专利名称：一种高效表达枯草芽孢杆菌l-天冬酰胺酶的方法
技术领域：
一种高效表达枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的方法，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及ー种L-天冬酰胺酶基因工程菌及其构建方法。
背景技术：
L-天冬酰胺酶(EC 3. 5. I. I)是ー种有抗癌活性的蛋白酶，能专ー催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH315L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓没有抑制作用。L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以 水解天冬酰胺，从源头上減少丙烯酰胺的生成。从1953年Kidd观察到豚鼠血清有破坏Gardner癌细胞的作用，1961年Broom证实豚鼠血清中的抗肿瘤因子为し-天冬酰胺酶，1964年Mashburn等从Escherichia coli中部分提纯了 L-天冬酰胺酶，并证实这种酶也有抗肿瘤因子的作用，2004年Amrein等提出用L-天冬酰胺酶代替其他方法减少食物中丙烯酰胺含量,2009年Hendriksen等研究证明在高温处理食品时加入L-天冬酰胺酶不会产生危害，同时有众多学者通过具体的实验证明L-天冬酰胺酶可以降低炸土豆片、马铃薯干粉、面团等食物中丙烯酰胺的含量。这些研究不仅证明了 L-天冬酰胺酶具有抗癌效果，同时也为临床研究和大量生产创造了条件。ー些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取エ艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产し-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等,但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低,近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为ー个重要来源。L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II, Escherichiacoli、Erwinia chrysanthemi、B. subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酸胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。本发明通过表达载体pMA5,实现了 B. subtilis 6-7L-天冬酰胺酶II (简称ansZ)的高效表达。枯草芽孢杆菌作为安全稳定的エ业生产菌株，培.养条件简单，发酵周期短，成为微生物产L-天冬酰胺酶的潜在菌株。
发明内容
本发明所使用菌种为B. subtilis 6-7，该菌株前期用于发酵葡萄糖合成2，3_ 丁二醇，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为=CTCCM 2009200。本发明的主要研究内容本发明利用分子技术克隆了来自B. subtilis 6-7的L-天冬酰胺酶基因(简称ansZ)，构建重组表达载体pMA5_ansZ，并将其转化B. subtilisl68，成功构建了基因工程菌pMA5-ansZ/B. Subtilisl68。对构建的基因工程菌进行酶活测定，发现重组菌的酶活为22. 4U/mL,出发菌株酶活仅为O. 039U/mL，重组菌酶活较出发菌提高了 574倍。本发明采取的技术方案一种L-天冬酰胺酶基因工程菌，是将出发菌株B. subtilis 6-7L-天冬酰胺酶基因连接在表达载体PMA5上，并转化B. subtilisl68得到的工程菌株。重组菌株构建方法
(I)L-天冬酰胺酶引物设计根据NCBI枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列中ansZ基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR引物Pl和P2。Pl :5’ -GAC GGA TCC ATG AAA AAA CAA CGA ATG CT-3’ (BamH I)P2 :5’ -GGC ACG CGT TTAATA CTC ATT GAAATAAG-3，(Mlu I)(2)重组表达载体pMA5_ansZ的构建参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与PMD18-T vector过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/Mlu I酶切释放出大小为2. 7kb和I. Ikb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为PMD 18-T-ansZ。提取保存于Ε·coli JM109 中的质粒pMD18-T-ansZ和pMA5，质粒pMD18-T-ansZ和pMA5经BamHI/Mlu I双酶切，胶回收纯化，16°C过夜连接，将连接物热击转化E. coli JM109感受态细胞，用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/Mlu I双酶切后释放出大小为7. 2kb和I. Ikb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA5-ansZ。(3)重组质粒 pMA5_ansZ 转化模式菌株 B. subtilisl68 将经验证构建成功的重组质粒pMA5_ansZ用化学转化法转化至模式菌株B. subtilis 168中。转化方法采用改进的Spizizen法。(4)重组菌株B. subtilisl68阳性转化子的筛选挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。(5)重组 B. subtilisl68 酶活测定酶活测定方法采用氨气敏电极测定重组菌L-天冬酰胺酶酶活。本发明的优点和积极效果是(I)本发明探索了枯草芽孢杆菌来源的L-天冬酰胺酶基因在B. subtilisl68中的表达，构建了高产L-天冬酰胺酶的基因工程菌株，适用于工业化的生产和应用，具有一定的理论价值和应用价值。(2)本发明探索L-天冬酰胺酶基因工程菌构建的可操作对象，所构建的工程菌采用枯草芽孢杆菌发酵培养基，发酵所产生的酶活达到22. 4U/mL,比出发菌株高574倍。
图I图I重组质粒pMA5_ansZ示意图。图2质粒pMA5_ansZ的酶切验证。I pMA5-ansZ/BamH I；2 :pMA5_ansZ/BamH I+Mlu I ；3 DNA Marker DL 2000 ；4 DNA Marker λ -Hind III
具体实施例方式结合实施例，对本发明进一步说明。 实施例I :L_天冬酰胺酶引物设计根据NCBI枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列中ansZ基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR引物Pl和P2。Pl :5’ -GACGGA TCC ATG AAA AAA CAA CGA ATGCT-3’ (BamH I)P2 :5，-GGC ACG CGT TTA ATA CTC ATT GAA ATAAG-3’ (Mlu I)实施例2 L-天冬酰胺酶基因的克隆以B. subtilis 6-7总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为94°C预变性，5min，一个循环;94°C变性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，90s，30个循环；72°C，10min，一个循环；15°C，lOmin，一个循环。PCR扩增体系模板2 μ L，上下游引物各
O.5 μ L, dNTP Mix 4 μ L，10 X Ex Taq Buffer 5 μ L，灭菌的双蒸水 37 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶I μ L。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20°C冰箱保存备用。回收产物与pMD18_T Vector连接，连接产物转化E. coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37°C培养过夜，挑取菌落到IOmL液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T_ansZ，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15% 20% (w/v)，-70°C冰箱保藏。实施例3 :重组质粒pMA5_ansZ的构建提取保存于E. coli JM109中的质粒pMD18-T-ansZ和pMA5，并分别用BamH I和MluI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系目的基因酶切产物 μ L，ρΜΑ5酶切产物lyL，T4DNA连接酶buffer lyL,T4 DNA连接酶I μ L，16 °C过夜连接。将连接好的重组质粒pMA5-ansZ转化到感受态E. coil JM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMA5-ansZ，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15% 20% (w/v)，_70°C冰箱保藏备用。实施例4 :重组质粒 pMA5_ansZ 转化 B. subtilisl68挑取B. subtilisl68接种于一支5mL LB液体培养基试管，37°C摇床培养过夜，取100 μ L过夜培养的菌液，接种至用5mL SPI Medium中，37°C摇床培养，5h后开始测OD6tltl,当培养物生长到对数末期时，快速取200 μ L接种到2mL SPII Medium中，37°C 100r/min摇床培养1.5h。加20 μ L 100XEGTA溶液，于37°C 100r/min摇床培养lOmin，用I. 5mL离心管分装成500 μ L每管，向管中加入适量的质粒pMA5_ansZ,轻轻混勻于37°C 100r/min摇床培养30min。将离心管转移到250r/min摇床,37°C养I. 5h, 4000r/min离心收集菌体，弃部分上清液，留100 μ L重悬菌体，涂布于卡那霉素抗性平板，37°C过夜培养，挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌pMA5_ansZ/B. subtilisl68。实施例5 :重组菌pMA5_ansZ/B. subtilisl68L_天冬酰胺酶活力测定(I)将实施例4构建的重组菌pMA5_ansZ/B. subtilisl68，与出发菌株B. subtilis6-7分别接种于IOmL含卡那霉素的LB养基中，37°C振荡培养过夜，次日按4%的接种量转接于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，37°C培养24h，取发酵液于4°C，lOOOOr/min离心lOmin，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。枯草芽孢杆菌发酵培养基大豆蛋白胨10g/L,玉米衆15g/L,尿素3g/L,葡萄糖40g/L，磷酸氢二钾2. 3g/L，磷酸二氢钾I. 7g/L，硫酸镁O. 75g/L，氯化钠5g/L。调节pH6. 8_7· O ο(2) L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺生成NH3，在碱性条件氨气敏电极可以检测出 溶液中NH3含量，根据这一原理，来测定L-天冬酰胺酶的活性。酶活定义在40°C反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺转化为I μ mol顯3所需要的酶量为一个酶活单位。采用25mL测定体系，取两支比色管，一支作为对照，一支为样品管，均加9mL 50mM的Tris-HCl (pH7. 5)，IOmL 50mM的L-天冬酰胺底物，于40°C预热，对照管加入5mL 15%的三氯乙酸，对照管与样品管均加0. 5mL上清液或细胞破碎上清液，40°C反应15min，样品管加入5mL 15%的三氯乙酸终止反应。将反应溶液转入50mL烧杯中并加入高浓度NaOHlmL，于电磁搅拌状态下，用氨气敏电极检测L-天冬酰胺酶酶活。结果表明重组菌pMA5-ansZ/B. subtilisl68表达的L-天冬酰胺酶活为22. 4U/mL，比出发菌株B. subtilis 6-7L-天冬酰胺酶活力提高了 574倍。
权利要求
1.一种重组表达载体pMA5-ansZ,其特征是 通过PCR技术获得来源于B. subtilis 6-7的ansZ基因，与克隆载体pMD18-T相连，获得该基因的大量克隆，经双酶切，片段纯化后与表达载体PMA5连接，获得重组质粒pMA5_ansZ。
2.重组质粒pMA5_ansZ 转化 B. subtilis 168 采用改进的Spizizen法将重组质粒pMA5-ansZ转化B. subtilisl68,挑取阳性菌落,酶切验证，得到 pMA5-ansZ/B. subtilis 168。
3.L-天冬酰胺酶活力检测 将pMA5-ansZ/B. subtilis 168接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中过夜培养，于10000r/min、4°C离心lOmin，上清液为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，采用氨气敏电极检测L-天冬酰胺酶酶活，经检测重组菌酶活为22. 4U/mL，较出发菌约提高574倍。
全文摘要
一种高效表达枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的方法，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明通过PCR技术以B.subtilis 6-7总DNA为模板，扩增获得L-天冬酰胺酶编码基因ansZ，将其连接到表达载体pMA5上，以B.subtilis168为表达宿主，构建L-天冬酰胺酶基因工程菌pMA5-ansZ/B.subtilis168，实现L-天冬酰胺酶的高效表达，该工程菌的酶活为22.4U/mL，较出发菌株提高574倍。
文档编号C12N15/75GK102864163SQ20121036055
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者饶志明, 贾明媚, 徐美娟 申请人:江南大学