一种蜂蜜中雷公藤次碱的检测方法
【专利摘要】本发明涉及蜂蜜中雷公藤生物碱检测领域，尤其涉及一种蜂蜜中雷公藤次碱的检测方法。该方法包括以下的步骤：1）标准溶液的配制，2）试样制备，3）提取，4）净化，5）色谱条件，6）质谱条件；本发明建立了一种固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测蜂蜜中雷公藤次碱的分析方法。样品用水溶解后经固相净化小柱，经HypersilGOLDC18柱（50mm×2.1mm,1.9um）分离，电喷雾离子源正离子多反应监测（SRM）模式串联质谱进行检测，外标法定量。考察并优化了试样溶解溶剂、净化方法、色谱和质谱条件等。本方法快速、灵敏、准确，适用于蜂蜜中雷公藤相关物质残留的定性、定量检测。
【专利说明】一种蜂蜜中雷公藤次碱的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蜂蜜中雷公藤生物碱检测领域，尤其涉及一种蜂蜜中雷公藤次碱的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 蜂蜜作为一种传统的天然保健食品，主要是由蜜蜂采集植物花蜜、植物活体分泌 物或在植物活体上吮吸养分的昆虫分泌物贮存在巢脾内，并经蜜蜂体内特有物质结合充分 酿造、转化、脱水、储藏，留待成熟后的天然甜性物质。蜜蜂如果采集有毒植物的花粉酿成 蜜，蜂蜜就会混进有毒物质。
[0003] 《GB 14963-2011食品安全国家标准蜂蜜》3. 1蜜源要求：蜜蜂采集植物的花蜜、 分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于雷公藤（Tripterygium wilfordi Hook. F.)、博落回 [Macleaya cordata(Willd.) R. Br]、狼毒（Stelera chamaejasme L.)等有毒蜜源植物。
[0004] 有关研究发现，雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook. f.)主要杀虫活性成分为 雷公藤生物碱，该类生物碱对多种害虫有较强的拒食和毒杀作用，对小菜蛾、菜青虫及二化 螟等鳞翅目害虫尤为明显，其中以雷公藤次碱的活性最为突出。
[0005] 目前对雷公藤次碱的分析方法由《农药》第44卷第4期2005年4月公开的雷公 藤次碱的高效液相色谱分析方法，该方法采用高效液相色谱法，乙腈+〇. 〇2mol/L磷酸二氢 钾水溶液（50+50)作为流动相，流速为lml/min，C18反相色谱柱，紫外检测波长为195nm， 用外标法对提取物中的雷公藤次碱进行了定性定量分析，方法的变异系数为0. 24%，线性 相关系数为〇. 9995,平均回收率为99. 8%。
[0006] 但是在蜂蜜中进行雷公藤次碱的检测方法还没有公开报道过，本发明固相萃取净 化-超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱联用方法雷公藤次的检测方法，为蜂蜜的质量 控制提供了检测手段。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供固相萃取净化-超高效液相色 谱-电喷雾电离串联质谱联用测定蜂蜜中雷公藤次碱的分析方法，本方法快速、灵敏、准 确，适用于蜂蜜中雷公藤相关物质残留的定性、定量检测。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0009] -种蜂蜜中雷公藤次碱的检测方法，该方法包括以下的步骤：
[0010] 1)标准溶液的配制
[0011] 标准储备液：称取雷公藤次碱标准品IOmg (精确至0. Img)置于IOOmL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成l〇〇mg/L的标准储备液；
[0012] 标准中间液：准确移取ImL标准储备液置于IOOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成I. 〇mg/L的混合标准中间液；
[0013] 标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，用甲醇一水（1:1 ;v/v)稀释成 0? 01ng/mL、0. 02ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL的标准工作溶液。
[0014] 各种标准溶液避光保存于4°C冰箱中；
[0015] 2)试样制备
[0016] 对未结晶的蜂蜜将其用力搅拌均匀，对有结晶析出的蜂蜜可将样品瓶盖塞紧后， 置于不超过60°C的水浴中温热，待样品全部融化后搅拌，迅速冷却至室温，在融化时必须防 止水分挥发；
[0017] 3)提取
[0018] 称取试样2. Og,精确至0? Olg,于15mL具盖离心管中，加入IOmL水，采用超声、力口 热或漩涡方式使其溶解，待净化；
[0019] 4)净化
[0020] 移取试样提取液于固相净化小柱中，使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化，弃去流 出液，然后用5mL体积比为1:1的甲醇/水溶液淋洗小柱，弃去流出液，最后用5mL乙腈洗 脱，收集洗脱液于带刻度离心管中，氮吹浓缩至近干，最后用体积比为1:1的甲醇/水溶液 定容至2mL，混匀后经0. 22 y m有机相滤膜过滤后用于上机分析；
[0021] 5)色谱条件
[0022] 色谱柱：Hypersil GOLD C18 柱，50mmX 2. lmm, I. 9um ;柱温：35°C;进样量：2uL ;流 速：0. 25mL/min ;流动相：A为水溶液，B为含0. 15%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱程序：0? 2. Omin, 70 % A ;2. 0 ?5. Omin, 70 % A ?5 % A ;5. 0 ?10. Omin, 5 % A ;10. 1 ?14. Omin， 70% A ；
[0023] 6)质谱条件
[0024] 扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：+3500V ;鞘气： 30arb ;辅助气：10arb ;毛细管温度：350°C ;蒸发温度：30(TC ;碰撞气：氩气；SRM监测离子 对：868. 468/206. 022、868. 468/178. 028 ;S-Lens 电压：155V ;碰撞电压：41V:54V ;保留时 间为 6. 17min。
[0025] 本发明建立了一种固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测蜂蜜中 雷公藤次碱的分析方法。样品用水溶解后经固相净化小柱，经Hypersil GOLD C18柱 (50mmX2. lmm, I. 9um)分离，电喷雾离子源正离子多反应监测（SRM)模式串联质谱进行检 测，外标法定量。考察并优化了试样溶解溶剂、净化方法、色谱和质谱条件等。结果表明：雷 公藤次碱在0.01ng/mL-20 ng/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数大于0.998。该方 法检出限（S/N>10)为0? 01ng/kg，在0? 01ug/kg、0. 05ug/kg和0? 5ug/kg添加水平的回收率 为76% -96%，相对标准偏差（RSD，n = 6)小于10%。本方法快速、灵敏、准确，适用于蜂 蜜中雷公藤相关物质残留的定性、定量检测。
【具体实施方式】
[0026] 1实验部分
[0027] I. 1仪器与试剂
[0028] Ultimate 3000超高效液相色谱一TSQ Vantage三重四极杆串联质谱联用仪（美 国Thermo Scientific公司）；MS 3 digital漩润混合器（德国IKA公司）；MD 200氮吹仪 (杭州奥盛仪器有限公司）。
[0029] 雷公藤次碱（彡98%)购自南通飞宇生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色 谱纯，氯化钠、无水硫酸镁均为分析纯；HLB固相萃取小柱：500mg，6mL (美国Waters公司）。
[0030] 1. 2标准溶液的配制
[0031] 标准储备液：称取雷公藤次碱标准品IOmg (精确至0. Img)置于IOOmL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成l〇〇mg/L的标准储备液；
[0032] 标准中间液：准确移取ImL标准储备液置于IOOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成I. 〇mg/L的混合标准中间液；
[0033] 标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，用甲醇一水（1:1 ;v/v)稀释成 0? 01ng/mL、0. 02ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL的标准工作溶液。
[0034] 各种标准溶液避光保存于4°C冰箱中。
[0035] 1. 3试样制备
[0036] 对未结晶的蜂蜜将其用力搅拌均匀，对有结晶析出的蜂蜜可将样品瓶盖塞紧后， 置于不超过60°C的水浴中温热，待样品全部融化后搅拌，迅速冷却至室温。在融化时必须防 止水分挥发。
[0037] 1. 4 提取
[0038] 称取试样2. Og (精确至0. Olg)于15mL具盖离心管中，加入IOmL水，采用超声、力口 热及漩涡等方式使其溶解，待净化。
[0039] 1. 5 净化
[0040] 移取试样提取液于固相净化小柱（使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化）中，弃去 流出液，然后用5mL甲醇/水（1/1 :V/V)溶液淋洗小柱，弃去流出液，最后用5mL乙腈洗脱， 收集洗脱液于带刻度离心管中，氮吹浓缩至近干，最后用甲醇/水（1/1 :V/V)定容至2mL， 混匀后经0. 22 y m有机相滤膜过滤后用于上机分析。
[0041] 1.6色谱条件
[0042] 色谱柱：Hypersil GOLD C18 柱（50mmX2. lmm, I. 9um);柱温：35°C ;进样量：2uL ; 流速：0. 25mL/min。流动相：A为水溶液，B为含0. 15%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序： 0 ?2. Omin, 70% A ;2. 0 ?5. Omin, 70% A ?5% A ;5. 0 ?10. Omin，5% A ; 10. 1 ?14. Omin， 70% A0
[0043] 1. 7质谱条件
[0044] 扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测（SRM);电喷雾电压（Spray voltage) :+35〇OV ;鞘气（Sheath gas pressure) :3〇arb ;辅助气（Auxiliary gas flow) :IOarb ;毛细管温度（Capillary Temperature) :350 °C ;蒸发温度（Vaporizer Temperature) :300°C ;碰撞气：気气（I. 5mtorr)。SRM 监测离子对：868. 468/206. 022(定 量）、868. 468/178. 028 ;S-Lens 电压：155V ;碰撞电压 41V:54V ;保留时间为 6. 17min。
[0045] 2结果与讨论
[0046] 2. 1前处理条件的优化
[0047] 采用各取IOmL水、水-甲醇（9:1，V/V)、水-甲醇（8:2, V/V)、水-甲醇（7:3, V/ V)、水-甲醇（6:4, V/V)、水-甲醇（5:5, V/V)溶解样品。结果表明上述溶液均能较好的溶 解试样，水的比例越高，过固相净化小柱的阻力越小，同时考虑环境因素，因此采用水作为 试样溶解液。根据试样和测定目标物的性质，考察了 HLB、PSA、C18、NH4、MAX等5种固相萃 取净化小柱的净化效果和回收效率。试验表明：HLB固相萃取净化小柱对目标物的净化效 果和回收率达到满意结果。采用5mL甲醇-水（1:1，V/V)混合溶液作为淋洗液，能较好的 除去保留在小柱中的色素。试验比较了甲醇和乙腈洗脱目标物的能力，结果表明乙腈能力 优于甲醇。
[0048] 综上所述，本文采用水溶解试样后上HLB固相萃取小柱，甲醇-水（1:1，V/V)淋 洗，最后用乙腈洗脱。
[0049] 2. 2色谱条件的优化
[0050] 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、酸化甲醇-水、酸化乙腈-水等流动相对雷公藤 次碱目标分析物的分离效果。结果表明，以酸化甲醇-水溶液为流动相，采用梯度洗脱，目 标物的分离度和峰形较好。
[0051] 2.3质谱条件的优化
[0052] 将雷公藤次碱标准品溶液采用流动注射直接进样，通过全扫描确定化合物母离 子，再对母离子进行二级质谱扫描，得到碎片离子，通过优化S-Lens、碰撞能量（Collision Energy)等参数进行优化，得到二级质谱图。
[0053] 分别考察电喷雾电离源（ESI)的正离子和负离子模式和大气压力化学电离源 (APCI)的正离子和负离子模式四种电离方式，试验表明，目标物在电喷雾电离源（ESI)的 正离子模式下最佳。
[0054] 通过多反应离子监测（SRM)选择相对丰度较高的离子对，确定为定量和定性离子 对。同时，优化S-Iens电压、碰撞电压等参数。
[0055] 2. 4基质效应
[0056] 取空白蜂蜜样品按本文1. 4和1. 5节进行前处理得到的上机分析液为标准溶液的 稀释液，以各组分的峰面积对质量浓度绘制基质加标标准曲线，将其斜率与标准品的标准 曲线的斜率相比，斜率为80% -120%。结果表明经过净化处理后对各目标测定物的基质效 应影响不明显。
[0057] 2. 5方法的线性范围和检出限
[0058] 配制一系列不同浓度的标准工作溶液（0? 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10、 20ng/mL)，并依次进样，分别以雷公藤次碱的峰面积Y为纵坐标，以相应的浓度值为横坐 标，作标准曲线，结果表明，目标物在〇.〇1?20ng/mL范围内其浓度与峰面积呈良好的 线性关系，线性关系方程为Y = -166. 356+14146. 4*X，相关系数r大于0. 998。以实际检 测时的信噪比（S/N>10)确定方法检出限为0.01ug/kg。
[0059] 2.6方法的回收率和精密度
[0060] 在〇? 01ug/kg、0. 05ug/kg和0? 5ug/kg三个添加水平下进行空白加标回收率试验， 每个水平重复6次，结果见表1。0. 01ug/kg添加水平时目标物的回收率为76% -92%，RSD 为9% ;0. 05mg/kg添加水平时目标物的回收率为82% -96%，RSD为7% ;0. 5mg/kg添加水 平时目标物的回收率为77% -85%，RSD为5%，均符合残留检测的要求。
[0061] 表1方法的平均回收率和相对标准偏差（n = 6)
[0062]
【权利要求】
1. 一种蜂蜜中雷公藤次碱的检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤： 1) 标准溶液的配制 标准储备液：称取雷公藤次碱标准品10 mg,精确至0.1 mg,置于100 mL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成100 mg/L的标准储备液； 标准中间液：准确移取1 mL标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成1. 〇mg/L的混合标准中间液； 标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，用甲醇一水，体积比为1:1，稀释成 0. 01 ng/mL、0. 02 ng/mL、0. 1 ng/mL、0. 2 ng/mL、0. 5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的标准工作溶液； 各种标准溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 试样制备 对未结晶的蜂蜜将其用力搅拌均匀，对有结晶析出的蜂蜜可将样品瓶盖塞紧后，置于 不超过60°C的水浴中温热，待样品全部融化后搅拌，迅速冷却至室温，在融化时必须防止水 分挥发； 3) 提取 称取试样2.0 g，精确至0.01 g，于15 mL具盖离心管中，加入10 mL水，采用震荡、超 声、加热或漩涡方式使其溶解，待净化； 4) 净化 移取试样提取液于固相净化小柱中，使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水活化，弃去流出 液，然后用5 mL体积比为1:1的甲醇/水溶液淋洗小柱，弃去流出液，最后用5 mL乙腈洗 脱，收集洗脱液于带刻度离心管中，氮吹浓缩至近干，最后用体积比为1:1的甲醇/水溶液 定容至2 mL，混匀后经0. 22Mm有机相滤膜过滤后用于上机分析； 5) 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD C18 柱，50_X2. lmm, 1. 9um ;柱温：35°C ;进样量：2uL ;流速： 0. 25 mL/min ;流动相：A为水溶液，B为含0. 15%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱程序：0? 2. Omin，70%A ;2. 0 ?5. 0 min，70%A ?5%A ;5. 0 ?10. 0 min，5% A ;10. 1 ?14. Omin，70%A ; 6) 质谱条件 扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：+3500 V;鞘气：30 arb; 辅助气：10 arb ;毛细管温度：350°C ;蒸发温度：30(TC ;碰撞气：氩气；SRM监测离子对： 868. 468/206. 022、868. 468/178. 028 ;S-Lens 电压：155 V ;碰撞电压：41V:54V;保留时间为 6. 17 min〇
【文档编号】G01N30/88GK104407081SQ201410402202
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】雷美康, 彭芳, 吴晓勤, 祝子铜, 徐佳文 申请人:衢州出入境检验检疫局综合技术服务中心