专利名称：一种枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的耐酸性改造的制作方法
技术领域：
发明涉及ー种β -甘露聚糖酶耐酸性定点改造的方法，属于分子生物学和基因エ程领域。
背景技术：
β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC 3. 2. 1. 78)是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β_1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖，半乳甘露聚糖及β_甘露聚糖等，β_甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物。 β -甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗营养作用，改善饲料的营养价值，以及配合其他的酶(木聚糖酶、蛋白酶)进ー步提高家畜的生产性能；作为ー种典型的饲料用酶，其需要满足饲料生产以及动物消化系统对酶的性质的特殊要求，但由于动物肠道对pH的要求在PH2. 0左右，而本项目前期对纯化到的β -甘露聚糖酶酶学性质分析表明，其最适pH为pH6. 5，在pH4. 0以下迅速失活，故为了使其pH特性适合饲料用酶对pH的特殊要求，在理性分析其三维结构的的基础上，对β_甘露聚糖酶进行耐酸性的定点改造，以图得到符合エ业化需要的产β_甘露聚糖酶重组菌株。
发明内容
本发明主要研究内容针对来源于枯草芽孢杆菌B. subtilis 6-7(已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCCM 2009200)的β -甘露聚糖酶进行理性分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，经定点改造后的β -甘露聚糖酶基因Mlu I、BamH I双酶切与经同样酶切的表达载体PMA5在T4连接酶的作用下16°C过夜连接，将连接后的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株，成功得到一株重组菌株pMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis168，经发酵纯化后对重组蛋白进行酶学性质分析，其pH由pH6. 5下降到pH5. 5，酶活力也相应的提高6.2%。本发明的技术方案以重组质粒pMA5_manA作为模板，根据设计好的引物及提前设计好的重叠PCR扩增条件和扩增体系进行定点突变，利用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。用PCR回收产物和质粒pMA5进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收双酶切产物，利用T4DNA 连接酶 16 °C 过夜连接重组质粒 PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5-gmuGdlOU PMA5_gmuGel26，用连接产物转化感受态枯草芽孢杆菌168，挑取阳性转化子到10ml液体LB培养基中，37 °C摇床培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20°C保藏备用，S卩成功构建了基因工程菌PMA5-gmuGal76/Bacillus subtilis168、 PMA5-gmuGb54/Baci1lus subtilis 168、 PMA5-gmuGc198/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGdlO 1/Baci 1 lus subtilis 168、PMA5-gmuGe 126/Bacillus subtilis 168。将冻管保藏的基因工程菌分别按1%的接种量转接到10ml液体LB培养基中，37°C摇床培养过夜。次日按2%的接种量转接至50ml液体LB培养基中37°C摇床培养。发酵完成后，将发酵液4°C 8000r/min离心5min后弃上沉淀,将上清通过亲和层析得到纯酶液；分别对纯酶液进行酶学性质的分析，结果表明来自重组菌株PMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis 168的β-甘露聚糖酶其最适pH值有ρΗ6. 5下降到ρΗ5. 5，酶活力升高6.2%。说明对β-甘露聚糖酶耐酸性定点改造成功。本发明的有益效果作为ー种典型的饲料用酶，其需要满足饲料生产以及动物消化系统对酶的性质的特殊要求，但由于动物肠道对pH的要求，为了使甘露聚糖酶更加适合エ业化生产的需要，本发明在理性分析其三维结构的的基础上，对β_甘露聚糖酶进行耐酸性的定点改造，成功构建了ー株产甘露聚糖酶基因工程菌PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilisl68，其最适pH值有ρΗ6· 5下降到ρΗ5· 5，酶活力升高6· 2%，并研究了相应的酶学性质的变化，以便为酶的应用提供实验数据。
图1 重叠 PCR 核酸电泳图 M DL 2000marker 叫、a2, t^、b2, c2, c^、d2, e2 为
重叠PCR产物。图2亲和层析Ni-NTA柱纯化得到纯酶SDS-PAGE电泳图。M Protein Marker ；1 gmuGal7 ；2 gmuGb54 ；3 gmuGcl98 ；4 gmuGdl01 ；5 gmuGel26 ；6 :突变前 β-甘露聚糖酶MANA2a图3突变前后β -甘露聚糖酶最适pH值比较。
图4重组菌株发酵产β_甘露聚糖酶的生长曲线及酶活曲线。
具体实施例方式实施例1 : β -甘露聚糖酶基因的定点突变(1)引物的设计，针对甘露聚糖酶MANA2a在理性分析的基础上，通过重叠PCR技术进行定点突变，利用DNAMAN软件设计引物如下。P1 :5’ -GACGGATCCATGTTTAAGAAACATACGAT-3> (BamH I)P2 :5’ -GGCACGCGTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAACGATTGGCGTTA-3’ (Mlu I)MnF3 :5’ -ATGCCATGCTCAGCGAAATTGC-3’MnR4 :5’ ~CAATTTCGCTGAGCATGG~3，MnF5 5，~ACTGGCTTGCGGACCTGCCGAAC~3’MnR6 :5’ ~TTCGGCAGGTCCGCAAGCCAG~3，MnF7 :5’ ~CTGCATGACATGAACGGCGAATG~3，MnR8 :5’ ~CCATTCGCCGTTCATGTCATGC~3，MnF9 :5’ ~CGATTATGCCGCGGGATGG~3，MnRlO :5’ ~CAAGCCATCCCGCGGCATAATCGC~3，MnFll :5’ ~GATCAGTATAAGCAAATACTAG~3，MnR12 :5’ ~GTATTTGCTTATACTGATC~3，(2)以pMA5_manA2a为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为94°C，2min，1 个循环；94 °C，30s，56 °C，40s，72 °C，lmin 30s, 25 个循环；72°C，lOmin，1 个循环；15°C，10min，l个循环。扩增体系ddH20 17 μ 1，模板2 μ 1、相应的引物各0. 5 μ 1，dNTP Mix 2 μ 1, extaq-buffer 2. 5 μ 1，ex-Taq 酶 0. 5 μ 1，扩增出含相应的突变位点的PCR 产物 gmuGal76(AAA — GAA) ；2 gmuGb54(CAC — GAC) ；3 gmuGcl98 (GAA — GAC) ；4 gmuGdlOl (AGA — GCG) ；5 gmuGel26 (AAA — GCA)；。利用琼脂糖凝胶回收盒对目的基因进行回收，第一次重叠PCR琼脂糖凝胶电泳如图1所示。实施例2 :重组质粒的构建及转化Bacillus subtilis 168构建重组载体PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5_gmuGdl01、PMA5-gmuGel26，将上述实施例⑵中得到的β _甘露聚糖酶基因PCR产物分别与质粒pMA5同时用BamH I和Mlu I双酶切，利用凝胶回收盒回收后进行连接，连接体系目的基因酶切产物7. 5 μ 1，。嫩5酶切产物0.5“ 1，T4DNA连接酶buffer 1 μ 1, T4DNA连接酶1μ 1，16 °C 过夜连接。将连接好的重组质粒 PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5_gmuGdl01、PMA5-gmuGel26 转化到感受态 Bacillus subtilis 168,转化方法挑取Bacillus subtilis 168接种于5ml LB培养，37°C摇床培养过夜；取lOOul过夜培养 的菌液，接种于用50ml离心管配好的5ml SPI培养基中，37°C摇床培养，当菌株生长到对数末期时，快速取200μ 1接种到2ml SPII培养基中，37 °C 100r/min摇床培养1. 5h加20ull00xEGTA溶液，于37°C 100r/min摇床培养lOmin，用1. 5ml离心管分装成500ul每管，分别向管中加入质粒，轻轻摇匀于37°C 100r/min摇床培养30min，将离心管转移到250r/min摇床培养1. 5h,以4000r/min离心收集菌体，弃部分上清，留100 μ 1重悬菌体,涂布于相应的抗性平板，37°C培养过夜，挑取阳性菌落经验证后获得因工程菌株PMA5-gmuGal76/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGb54/Baci1lus subtilis 168、PMA5_gmuGcl98/Bacillus subtilis 168、 PMA5-gmuGdlO1/Bacillus subtilis 168、 PMA5_gmuGel26/Bacillus subtilis 168。实施例3 :重组菌株β -甘露聚糖酶的纯化及耐酸性分析将得到的产β -甘露聚糖酶重组菌株PMA5_gmuGal76/Bacillus subtilis168、 PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilis 168、 PMA5-gmuGc198/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGdlO1/Baci1lus subtilis 168> PMA5-gmuGe126/Bacillus subtilis 168 按 2%的接种量分别接到新的50ml LB液体培养基中，取发酵液，4°C 8000r/min离心5min后弃上沉淀，将上清通过Ni-NTA柱得到纯酶液，取得到的纯酶液10ul加相应的上样Marker作为样品进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE使用5%的分离胶和15%的浓缩胶，采用不连续垂直电泳，用考马斯亮蓝R250染色(如图2)。并对纯化到的β -甘露聚糖酶进行耐酸性分析，结果基因工程菌PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilis 168产β -甘露聚糖酶，其酶活力为226. 23U/mL，相对定点突变前酶活力提高了 6. 2%，且其最适pH由6. 5下降到5. 5 (如图3所示)。实施例4 :重组菌株发酵产β -甘露聚糖酶摇瓶水平上对重组菌株pMA5-gmuGb54/B. subtilis 168产β -甘露聚糖酶的发酵条件进行优化，优化后该菌株的酶活力最高达到1501U/mL，是优化前的6倍以上。在此基础上，进行了 5L发酵罐放大实验的研究，在转速为500r/min，溶氧为lvvm条件下，通过两阶段控温发酵，酶活力最高达到3207. 82U/mL。(如图4所示)
权利要求
1.一种β-甘露聚糖酶耐酸性定点改造，其特征是根据β-甘露聚糖酶三级结构分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，经过定点改造将第54位的组氨酸突变为天冬氨酸后的β -甘露聚糖酶基因连接至表达载体ΡΜΑ5上，将连接后的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株，成功得到一株重组菌株 pMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis 168。
2.对权利要求I中所获得的重组菌种进行发酵，将发酵液离心后上清直接通过Ni-NTA柱纯化，成功的得到了纯的突变型β-甘露聚糖酶，其特征在于对纯化的β-甘露聚糖酶进行了酶学性质的分析，β -甘露聚糖酶最适pH由pH6. 5变为pH5. 5,此酶更适用于在饲料中应用。
3.对上述权利要求I中所述的重组菌株进行β_甘露聚糖酶活力测定，将上述获得的重组菌发酵液离心后，取上清测定β -甘露聚糖酶酶活力，与原始菌株进行比较，其特征是重组菌株PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilis 168 β -甘露聚糖酶酶活力提高6. 2%，经5L发酵罐发酵，通过两阶段控温发酵，酶活力最高达到3207. 82U/mL。
全文摘要
本发明公开了一种β-甘露聚糖酶耐酸性定点改造的方法，其特征是针对一种来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis 6-7(CTCCM 2009200)的β-甘露聚糖酶在理性设计的基础上，通过重叠PCR技术进行定点突变，经定点改造后的β-甘露聚糖酶基因与表达载体pMA5连接，转化枯草芽孢杆菌168菌株，成功获得一株β-甘露聚糖酶耐酸性得到显著提高的重组菌株pMA5-gmuGb54/B.subtilis 168，其相对酶活力提高了6.2％，摇瓶水平酶活为3226.23U/mL，最适pH由6.5下降到5.5，此突变酶更利用应用在饲料工业中。
文档编号C12N15/75GK102952789SQ20121036055
公开日2013年3月6日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者饶志明, 徐美娟, 张显, 刘项羽 申请人:江南大学