶蛋白；2.包涵体蛋白。生物材料保藏信息塔宾曲霉H6,分类命名为Aspergillus tubingensis H6,保藏于中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2012年4月24日，保藏编号为 CCTCC NO M2012128o
具体实施例方式实施例I塔宾曲霉H6(CCTCC NO :M2012128)是申请者以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为唯一碳源，通过富集培养从土壤中分离到一株可以生物转化DON的真菌。用真菌通用引物ITSl和 ITS4 扩增了该菌的 ITS 区间(Internal transcribed spacer),包括 ITSl 和 ITS2,扩增片段大小为565bp，通过在GenBank数据库上比较将该菌鉴定了属，然后用种间弓I物Bt2a和Bt2b扩增了该菌的β-tubulin基因序列，扩增片段大小为511pb。通过ITS和β-tubulin基因序列分析和形态学观察最终鉴定该菌株为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。该菌的β -tubulin基因序列在GenBank的登录号为DQ902579。实施例2eh基因的克隆2. I塔宾曲霉H6的活化及扩增培养将一 70°C保存的塔宾曲霉H6 (CCTCC NO :M2012128)挑一接种环于察氏固体培养基平面上划线，28°C，培养4d。转接2次。从平板上挑取一环菌于装有50mL察氏液体培养基的250mL锥形瓶中，28°C，150r · min-1摇床培养30h。以1%的接种量吸取种子液于IOOmL察氏液体培养基的250mL锥形瓶中，28°C，150r · min-1摇床培养5d。2. 2塔宾曲霉H6总RNA的提取及测定 取28°C, 150r · min-1 摇床培养 5d 的菌液 2OmL, 12000r · min-1 离心 25min,去除上清，收集菌体。用吸水纸吸干上面的液体。称取干燥后的菌丝体，通过RNAisoTM Plus匀浆法提取H6的总RNA，于超净台中晾干沉淀。用50 100 μ L无Rnase水溶解沉淀。在260nm和280nm波长处测其吸光值。结果0D260/0D280比值在I. 7-2. O之间。提取物进行变性琼脂糖凝胶电泳。2. 3RT-PCR以塔宾曲霉H6总RNA为模版，Oligo (T) 15为引物进行RT，获得含有目的基因的cDNA第一链。再以此为模版，EHa-I和EHa_2为引物进行PCR，获得塔宾曲霉H6的eh基因片段。EHa-I 5/ -TTGAATTCCATATGGCACTCGCTTACAGCAAC-3，(SEQ ID NO. 3)；EHa-2 5/ -TAGGATCCATCTCATTTTCTACCAG-3’(SEQ ID NO. 4);依次在100 μ L EP管中加入下列PCR反应液ddH20 31 μ L, dNTP (各2. 5mM)4μ L, IOXPCRbuffer 5 μ L, MgCl2 (25mM,加之前要摇勻)4 μ L，EHal (20 μ Μ) I μ L，EHa2 (20 μ Μ) I μ L，模板 cDNA 3 μ L，Takara rTaq 酶 I μ L。混匀后，低速离心 15s。反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s, 52°C lmin，72°C延伸lmin,30个循环；然后72。。延伸5min。扩增产物经I. 0%琼脂糖凝胶电泳，电压为3 5V/cm，在紫外光下观察结果，使用凝胶成像系统照像并记录，结果如图I。切取含有目的基因片段的凝胶，放入无菌I. 5mL离心管中称重，使用BI0MIGA胶回收纯化试剂盒进行目的片段回收，4°C保存备用。2. 4 pMD-EHa克隆载体的构建利用Takara pMD 18-T Simple Vector与2. 3中回收的eh基因片段连接。制备DH5a大肠杆菌感受态，采用热激法将重组质粒转化DH5 a大肠杆菌感受态细胞。筛选、PCR鉴定鉴定大肠杆菌阳性克隆(PCR鉴定的方法同2. 3)，结果见图2。将4株阳性克隆进行编号，分别为 pMD-EHal、pMD-EHa 2、pMD_EHa 3、pMD_EHa 4。取 pMD-EHa I 送去测序，测序结果见SEQ ID NO. I。将测得序列与Genebank上的Aspergillus niger SQ-6的mRNA的全序列相比较，有91%的相似性。实施例3 pET-EHse表达载体的构建3. I使用引物Hlse I与Hlse 2扩增pMD-EHa重组质粒
EHse-I 5/ -GATGAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 5)EcoR IEHse-2 5/ -CGTGTCGACATCTCATTTTCTACCA-3’ (SEQ ID NO. 6)Sal I 扩增pMD-EHa重组质粒，反应体系为pMD_EHa重组质粒I μ L，2 X PCR Mix12. 5 μ L，EHse I (10 μ mol · L-1) I μ L, EHse 2 (10 μ mol · L-1) I μ L, ddH20 补齐至 25 μ L ；混匀后，离心15s。反应条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C lmin，72°C延伸lmin，30个循环；然后72°C延伸5min。琼脂糖凝胶电泳鉴定并记录。切胶回收PCR产物。3. 2 pET-EHse表达载体的构建 利用Takara pMD 18-T Simple Vector与3· I中回收的PCR产物连接得到PMD-EHse克隆载体，筛选并双酶切鉴定pMD-EHse大肠杆菌阳性克隆。用SalI和EcoRI对pMD_EHse重组质粒和载体pET_32a质粒双酶切。切胶回收酶切后得到的目的片段，用T4连接酶连接酶切片段。采用热激法将重组质粒转化到T0P10感受态细胞中。挑选阳性克隆，提取质粒DNA，将其作为模板琼脂糖凝胶电泳观察记录PCR结果。用SalI和EcoRI再次双酶切重组载体pET-EHse质粒，琼脂糖凝胶电泳观察并记录酶切结果。采用热激法将已检测无误的重组子转化到宿主菌E. coli BL21感受态细胞中，挑选转化后的BL21阳性克隆，进行菌液PCR与质粒PCR，并且进行双酶切鉴定，进行PCR及酶切检测。结果表明该阳性克隆包含重组质粒pET-Ehse，结果见图3。实施例4H1的诱导表达4. I EH的诱导表达a)分别从甘油保存含有pET-EHse重组质粒的BL21、含有pET 32a( + )质粒的BL21与不含载体质粒的BL21菌中接一环细胞加入3mL Amp LB培养基中。37°C，200rpm培养至OD600 约为 O. 5。b)将3mL菌液加入IOOmL Amp LB培养基中。37°C，200rpm培养。生长过程中无菌条件下取出菌液测定0D_值。当OD6tltl值约为O. 8时，将IOOmL菌液分为2份各50mL。其中一份加入IPTG至终浓度为Immol · L—1。另一份不加IPTG作为不诱导对照。25°C，180rpm，培养16h。产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。结果发现含有pET_EHse重组质粒的BL21总蛋白提取物中有一条蛋白条带，大小量约为63. 5KDa (图4)，与预期的融合蛋白大小一致，确定为目的蛋白。4. 2 EH 的分析对细胞总蛋白、培养基、细胞周质、细胞质可溶部分、细胞质不溶部分中的组分进行分析，观察融合蛋白表达位置。SDS-PAGE结果发现，当生长条件为25°C，200r · mirT1，IPTG终浓度为Immol · Γ1诱导16h时，在诱导组和非诱导组的培养基上清中均有少量的蛋白，但目的蛋白在细胞质可溶部分与细胞质不溶部分中含量更多。优化培养条件改为25°C，200r · mirT1，IPTG终浓度为O. 4mmol · I/1诱导16h时，SDS-PAGE结果中可见，可溶蛋白与包涵体蛋白量之间的比例近似为I : I。4. 3 EH 的纯化使用一站式His蛋白微量纯化试剂盒对细胞裂解上清与包涵体进行纯化。SDS-PAGE结果(图5)可见细胞裂解上清与包涵体进行纯化后，有一条63. 5KDa大小的条带。考马斯蛋白定量试剂盒测定纯化后蛋白含量，在培养条件为约25°C，200r ^irT1, IPTG终浓度为O. 4mmol · Γ1诱导16h时，目的蛋白表达量约为2. 3g · Γ1菌液。实施例5 EH酶对DON的水解效果将纯化的lg/mL EH与10ng/mL DON,在pH为O的PBS中，35 °C恒温振荡反应 30min，提取溶液中的D0N，用HPLC检测对DON的水解效果，水解率为73. 82 % 75. 6 %。对照组的水解率为O %。
权利要求
1.一种DON降解酶基因，缩写为eh，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—种权利要求I所述的基因编码的DON降解酶，缩写为H1，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
3.含有权利要求I所述的DON降解酶基因的表达载体。
4.含有权利要求I所述的DON降解酶基因的基因工程菌。
5.权利要求I所述的DON降解酶基因在制备DON脱毒剂中的应用。
6.权利要求2所述的DON降解酶在降解DON中的应用。
7.权利要求3所述的表达载体在制备DON脱毒剂中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种DON降解酶的编码基因和应用。本发明所述的DON降解酶基因eh核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的DON降解酶氨基酸序列如SEQID NO.2所示。本发明还提供了含有基因eh的大肠杆菌表达载体pET-EHse以及在大肠杆菌中的高效表达。本发明可用于降解霉菌毒素DON工业化生产的基因工程菌的构建，提高微生物中降解霉菌毒素DON的水平和质量。
文档编号C12N1/15GK102827854SQ20121035988
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者何成华, 樊彦红, 皇超英, 孟玲玲, 杨彦琼, 张海彬 申请人:南京农业大学