专利名称：利用一株安全菌株发酵生物柴油副产物粗甘油生产2,3-丁二醇的制作方法
利用一株安全菌株发酵生物柴油副产物粗甘油生产2, 3- 丁二醇技术领域
利用一株安全菌株发酵生物柴油副产物粗甘油生产2，3-丁二醇，属于生物工程中发酵技术领域。
背景技术：
随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越来越受到国内外的高度重视。生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源，以其具有环保和可再生性受到世界各国的关注，该产业在全球范围内迅速发展。但其经济性仍然不能与传统的化石能源相抗衡。其原因主要有两方面一方面是原料油脂价格较高；另一方面就是副产物甘油没有得到很好的综合利用。在生物柴油的生产过程中可得到约10%的副产物甘油，在原料端成本无法有效控制的前提下，如何对副产物粗甘油进行深度开发，已成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障，同时也是无法回避的关键问题。如果能够利用生物柴油副产物甘油开发高附加值产品(如1，3-丙二醇、乙二醇、2，3- 丁二醇等)，就能有效地降低生物柴油生产成本、提高资源利用率、延伸产业链，是建立高效、经济的生物质能源综合利用产业的重要措施，将大大提升生物柴油产业的整体技术水平和循环效益。
2，3_ 丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域。2，3- 丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果； 在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2- 丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛的天然食用香料； 脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1，3_ 丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值与甲醇(22. lkj/g)、乙醇(29.0kJ/g)相当。由于2，3_ 丁二醇的高辛烷值，它可作为汽油的辛烷值提升剂或航空燃料另外，2，3-丁二醇及其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。
近年来用糖质原料发酵生产2，3_ 丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物法生产2，3- 丁二醇尚未实现工业化。然而从2，3- 丁二醇的应用前景、生产技术成熟度、 知识产权状况及未来发展趋势看，开发以廉价的非粮糖质为原料(如生物柴油副产物粗甘油)发酵生产2，3-丁二醇具有很好的发展前景。目前报道的2，3_ 丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等,但这些菌大都是用糖质原料发酵生产2，3- 丁二醇，而在国内利用粗甘油为原料生产2，3- 丁二醇还未见报道；另外，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求。因此，使用安全菌种利用甘油发酵2，3-丁二醇具有良好的工业化前景。本发明利用一株安全菌株 Bacillus subtilis CTCC M2009200发酵生物柴油副产物粗甘油生产2，3-丁二醇，为生物柴油副产物粗甘油进行工业化深度开发提供了基础。发明内容
本发明的目的是提供一种利用一株安全菌株Bacillus subtilis CTCC M2009200 发酵生物柴油副产物粗甘油生产2，3- 丁二醇的方法。
本发明实现过程如下
本发明所使用菌种为Bacillus subtilis CTCC M2009200 (该菌株前期用于发酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，相关专利申请号201010167019. 7。已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCCM2009200)。最近我们发现B. subtilis CTCC M2009200可以有效利用生物柴油副产物粗甘油高效合成2，3- 丁二醇，其具体生产工艺如下
(I)挑取平板上保藏的B. subtilis CTCC M2009200单菌落接种于种子培养基中培养，优选的培养时间为10-16h，培养温度为37°C，种子培养基组成如下
酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L ;种子培养液采用250mL摇瓶培养， 将种子液在摇床上培养12h左右，培养温度为37°C，摇床转速为160r/min。
(2)B. subtilis CTCC M2009200 发酵培养
发酵培养基组成如下
粗甘油80g/L，玉米浆 10g/L，尿素 3g/L，柠檬酸钠 6g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4 O. 2g/ L ;将上述发酵培养基用5mol/L的NaOH调节其pH至6. 5，在121°C下高温灭菌30min。发酵装置为5L发酵罐，初始装液量为2. 5L，接种量为4%。发酵条件为 空气流量为120m3/ h · m3培养基，搅拌转速为350r/min，粗甘油水溶液补料量使培养液中的甘油的浓度维持在 0-20g/L，发酵时间为80-88h。发酵结束后，发酵液经离心等处理后，利用气相色谱的FID检测器即可检测发酵液中2，3-丁二醇含量。
本发明的有益效果
本发明首次利用枯草芽孢杆菌B. subtilis CTCC M2009200发酵生物柴油副产物粗甘油高效合成生物基平台化合物2，3- 丁二醇，且2，3- 丁二醇产量达到70. 2g/L，转化率达到O. 42g/g甘油，是现有技术所不能达到的，取得了预料不到的技术效果；另外，其发酵培养基采用生物柴油副产物粗甘油，发酵培养基中无需添加酵母膏、蛋白胨等价格较高的氮源，而是添加了玉米浆、豆柏等廉价氮源，从而降低了生产成本。所以该发明具有较高的工业化应用价值。
另外，目前报道的2,3-丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等,这些菌种大都是用糖质原料发酵生产2, 3_ 丁二醇；另外，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求，解淀粉芽孢杆菌属于环境安全菌株，能够满足工业化对安全生产的要求。同时随着生物柴油产业的蓬勃发展，生物柴油副产物粗甘油产量也迅速增加，导致甘油价格下降，因此如何有效利用甘油提高产品附加值成为生物柴油下游产品开发的关键，所以利用生物法将甘油转化为更具附加价值的平台化合物2，3_ 丁二醇将是一个不错的选择，所以本发明对于解决生物柴油副产物粗甘油的综合利用问题提供一种有效的方法。
图1B. subtilis CTCC M2009200流加粗甘油发酵过程曲线
具体实施例方式实施例1
(I)B. subtilis CTCC M2009200 种子培养
从活化平板上挑取单菌落接种于种子培养基中进行种子培养，培养温度37°C，摇床转速160r/min，培养时间为12h左右，种子培养基组成酵母提取物5g/L，胰蛋白胨IOg/ L, NaCl 10g/L ；
(2)B. subtilis CTCC M2009200 发酵培养
初始发酵培养体积为2. 5L，采用的发酵培养基成分如下
粗甘油80g/L，玉米浆 10g/L，尿素 3g/L，柠檬酸钠 6g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4 O. 2g/ L ;将上述发酵培养基用5mol/L的NaOH调节其pH至6. 5，在121°C下高温灭菌30min。
粗甘油水溶液补料液500/600mL ；
将上述培养好的种子液按4%接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37°C，空气流量为120m3/h · m3培养基，搅拌转速为350r/min。定时取样测定细胞浓度、 底物残留量和2，3- 丁二醇生产量，当发酵液中甘油浓度低于15g/L时，流加粗甘油补料液， 使培养液中的甘油的浓度维持在0_20g/L，当甘油消耗速率低于lg/1 -h时，即刻停止发酵。 发酵结束后，0D600达到23. 5,2,3- 丁二醇产量达到70. 2g/L，转化率达到O. 42g/g甘油。
权利要求
1.利用一株安全菌株发酵生物柴油副产物粗甘油生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于以生物柴油副产物粗甘油为底物，利用安全菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CTCCM2009200发酵其生产2，3- 丁二醇。
2.一种用于权利要求1所述用途的发酵培养基，其特征在于发酵培养基由如下组分组成 生物柴油副产物粗甘油80g/L，玉米浆10g/L，尿素3g/L，柠檬酸钠6g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4O. 2g/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体生产方法如下 (DB. subtilis CTCC M2009200 种子培养 挑取平板上保藏的B. subtilis CTCC M2009200单菌落接种于种子培养基中培养12h，种子培养基组成如下 酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，余量为水；(2)B. subtilis CTCC M2009200 发酵培养 将权利要求2所述的发酵培养基用5mol/L的NaOH调节其pH至6. 5，在121°C下高温灭菌30min ； 将上述种子培养液按4%的接种量接种于发酵罐中，发酵温度37°C，空气流量为120m3/h · m3培养基，搅拌转速为350r/min，粗甘油水溶液补料量使培养液中的甘油的浓度维持在0-20g/L,当甘油消耗速率低于lg/L · h时，即刻停止发酵；即获得含有2，3_ 丁二醇的发酵培养液。。
全文摘要
本发明公开了利用一株环境安全菌株Bacillus subtilis CTCC M2009200发酵生物柴油副产物粗甘油生产2，3-丁二醇的方法，属于生物工程中发酵技术领域。该方法主要包括种子培养和发酵培养。具体的说，将种子液按4％接种量接种于发酵培养基中，在37℃，空气流量为120m3/h·m3培养基，搅拌转速为350r/min条件下进行发酵培养，当发酵液中甘油浓度低于15g/L时，流加粗甘油补料液，使培养液中甘油的浓度维持在0-20g/L，当甘油消耗速率低于1g/l·h时，即刻停止发酵，发酵液即为含有2，3-丁二醇液体。本发明为生物柴油副产物粗甘油进行工业化深度开发提供了基础。
文档编号C12P7/18GK103014075SQ20121036063
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者饶志明, 杨套伟, 张显, 徐美娟, 满在伟 申请人:江南大学