专利名称：一种γ-谷氨酰转肽酶固定化酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和酶工程领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用。
背景技术：
y -谷氨酰转肽酶(Y -glutamyltranspeptidase, GGT, EC 2. 3. 2. 2)是生物体内谷氨酰循环中的关键酶，可特异性催化Y-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含Y-谷氨 酰基的化合物。通过改变受体种类可获得不同的谷氨酰化合物，如催化合成药物或药物的前体，如L- Y -谷氨酰-L-多巴，它是帕金森综合症的前体药物；谷胱甘肽，其在临床上用于肝病的辅助治疗、有机物及重金属的戒毒等。由于其催化具有位点特异性和光学选择性强，无需对反应物进行侧链保护和脱保护，无需辅酶、反应过程中也不消耗ATP等优点，而成为工业生物催化领域的研究热点。由于Y-谷氨酰转肽酶在碱性(pH>9. O)条件下已发生亚基解聚，从而导致酶活的不可逆下降，限制了其在工业合成领域的应用。目前，已有的固定化方法对于提高其PH稳定性的作用有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种Y-谷氨酰转肽酶固定化酶，可以实现重组Y-谷氨酰转肽酶的一步纯化-固定化，并提高重组Y-谷氨酰转肽酶的稳定性，降低制备谷氨酰化合物的合成工艺成本。本发明还要解决的技术问题是提供上述Y-谷氨酰转肽酶固定化酶固定化酶的制备方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种Y-谷氨酰转肽酶固定化酶，它包括酶、固定所述酶的载体和包覆材料，所述的酶为Y-谷氨酰转肽酶，所述的载体为镍亲和载体，所述的包覆材料为聚乙烯亚胺。其中，所述的镍亲和载体为Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和载体，其购自GEhealthcare公司，同类镍亲和载体均适用。上述Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，将镍亲和载体，加入含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液中，于4 45°C下振荡反应I 6h后，将液体滤出；固体颗粒用pH7. O 9. O的含有200mmol/L咪唑的30 60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用pH7. O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用PH7. O 9. O的O. 2 1%(ν/ν)的聚乙烯亚胺水溶液，于4 45°C震荡反应12 24h后，固体颗粒再用ρΗ7· O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出，即制得Y -谷氨酰转肽酶固定化酶。上述Y -谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，优选的是，将镍亲和载体，加入含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液中，于4°C下振荡反应Ih后，将液体滤出，固体颗粒用PH8. O的含有200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用PH8. O的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用PH7. O的O. 2%(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，于4 V震荡反应12h后，固体颗粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出，即制得Y -谷氨酰转肽酶固定化酶。其中，所述的细胞破碎液，Y-谷氨酰转肽酶的酶活为10U/mL以上。其中，其·特征在于对每g湿质量的镍亲和载体，含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液加入体积为10 30mL,优选为10mL。其中，对每g湿质量的镍亲和载体，加入pH7. O的O. 2%(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液体积为10 30mL,优选为10mL。其中，制备得到的Y -谷氨酰转肽酶固定化酶在ρΗ7· O 9. O的30 60mmol/LTris-HCl缓冲液中保存。上述Y-谷氨酰转肽酶固定化酶在催化制备Y-谷氨酰基化合物中的应用。通过本发明方法制备得到的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶可用于催化制备系列Y-谷氨酰基化合物。有益效果本发明充分利用镍亲和载体对于重组Y -谷氨酰转肽酶上His-Taq标签的特异性吸附，直接从细胞破碎液中吸附重组Y-谷氨酰转肽酶，再用含有咪唑的缓冲液洗去杂质，达到纯化-固定化一步完成。在固定化酶的基础上包覆一层聚乙烯亚胺高分子，大大提高固定化酶在不同PH条件下，尤其是碱性(pH>9. O)条件下的稳定性，从而为实现固定化重组Y-谷氨酰转肽酶工业应用提供了良好的前提条件。通过本发明方法制备的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶酶活力回收率平均达到20. 0% ;与游离酶相比，固定化酶的最适作用PH和温度并无改变，但固定化酶的pH稳定性较游离酶有大幅度提高，且重复使用性能好。
图I为游离酶和固定化酶的最适pH值，图中显示Y-谷氨酰转肽酶的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的最适pH为9。图2为游离酶和固定化酶的最适温度，图中显示Y-谷氨酰转肽酶的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的最适温度为50°C。图3为游离酶和固定化酶的pH稳定性，图中显示Y -谷氨酰转肽酶的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的稳定性得到了明显改善，在各PH条件下，经过聚乙烯亚胺包覆的固定化酶的稳定性均较游离酶有大幅提高，在PH 11. O条件下保存15小时，固定化酶的残余酶活可达44. 4%。图4为游离酶和固定化酶的保温4h后的热稳定性，图中显示Y-谷氨酰转肽酶的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的热稳定性在45°C以下条件中有所提高，当保温在45°C下4h时固定化酶的残余酶活为初始值的77. 6%。图5为Y -谷氨酰转肽酶的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的使用稳定性，图中显示随着转化次数的增多，固定化酶的活力略有下降，但经储存约30d，转化20个批次后，聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶活力仍可保持初始值的70%左右。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例所使用的Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和载体购自GE healthcare公司。具体性质可参考说明书。以下实施例中酶活力检测方法如下称取O.Olg (湿重)固定化酶，和0.5mL5mmoI · L 1 Y -GpNA 溶液、O. 5mL O. IOmol · L 1 双甘二妝溶液、I. 5mL SOmmoI /T, pH8. OTris-HCl缓冲一起加入砂芯反应管中。37°C，振荡速度120r · mirT1，反应20min。反应 液滤出于紫外分光光度计(λ =410nm)下测定吸光值，根据标准曲线计算对硝基苯胺浓度。以下实施例中酶活回收率计算方法如下回收率=(固定化酶活力/总投入酶活)X 100%实施例I :Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和载体上重组Y -谷氨酰转肽酶的固定化称取
I.Og Ni Sepharose 6Fast Flow亲和载体置于砂芯管中，加入含有重组Y -谷氨酰转肽酶的细胞破碎液IOmL (酶活为13. 06U/mL),于4°C冰浴振荡反应lh。反应结束后用pH8. O含有200mmol/L咪唑的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗去多余的酶溶液和杂质2次，再用pH8. 050mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗载体2次，即制得镍亲和载体固定化重组Y -谷氨酰转肽酶。其酶活力为26. lU/g载体，酶活回收率为20.0%。将所得镍亲和载体固定化重组Y-谷氨酰转肽酶加入PH7. O的O. 2%聚乙烯亚胺水溶液中，4°C震荡12h，反应结束后用pH8. 050mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗载体2次，即制得聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶。实施例2 将I. Og Ni Sepharose 6Fast Flow,加入IOmL含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液(酶活为13. 06U/mL)中，于45°C下振荡反应6h后，将液体滤出；固体颗粒用pH7. O的含有200mmol/L咪唑的30mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2次，将液体滤出；固体颗粒再用pH7. O的30mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2次，将液体滤出；固体颗粒再用10mLpH7. O的O. 2%的聚乙烯亚胺水溶液，于4°C震荡反应12h后，固体颗粒再用pH7. O的30mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2次，将液体滤出，即制得Y _谷氨酰转肽酶固定化酶。实施例3 将I. Og Ni Sepharose 6Fast Flow,加入30mL含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液(酶活为13. 06U/mL)中，于45°C下振荡反应6h后，将液体滤出；固体颗粒用pH9. O的含有200mmol/L咪唑的60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗3次，将液体滤出；固体颗粒再用PH9. O的60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗3次，将液体滤出；固体颗粒再用30mLpH9. O的1%的聚乙烯亚胺水溶液，于45°C震荡反应24h后，固体颗粒再用pH9. O的60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗3次，将液体滤出，即制得Y -谷氨酰转肽酶固定化酶。实施例4:应用。重组Y -谷氨酰转肽酶作为一种催化剂，可用于酶法合成硫代苄基-Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)，供体为L-谷氨酰胺(Gln)和硫代苄基-L-半胱氨酸(S-Bzl-Cys)0配制Gln和S-Bzl-cys浓度均为20mmol · L—1的底物混合物(pH 9. O),分别加入游离酶和实施例I方法制备的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶，使反应液中酶浓度均为O. 0320U/mL，于40°C水浴反应，定时取样测定产物S-Bzl-GGC的浓度。在反应初始阶段，产物S-Bzl-GGC的产率随反应时间的延长逐渐增加。但随着反应的继续，产物浓度达到最大值后逐渐降低，这一现象与GGT的催化机制有关。实验结果表明，以固定化酶为催化剂，在相同的酶浓度下，反应22h后产物得率为5. 2mmol · L_\较游离酶提高了 13. 06%。实施例5 :游离酶和聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的最适pH值比较试验。实施例I制得的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶，分别在pH 6 9 (Tris-HCl缓冲)及PHlO 11 (碳酸氢钠缓冲)的溶液中测定游离酶及聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的活力，结果如图I所示。聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶和游离酶的最适作用均为PH9， 当PH小于或大于该值时，游离酶和聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的活性均有下降，且在碱性条件，游离酶的活性下降较聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶更为迅速，表明通过固定化可以有效地扩大重组GGT的作用pH范围。实施例6 :游离酶和聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的最适温度比较试验。实施例I制备得到聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶，在不同温度(25_50°C)下分别测定游离酶及聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶活力，结果如图2。由图可知，聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶和游离酶在均在50°C时酶活最高。实施例7 :游离酶和聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的pH稳定性试验。将游离酶和实施例I制得的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶分别置于pH 6 11的缓冲液中，37°C保温15h后测定酶活，以O时刻的初始酶活为100%，计算残余酶活(图3)。结果表明，B. subtilis NX-2GGT游离酶的稳定性较差，尤其在碱性条件下(pH>8. O)稳定性更差。在pH 11.0条件下，经过15小时贮存，其残余酶活仅为初始酶活的I. 79%。通过镍亲和固定化GGT的pH稳定性得到了改善，包覆了聚乙烯亚胺后的镍亲和固定化酶在各pH条件下，固定化GGT的稳定性均有更大幅度得提高，在pH 11. O条件下保存15小时，固定化酶的残余酶活可达44. 4%。实施例8 :游离酶和聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的保温4h后的热稳定性试验。将游离酶和实施例I制得的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶置于不同温度(35 550C )下保温4h后取样测定酶活，设保温前初始酶活为100%，计算残余酶活，结果见图4。游离酶的热稳定性较差，随着温度升高，酶活迅速下降，45°C时残余酶活为57. 58%。而镍亲和固定化后GGT在45°C以下热稳定性提高，尤其是包覆了聚乙烯亚胺的镍亲和固定化酶，当温度为45°C时固定化酶的残余酶活可达初始值的77. 6%。但当温度超过45°C后，固定化酶失活脱落更快。实施例9 :聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的使用稳定性试验。称取O. Olg的实施例I制得的聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶，于4°C下贮藏，定期测定酶活，聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的储存稳定性测试结果见图5。在转化初期(5 10个批次)固定化酶活有明显的下降，这可能是由于结合较弱的酶分子脱落造成的。随着转化次数的增多，聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶的活力略有下降，但经储存约30d，转化20个批次后，聚乙烯亚胺包覆镍亲和固定化酶活力仍可保持初始值的70%左右。·
权利要求
1.ー种Y-谷氨酰转肽酶固定化酶，其特征在于，它包括酶、固定所述酶的载体和包覆材料，所述的酶为Y -谷氨酰转肽酶，所述的载体为镍亲和载体，所述的包覆材料为聚こ烯亚胺。
2.根据权利要求I所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶，其特征在于，所述的镍亲和载体为 Ni Sepharose 6 Fast Flow。
3.权利要求I所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在干，将镍亲和载体，加入含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液中，于4 45°C下振荡反应I 6h后，将液体滤出；固体颗粒用PH7. O 9. O的含有200mmol/L咪唑的30 60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用pH7. O 9. O的30 60mmol/LTris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用pH7. O 9. O的O. 2 1%(ν/v)的聚こ烯亚胺水溶液，于4 45°C震荡反应12 24h后，固体颗粒再用pH7. O 9. O的 30 60mmol/LTriS-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出，即制得Y -谷氨酰转肽酶固定化酶。
4.根据权利要求3所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在于，将镍亲和载体，加入含有重组Y -谷氨酰转肽酶的细胞破碎液中，于4°C下振荡反应Ih后，将液体滤出，固体颗粒用PH8. O的含有200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出；固体颗粒再用PH7. O的O. 2%(v/v)的聚こ烯亚胺水溶液，于4°C震荡反应12h后，固体颗粒再用pH8. O的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2 3次，将液体滤出，即制得Y-谷氨酰转肽酶固定化酶。
5.根据权利要求3或4所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在干，对每g湿质量的镍亲和载体，含有重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液加入体积为10 30mLo
6.根据权利要求5所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在干，对于每g湿质量的镍亲和载体，重组Y-谷氨酰转肽酶的细胞破碎液溶液的加入体积为10mL。
7.根据权利要求3或4所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在干，对每g湿质量的镍亲和载体，加入PH7. O的O. 2%(v/v)的聚こ烯亚胺水溶液体积为10 3 OmL ο
8.根据权利要求7所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在于对于，每g湿质量的镍亲和载体，加入PH7. O的O. 2%(v/v)的聚こ烯亚胺水溶液体积为10mL。
9.根据权利要求3或4所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法，其特征在于，制备得到的Y -谷氨酰转肽酶固定化酶在PH7. O 9. O的30 60mmol/L Tris-HCl缓冲液中保存。
10.权利要求I所述的Y-谷氨酰转肽酶固定化酶在催化制备Y-谷氨酰基化合物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种γ-谷氨酰转肽酶固定化酶，它包括酶、固定所述酶的载体和包覆材料，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的载体为镍亲和载体，所述的包覆材料为聚乙烯亚胺。本发明还公开了上述γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的制备方法及其应用。本发明所得到的γ-谷氨酰转肽酶固定化酶具有制备简单快速、酶稳定性强、重复使用性能好等特点，为进一步提高γ-谷氨酰转肽酶的稳定性以适应工业化应用奠定基础。
文档编号C12N11/00GK102851272SQ20121035985
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者姚忠, 田思思, 周治, 王浩绮, 熊强, 仲兆祥, 徐虹 申请人:南京工业大学