用于结合人源β-微球蛋白的核酸适体的制作方法
【专利摘要】本发明公布了β-微球蛋白有高特异性和高亲和力的短链核苷酸适体及其筛选方法。本发明提供的核酸适体包括序列表序列1至序列10中任一所示核酸的DNA片段。其制备方法包括：设计并合成随机单链核苷酸库，筛选β-微球蛋白的核苷酸适体。利用本发明的核酸适体，对结合靶标的鉴定，将有利于β-微球蛋白的快速测定。
【专利说明】用于结合人源β-微球蛋白的核酸适体
【技术领域】
[0001]本发明总体涉及核酸适体，并且更具体的涉及与人源Beta2_微球蛋白结合的核酸适体及其筛选方法。
【背景技术】
[0002]Beta2-微球蛋白广泛存在于血液、脊椎液、唾液和尿液中，是细胞表面主要组织相容性抗原MHC-1的主要成份，MHC-1分子几乎存在于除红细胞外所有细胞的表面[1’2]。测定血清或血浆中的beta2_微球蛋白含量有助于临床上确定细胞免疫系统的生物活性和肿瘤标志物的活性。
[0003]beta-微球蛋白分子量为12，000，它由多个beta-片层的结构域构成的球状结构，本身不具有过膜的结构域，是构成MHC-1型分子的四个亚基之一，起着维持MHC-1分子表面与多肽结合部位结构的作用，但本身不参与结合。
[0004]微球蛋白在人体免疫过程中起着极其重要的作用，它由淋巴系统合成，同时它也是细胞表达MHC-1的必须条件。beta-微球蛋白缺失的突变小鼠，在细胞表面几乎检测不到MHC-1分子，而没有了 MHC-1的参与，CD8细胞就不能分化成熟，没有CD8亚型的T细胞，人体就不可能获得对入侵抗原的免疫性，因此它涉及了体内重要的免疫过程。
[0005]除了可构成MHC-1类表面分子外，beta2微球蛋白还可参与形成其它I型的分子，如⑶I和Qa分子。此外，它还可与HFE蛋白一起，参与调节铁进入小肠的胞饮作用，这一功能的缺省可导致铁的过量和血色病。
[0006]在临床诊断中，长期血透的病人，其beta2_微球蛋白可在关节腔聚集成淀粉样纤维，可引起透析相关性淀粉样病变。
[0007]尿液中的beta2_微球蛋白含量，由肾小球和肾小管重吸收，因此尿液中的beta2_微球蛋白含量指示了肾性过滤的紊乱。血尿中beta2_微球蛋白的含量在临床诊断中可以揭示多种疾病[3]。在正常人血清中beta2微球蛋白的浓度低于2.5mg/L，老年人则低于3.5mg/L ;尿液中的含量在0-0.3mg/L。而在(I)恶性肿瘤中，如肝癌、胰腺癌、胆癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宫体腺癌、结(直)肠癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤及百血病等血清和尿中的beta2-微球蛋白水平均有明显升高，可作为恶性肿瘤病情监测的一项指标。其它可引起beta2_微球蛋白水平升高的还有(2)肾疾病、急慢性肾盂肾炎高[4]、狼性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭的血、尿中beta2_微球蛋白水平均升高；(3)系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、白癜风、荨麻疹、带状疱诊、艾滋病血中beta2-微球蛋白水平均升高；(4)肾性排斥反应尿中beta2_微球蛋白水平升高；(5)其他疾病，如糖尿病肾病、妊高症、急慢性肝炎、流行性出血热等血中beta2_微球蛋白水平升高ω ;淋巴管疾病，(6)外周血管疾病[5]。因此，测定血液或尿液中微球蛋白的含量，可以帮助诊断这些疾病的进程。
[0008]核酸适体是由Gold实验室在1990年发明的，他们通过一个现在称为SELEX的过程，得到了可与T4DNA聚合酶结合的RNA分子，这是最早发现的适体分子。两年后，绍斯塔克实验室和Gilead Scienees公司，用类似的方法得到了可与有机染料分子和人凝血酶结合的单链DNA适体。目前DNA或RNA核酸适体已经广泛用于制备不同的生物活性物质[6][7]
[8]，其中包括溶菌酶[9]，凝血酶_，人艾滋病毒反式作用原件(HIVTAR)[11]，血红素[12]，干扰素[13]，血管内皮生长因子(VEGF)[14]，多巴胺[15]。随着核酸适体制备技术的不断改进，Gold领导的SomaLogic公司己经将单一适体的研发时间从六个星期缩减到三天的时间。
[0009]核酸适体的制备过程简单而言，就是从人为设计、合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的一系列具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸。这些合成的寡核苷酸分子在特定的缓冲体系下，可以借助氢键、范德华力、疏水作用等分子内作用力形成不同的三维空间结构，如发夹结构(Hairpin)、假结(pseudoknot)、G-四分体(G-quartet),然后与标革巴分子识别并结合，剔除未结合序列，保留结合序列，并通过聚合酶链式反应指数级放大结合核酸适体的数量，并通过反筛竞争法除去不结合或弱结合的适体分子，经过几轮或者十几轮的筛选，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。这一过程现在被称之为核酸适体的SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Expotential Enrichment)指数富集的配体系统进化筛选过程，其基本原理是利用人工合成的寡核苷酸库与标靶分子孵育的结合能力强弱，达到强者富集的 结果。
[0010]与抗体相比，核酸适体具有诸多不可替代的优点:靶分子范围更广泛，从小的金属离子到剧毒分子、甚至完整的细胞等都可以作为筛选的标靶；高亲和力和高特异性；通过化学方法合成，易保存，不易受生物污染或降解；无免疫原性；组织渗透性强；容易进行化学修饰等。核酸适体的药用价值也正在被发现。2004年最早由美国食品和药物管理局(FDA)批准用于OSI制药公司的治疗老年性黄斑变性(AMD)的核酸适体药物Macugen上市。此外，其它用于治疗急性病和慢性病的适体药物也E处于临床试验中，如用于治疗急性冠脉综合征(ACS)和血管性血友病因子(vWF)拮抗剂(ARC1779)在2007年年底开始二期临床试验。
[0011]在临床诊断领域，更多的适体正在不断地开发出来，如埃林顿实验室和科罗拉多SomaLogic公司正在开发为用于血浆蛋白分析诊断的适体组，他们称之为适体的血浆蛋白质组学。这项技术用适体芯片，一次分析多个血浆的蛋白组分的含量变化，用于区别、诊断患者的疾病与健康状态。
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[0015][4]Salvaggio E., et al,, (1988)Beta 2 microglobulin in the diagnosis ofreflux nephropathy in childhood.Pediatr Med Chir.1988 10:83-8.[0016][5]美国专利(2011)Beta-2 microglobulin as a biomarker for peripheralartery disease US patent7, 867, 719.[0017][6] Neves, M.A.D.；0.Reinstein, M.Saad, P.E.Johnson (2010)." Definingthe secondary structural requirements of a cocaine-binding aptamer by athermodynamic and mutation study".Biophys Chem 153:9-16.[0018][7]Baugh, C.；D.Grate, C.Wilson(2000)." 2.8 angstrom crystal structureof the malachite green aptamer.".J.Mol.Biol.301:117-128..[0019][8]Dieckmann，T.；E.Fujikawa, X.Xhao, J.Szostak,J.Feigon(1995)." Structural Investigations of RNA and DNA aptamers inSolution".Journal of Cellular Biochemistry:56-56.[0020][9] Potty, A.；K.Kourentzi , H.Fang，G.Jackson，X.Zhang, G.Legge，R.Willson(2009)." Biophysical Characterization of DNA Aptamer Interactionswith Vascular Endothelial GrowthFactor.".Biopolymers 91:145-156.[0021][10]Long, S.；M.Long, R.White, B.Sullenger (2008)." Crystal structure ofan RNA aptamer bound to thrombin".RNA 14:2504-2512.[0022][11] Darf eui lie, F.； S.Rei gadas , J.Hansen, H.0rum, C.Di Primo ,J.Toulme (2006)." Aptamers targeted to an RNA hairpin show improved specificitycompared to that of complementary oligonucleotides.".Biochemistry 45:12076-12082.[0023][12]Liu，M.；T.Kagahara, H.Abe，Y.1to (2009)." Direct In Vitro Selectionof Hemin-BindingDNA Aptamer with Peroxidase Activity".Bulletin of the ChemicalSociety of Japan 82:99-104.[0024][13]Min，Κ.;M.Cho，S.Han, Y.Shim，J.Ku，C.Ban (2008)." A simple anddirect electrochemical detection of interferon-gamma using its RNA and DNAaptamers.".Biosensors & Bioelectronics 23:1819-1824.PMID 18406597.[0025][14] Ng, E.W.M ；D.T.Shi ma，P.Calias，E.T.Cunningham，D.R.Guyer,A.P.Adamis (2006)." Pegaptanib,a targeted ant1-VEGF aptamer for ocular vasculardisease.".Nature Reviews Drug Discovery 5:123-132.[0026][15]Walsh, R.；M.DeRosa (2009)." Retention of function in the DNAhomolog of the RNAdopamine aptamer.".Biochemical andBiophysical ResearchCommunications 388:732-735.
【发明内容】
[0027]1.本发明的第一目的在于提供具有高亲和力的beta2_微球蛋白的核酸适体。
[0028]2.本发明的第二目的`在于提供beta2_微球蛋白的核酸适体的制备方法。
[0029]3.所述的beta2_微球蛋白核酸适体的核心序列如下:
[0030]YZMG003:
[0031]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGCGGGAGGCGGTCCCTGGGTGCT AGTGTGCAGCCAAGCTT-3’:
其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列I ;
[0032]YZMG004:
[0033]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGCGACGGACCGTGTGTGTGGGGT AGTGTGCAGCCAAGCTT-3’:
其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列2 ；
[0034]YZMG006:
[0035]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGGGCAGGGGGCTCATGCGGGGT AGTGTGCAGCCAAGCTT-3’:其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列3 ；[0036]YZMGOO10:
[0037]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGCGGGGGCGGGGGTCGGCATCAT AGTGTGCAGCCAAGCTT-3’:
其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列4 ；
[0038]YZMGOO11:
[0039]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGCCGG6GGTCAGTTGGCGGGGTC AGTGTGCAGCCAAGCTT-3，；其
中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列5 ；
[0040]YZMGOO12:
[0041]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGGCGGCGGTCTAGTGTGGGGCCC AGTGTGCAGCCAAGCTT-3，:其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列6 ；
[0042]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGACCAGGGCGCCCATTGCCGTT AGTGTGCAGCCAAGCTT-3、其中
加粗下划线的为目标序列，见序列表序列7 ；
[0043]YZMGOO14:
[0044]5-GGATCCTACGGTACTTCG GCATGTCGGGGAGTTGACCGTCGCG AGTGTGCAGCCAAGCTT-3’:
其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列8 ；
[0045]ΥΖΜ00015:
[0046]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGCGGGAGGGCACGGTCGACTCGT AGTGTGCAGCCAAGCTT-3’:
其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列9 ；
[0047]YZMGOO17:
[0048]5-GGATCCTACGGTACTTCG GGGGCAGCGTATTCGACCCCTGGAT AGTGTGCAGCCAAGCTT3’ ;其中加粗下划线的为目标序列，见序列表序列10 ；
[0049]4.还可将上述核酸适体进行修饰和改造，所得的核酸适体衍生物具有相同功能的核酸适体衍生物可为:
[0050]a)将所述核酸适体删除部分或增减部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体相同功能的核酸适体衍生物，如G->C，A->T等。
[0051]b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0052]c)将所述的核酸适体骨架改造，如硫代磷酸酯骨架等，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
[0053]5.所筛选的方法步骤具体如下:
[0054]①建立随机的DNA文库，ss DNA的长度为25个碱基，文库的两端可包含任意的核酸序列。
[0055]②所述的起始文库与beta2_微球蛋白偶联的Epoxy-activated Sepharose6B进行孵育，去除非结合的序列，得到与beta2_微球蛋白结合的核酸序列。
[0056]③将上述得到的核酸适体序列与牛血清蛋白BSA偶联的Epoxy-activatedSepharose6B孵育，去除结合的核酸序列，得到不与Epoxy-activated Sepharose6B结合的核酸序列。
[0057]④经过反复的循环后，得到与beta2_微球蛋白特异性结合的核酸适体。
[0058]6.所述步骤②中，还包括如下步骤:在得到与beta2_微球蛋白偶联的Epoxy-activated Sepharose6B相结合的核酸序列文库后，PCR扩增所得到的核酸序列文库，并制备单链DNA。
[0059]7.所述步骤③中，还包括如下步骤:在得到不与Epoxy-activated Sepharose6B相结合的核酸序列文库后，PCR扩增所得到的核酸序列，并制备单链DNA。
[0060]8.所述筛选方法中，在所述步骤③之后④之前，包括至少一次以下操作，以所述步骤中与beta2_微球蛋白特异性结合的核酸序列为起始文库，重复步骤②和③，每次操作均以前一次操作中得到的与beta2_微球蛋白特异性结合的核酸序列为起始核酸文库。
[0061]9.在PCR扩增中，引物的序列可以为:
[0062]引物1(5，-3，):GGATCCTACGGTACTTCG
[0063]引物2(5，-3，):AAGCTTGGCTGCACACT
[0064]或者其他的引物序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1为:得到的核酸适体与β -微球蛋白结合的毛细管电泳图谱 毛细管电泳分析微球蛋白与微球蛋白适体的结合
((Beckman P/ACE MDQ,电泳条件:eCAP Neutral Capilary30cm, 15KV,Tris-Glycine-KH2PO4缓冲液(25: 192: 5mM), pH8.3.1.微球蛋白适体与微球蛋白结合样品，2.β-微球蛋白，3.微球蛋白适体.检测波长214nm.【具体实施方式】
[0066]1.beta2-微球蛋白与 Epoxy-activated Sepharose6B 偶联:
[0067](a) 200ug beta2_ 微球蛋白溶于 200ul 水中。
[0068](b)取 0.08g Epoxy-activated Sepharose,加入 Iml 水，使其充分溶胀，约 5min后，待分布均匀后，低速离心，去上清。反复清洗几次，以去除添加剂。
[0069](C)取步骤(a)的 beta2_ 微球蛋白，加入清洗后的 Epoxy-activated Sepharose中，再加入IM的NaHCO3，室温下反应16小时。
[0070]2.封闭未结合的beta2_微球蛋白的活性基团:
[0071](I)反应产物，用0.1M的NaHCO3清洗三次。
[0072](2)将偶联后的产物置于IM的乙醇胺中，40°C下反应4小时。
[0073](3)用 0.1M 的 NaAc-0.5M NaCl 溶液和 0.1M Tris-HCL(含 0.5M NaCl,pH8.0)溶液，交替清洗三遍。
[0074](4)最后用10%乙醇洗两遍，产物保存在10%的乙醇中。
[0075]3.SELEX 过程
[0076](I)取 80ul 偶联 beta2_ 微球蛋白 Sepharose 6B,用 IX binding buffer (PH =
7.5,50mMHepes, 120mM NaCl,5mM KCl,2mM CaCl2, 2mM MgCl2)清洗两次，离心去上清。
[0077](2)偶联 beta2-微球蛋白 Sepharose6B 加入 IOx binding buffer,再加入筛选文库，于室温下反应I小时后，离心，弃上清。
[0078](3)再用IX binding buffer清洗偶联beta2-微球蛋白Sepharose 6B,离心去上清液。
[0079](4)用8M尿素洗脱beta2_ 微球蛋白Sepharose 6B上结合的核酸适体,离心,收集上清液。[0080](5)将收集的DNA上清液，用3KD的超滤离心管离心去除尿素。
[0081](6)用收集的核酸作为模板，进行PCR，制备单链DNA。
[0082](7)重复上述步骤，进行十次筛选。
[0083](8)每进行4个循环以后，要进行反筛，将核酸序列和与牛血清蛋白BSA相偶联的Epoxy-activated Sepharose进行孵育，以去除非特异性结合的核酸。
[0084]4.beta2-微球蛋白适体克隆的制备。
[0085](I)适体PCR产物连入T载体(pMD18-T simple vector，购自TAKARA)，转化感受态细胞(Ecoli DH5a compliment Cells，购自 TAKARA)，按 TAKARA 手册进行。
[0086](2)挑选阳性菌落进行测序。
[0087]5.微球蛋白核酸适体，经化学合成后，用毛细管电泳检测其与beta2_微球蛋白的结合活性 (见附图)。
【权利要求】
1.核酸适体，为序列表的序列1，序列2，序列3，序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9，序列10任一所示的DNA片段。
2.如权利要求1所述，β-微球蛋白的核酸适体,为权利要求1中任一 DNA分子和包含其中DNA片段的其他DNA分子。
3.如权利要求1所述，筛选所用的β-微球蛋白属人源，但其作用对象包括可与人源β-微球蛋白起交叉反应的其他来源的微球蛋白。
4.权利包括β_微球蛋白的核酸适体在相关领域的应用，包括分子探针、生物芯片、生物传感器、亲和纯化、药物筛选等方面。
5.权利包括筛选微球蛋白核酸适体的方法，包括如下步骤: (1)合成核酸适体库，作为筛选的起始文库。 (2)将标靶固定到载体上，与起始文库进行孵育，标靶会与起始文库中的部分核酸分子结合，分离，得到与标靶蛋白特异结合的序列。 (3)以步骤(2)得到的序列为模板，通过PCR扩增得到初级筛选文库，用于下一步的筛选。 (4)将PCR得到的序列与其他蛋白进行反筛，去除非特异性结合序列。 (5)重复步骤(2)——(4)，直至得到高特异性的核酸适体。
6.根据权利要求5步骤(1)所述方法，其特征在于核酸适体库的序列包括两端的固定序列:5’ 端 GGATCCTACGGTACTTCG 和 3’ 端 AGTGTGCA GCCAAGCTT ;中间 25 个随机碱基序列，N代表了 Α、Τ、C、G四种碱基序列，m代表碱基序列个数，可以为任意的整数。全序列包括:
5’ GGATCCTACGGTACTTCG Nm AGTGTGCA GCCAAGCTT3’ 。
7.根据权利5步骤(3)所述方法，其特征在于利用PCR产生的双链DNA分子，还要通过不对称PCR、热变性法、碱变性法、核酸外切酶法、制备单链DNA分子。
8.权利要求1所述的核酸适配体，还包括连接或标记其了它功能基团产生的具有相同功能的衍生物，这些基团包括甲基蓝、氨基、巯基、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等酶类、荧光素、放射性同位素及治疗性物质、纳米金及纳米钌等纳米金属颗粒、光敏剂等。
9.权利要求1所述的核酸适配体，还包括利用部分修饰的核苷酸单体合成的具有相同功能的修饰型核酸适配体。这些修饰包括:糖环侧链的修饰，糖环构型的改变、碱基的修饰、磷酸基的修饰。
10.权利要求1所述的核酸适配体，还包括将寡核苷酸骨架进行改造以后并具有与微球蛋白结合的化合物。这些骨架改造包括肽核酸、锁核酸、环己烯核酸、吗啡林核酸、亚酰胺核酸、N3’ -P5’亚磷酰胺等修饰化合物。
【文档编号】C12N15/115GK103667299SQ201210369236
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月24日 优先权日:2012年9月24日
【发明者】贾俊玲, 王晓庆, 张莹莹, 冯安娜, 王铄, 余盛, 朱勤峰, 朱德领, 郭锰 申请人:杭州耀洲生物科技有限公司, 杭州天龙药业有限公司