专利名称：一种碱性磷酸酶的制取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及到一种碱性磷酸酶提取制备的方法。
背景技术：
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,EC3. I. 3. IAP)是非特异性磷酸单酯酶,可以催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等，还可以催化磷酸基团的转移反应，且大肠杆菌AP还是一种依赖亚磷酸盐的氢化酶。AP存在于除高等植物外几乎所有的生物体内，可直接参加磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。碱性磷酸酶临床上主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸 的鉴别诊断。对于不明原因的高ALP血清水平，可测定同工酶以协助明确其器官来源。在动物饲养和疾病诊断方面，AP是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。在免疫学研究方面，已广泛应用AP标记抗体进行酶联免疫荧光反应(ELISA)和Western印迹分析，即将AP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在，与过氧化物酶相比，AP用作标记酶的优点是稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高、标记困难。在生物化学和分子生物学方面，用AP催化除去DNA分子的5末端磷酸基团以防止载体自连是基因克隆中的常规手段之一。随着科学的发展、科研手段的进步、对AP认识的不断深人，将使AP在科研和临床诊断中发挥更大的作用。在传统工艺中，动物脏器内碱性磷酸酶的提取需加入大量的酸碱，对环境造成较大的污染，因此本发明按照循环经济理念，推进工艺的废物循环，从源头减少废物的产生，实现由末端治理向污染预防和生产全过程控制转变，促进动物脏器等废弃物制备碱性磷酸酶新型生化试剂研发技术开发，控制和减少污染物排放，提高资源利用效率，为动物废弃脏器内碱性磷酸酶的产业化推广提供一定的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提出一种碱性磷酸酶的制取方法，依本工艺可以有效减少环境污染，提高产品的产量和纯度，降低生产成本。I、发明技术方案—种碱性磷酸酶的制取方法，主要通过如下技术方案实现(I)粗酶液的制备动物屠宰废弃脏器剪碎，加Tris-HCl缓冲液匀浆，4°C下搅拌后离心，上清液即为碱性磷酸酶粗酶液；⑵酸沉淀 所得粗酶液，用HAc调至pH，搅拌后离心，沉淀溶于TriS-HCl缓冲液中。加正丁醇搅拌后离心，吸取水层对Tris-HCl缓冲液透析并浓缩；(3) (NH4) 2S04 盐析
用(NH4) 2S04进行分段盐析，沉淀用TriS-HCl缓冲液，溶解并透析；(4) DEAE-Sephacel 柱层析透析液上样于DEAE-S印haceI柱，上样后用NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液透析浓缩备用；(5) ConA-Sepharose 柱层析浓缩液上样于平衡的ConA-Sepharose柱，甲基甘露糖苷洗脱。收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液透析浓缩备用；(6) Sephadex G-200 柱柱层析浓缩液上样于平衡后的S^hadex G-200柱，同一缓冲液洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩备用； (7) GGT免疫亲和层析柱浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱，收集流出液，用Tris-HCl缓冲液透析后置_70°C冻干获得碱性磷酸酶产品。2、发明技术特点(I)采用现代生物技术以动物屠宰副产物肝脏为原料制备新型典型科研用生化试剂碱性磷酸酶，在增加国内市场新型生化试剂供应量的同时，可提高国内动物屠宰副产物资源的综合利用价值。(2)采用先进的提取技术，碱性磷酸酶的回收率高于10%，产品比酶活达到402U/mg以上，纯化倍数达到1297倍以上。(3)所采用的制备工艺具有周期短、生产设备典型、操作工艺简单、成本低、效率闻、广品纯度闻等优点，适合广业化生广。
四
图I :动物脏器内碱性磷酸酶制备工艺流程图
五具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。实施例一(I)粗酶液的制备新鲜猪肾皮质25kg剪碎，加Tris-HCl缓冲液75L (50mmol/L, ρΗ7· 8)，匀浆3min(30sX6)，4°C下搅拌30min,3000Xg离心30min,上清液即为碱性磷酸酶粗酶液。⑵酸沉淀所得粗酶液，用HAc调至ρΗ5· O,搅拌4h, 8000Xg离心30min,沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl缓冲液中。加等体积正丁醇75L，搅拌lh，IOOOXg离心30min,吸取水层对Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并浓缩至1L。(3) (NH4) 2S04 盐析用饱和度30%的(NH4)2SO4沉淀，搅拌30min，6000Xg离心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,搅拌 30min,6000Xg 离心 30min,沉淀用 Tris-HCl 缓冲液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。
(4) DEAE-Sephacel 柱层析透析液上样于Tris-HCl 缓冲液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和O. 02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上样后用 O O. 2mol/L的NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(lOOmmol/L，pH7. 8，含O. lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析浓缩备用。(5) ConA-Sepharose 柱层析浓缩液上样于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 O. lmol/L甲基甘露糖苷洗脱。收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7. 8，含O. ImmoI/L的MgCl2和O. 02mmol/L的ZnCl2)透析浓缩备用。(6) Sephadex G-200 柱柱层析浓缩液上样于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一缓冲液洗脱,收集 碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩备用。 (7) GGT免疫亲和层析柱浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱(IOcmX IOOcm)，收集流出液，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C冻干获得碱性磷酸酶产品，经检测产品比酶活为412U/mg，碱性磷酸酶的回收率为12%，纯化倍数为1302倍。实施例二(I)粗酶液的制备新鲜猪肝脏25kg剪碎，加Tris-HCl缓冲液75L(50mmol/L, ρΗ7· 8)，匀浆3min (30sX6)，4°C下搅拌30min,3000Xg离心30min,上清液即为碱性磷酸酶粗酶液。(2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc调至pH5. 5，搅拌3. 5h，8000 X g离心30min，沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl缓冲液中。加等体积正丁醇75L，搅拌lh，IOOOXg离心30min,吸取水层对Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并浓缩至1L。(3) (NH4) 2S04 盐析用饱和度30%的(NH4)2SO4沉淀，搅拌30min，6000Xg离心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,搅拌 30min,6000Xg 离心 30min,沉淀用 Tris-HCl 缓冲液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和 0. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。(4) DEAE-Sephacel 柱层析透析液上样于Tris-HCl 缓冲液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和0. 02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上样后用 O 0. 2mol/L的NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(lOOmmol/L，pH7. 8，含0. lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析浓缩备用。(5) ConA-Sepharose 柱层析浓缩液上样于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 O. lmol/L甲基甘露糖苷洗脱。收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7. 8，含O. ImmoI/L的MgCl2和O. 02mmol/L的ZnCl2)透析浓缩备用。(6) Sephadex G-200 柱柱层析
浓缩液上样于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一缓冲液洗脱,收集碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩备用。(7) GGT免疫亲和层析柱浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱(IOcmX 100cm)，收集流出液，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C冻干获得碱性磷酸酶产品，经检测产品比酶活为405U/mg，碱性磷酸酶的回收率为11%，纯化倍数为1305倍。实施例三(I)粗酶液的制备猪小肠洗净，取其25kg粘膜剪碎，加Tris-HCl缓冲液75L (50mmol/L，pH7. 8)，匀衆3min(30sX6)，4°C下搅拌30min,3000Xg离心30min,上清液即为碱性磷酸酶粗酶液。 (2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc调至pH5. 0，搅拌3. 5h，8000 X g离心30min，沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl缓冲液中。加等体积正丁醇75L，搅拌lh，IOOOXg离心30min,吸取水层对Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并浓缩至1L。(3) (NH4) 2S04 盐析用饱和度30%的(NH4)2SO4沉淀，搅拌30min，6000Xg离心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,搅拌 30min,6000Xg 离心 30min,沉淀用 Tris-HCl 缓冲液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。(4) DEAE-Sephacel 柱层析透析液上样于Tris-HCl 缓冲液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和0. 02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上样后用 O 0. 2mol/L的NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(lOOmmol/L，pH7. 8，含0. lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析浓缩备用。(5) ConA-Sepharose 柱层析浓缩液上样于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 0. lmol/L甲基甘露糖苷洗脱。收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7. 8，含0. ImmoI/L的MgCl2和0. 02mmol/L的ZnCl2)透析浓缩备用。(6) Sephadex G-200 柱柱层析浓缩液上样于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一缓冲液洗脱,收集碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩备用。 (7) GGT免疫亲和层析柱浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱(IOcmX 100cm)，收集流出液，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C冻干获得碱性磷酸酶产品，经检测产品比酶活为415U/mg，碱性磷酸酶的回收率为11. 5%，纯化倍数为1301倍。实施例四(I)粗酶液的制备新鲜猪肾皮质25kg剪碎，加Tris-HCl缓冲液75L (50mmol/L, ρΗ7· 8)，匀浆3min(30sX6)，4°C下搅拌30min,3000Xg离心30min,上清液即为碱性磷酸酶粗酶液。(2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc调至pH4. 8，搅拌3. 5h，8000 X g离心30min，沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl缓冲液中。加等体积正丁醇75L，搅拌lh，IOOOXg离心30min,吸取水层对Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并浓缩至1L。(3) (NH4) 2S04 盐析用饱和度30%的(NH4)2SO4沉淀，搅拌30min，6000Xg离心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,搅拌 30min,6000Xg 离心 30min,沉淀用 Tris-HCl 缓冲液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。(4) DEAE-Sephacel 柱层析透析液上样于Tris-HCl 缓冲液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和
O.02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上样后用 O O. 2mol/L的NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(lOOmmol/L，pH7. 8，含
0.lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析浓缩备用。(5) ConA-Sepharose 柱层析浓缩液上样于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 0. lmol/L甲基甘露糖苷洗脱。收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7. 8，含0. ImmoI/L的MgCl2和O. 02mmol/L的ZnCl2)透析浓缩备用。(6) Sephadex G-200 柱柱层析浓缩液上样于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一缓冲液洗脱,收集碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩备用。(7) GGT免疫亲和层析柱浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱(IOcmX 100cm)，收集流出液，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C冻干获得碱性磷酸酶产品，经检测产品比酶活为408U/mg，碱性磷酸酶的回收率为13%，纯化倍数为1298倍。
权利要求
1.一种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为(1)粗酶液的制备动物屠宰废弃脏器剪碎，加TriS-HCl缓冲液匀浆，4°C下搅拌后离心，上清液即为碱性磷酸酶粗酶液；(2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc调至pH，搅拌后离心，沉淀溶于Tris-HCl缓冲液中。加正丁醇搅拌后离心，吸取水层对Tris-HCl缓冲液透析并浓缩；⑶(MM)2SO4盐析用(MM)2SO4进行分段盐析，沉淀用Tris-HCl缓冲液,溶解并透析；(4) DEAE-Sephacel柱层析透析液上样于DEAE-Sephacel柱，上样后用NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl缓冲液透析浓缩备用；(5) ConA-Sepharose柱层析浓缩液上样于平衡的ConA-Sepharose柱，甲基甘露糖苷洗脱。收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris-HC I缓冲液透析浓缩备用；(6) SephadexG-200柱层析浓缩液上样于平衡后的Sephadex G-200柱，同一缓冲液洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩后备用；(7) GGT免疫亲和层析柱浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱，收集流出液，用Tris-HCl缓冲液透析后置_70°C冻干获得碱性磷酸酶产品。
2.如权利要求I所述的ー种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为步骤(I)动物屠宰废弃脏器可以为肝脏、肾脏、小肠等。
3.如权利要求I所述的ー种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为步骤(2)酸沉淀中HAc调至粗酶液pH至4. 5-6. 0，搅拌3 4h，正丁醇的加入量为等体积。
4.如权利要求I所述的ー种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为步骤(3)(NH4) #04盐析中盐析梯度为30%-80%,溶解沉淀用缓冲液为含O. lmmol/L的MgCl2和O. 02mmol/L ZnCl2的 10mmol/L，pH7. 8 的 Tris-HCl 缓冲液。
5.如权利要求I所述的ー种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为步骤(4)DEAE-Sephacel柱层析中NaCl梯度洗脱浓度为O O. 2mol/L，所用Tris-HCl缓冲液中含O.lmol/L 的 NaCl、0. lmmol/L MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl20
6.如权利要求I所述的ー种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为步骤(5)、(7)所用Tris-HCl 缓冲液中含 O. lmmol/L MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl20
7.如权利要求I所述的ー种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为碱性磷酸酶的回收率高于10%，产品比酶活达到402U/mg以上，纯化倍数达到1297倍以上。
全文摘要
本发明涉及一种碱性磷酸酶的制取方法，关键步骤为将动物屠宰后的废弃脏器经绞碎离心后获得碱性磷酸酶粗酶液，再采用酸沉、盐析、柱层析、透析、真空冷冻干燥等一系列工艺，最后得到碱性磷酸酶，其比酶活达到402U/mg以上。本发明制取的碱性磷酸酶的回收率高于10％，纯化倍数达到1297倍以上，整个工艺具有周期短、生产设备典型、操作工艺简单、成本低、效率高、产品纯度高等优点，适合产业化推广。
文档编号C12N9/16GK102839162SQ20121036149
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者王福华 申请人:西藏俪阳科技有限公司