专利名称：编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的基因，该基因编码的蛋白质可用于降解纤维二糖。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶(beta-glucosidase, EC3. 2. I. 21)属于水解酶,广泛存在于自然界许多植物体中，还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌和细菌等微生物中。它能够水解结合于末端、非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应配基(潘利华，罗建平.2006，β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展.食品科学.27 (12) :803-807.)。其作用底物如纤维二糖(cellobiose)、纤维三糖(cellotriose)、纤维四糖(cellotetrose)、水杨苷(salicin)和对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)等。β-葡萄糖苷酶可作为风味酶，对改良果汁风味，果酒增香和茶叶增香均有显著作用(李远华.2002, β -葡萄糖 苷酶的研究进展.安徽农业大学学报.29(4) :421-425.)。除了食品风味物质的释放作用，葡萄糖苷酶在纤维素降解中具有重要作用(Sestelo Α. B. F. , Poza Μ. ,VillaT. C. 2004, β-Glucosidase activity in a Lactobacillusplantarum wine strain. WorldJournal of Microbiology&Biotechnology，20:633 637.)。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上含量最丰富的碳水化合物，也是数量最大的一种可再生资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达I. 55X 109t，其中 85% 尚未被人类利用(DUNLAP C，CHIANG G C. Utilization and recycleof agriculture wastes and residues. Shuler M L. Boca Raton, Florida. USA:CRC PressInc，1980. 19)。当今，能源短缺是人类面临的重大问题之一。而对于纤维素的利用是解决能源危机、粮食短缺、环境污染的重要途径。β -葡萄糖苷酶水解纤维二糖生成两分子葡萄糖，是纤维素酶复合酶系发挥协同作的关键酶，对纤维素酶系的整体水解活性有很强的促进作用，可以通过提高纤维素酶系中β_葡萄糖苷酶的活性来改善整个纤维素酶系的功用(Bhat K. Μ. , BhatS. 1997, Cellulose degrading enzymes and their potentialindustrial applications. Biotechnol. Adv. ,15:583 620.),因此对 β -葡萄糖苷酶的深入研究受到人们越来越多的关注。目前已有上百个微生物、植物及动物来源的葡萄糖苷酶基因得到克隆并被测序，其中许多微生物来源的β -葡萄糖苷酶基因已获得异源表达(韩笑，陈介南，王义强，等，2008，β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展。生物技术通报，3:8 13.)。相比之下，植物来源的葡萄糖苷酶活性远比微生物来源的葡萄糖苷酶要低，因此，目前研究主要集中在微生物来源上(李远华.2002，β-葡萄糖苷酶的研究进展.安徽农业大学学报.29(4) :421-425.)。而微生物中研究得较多的是酵母和丝状真菌如木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)等霉菌以及细菌中的芽孢杆菌属等(孟宪文，宋小红，陈历俊，等，2009，β-葡萄糖苷酶的研究进展.乳品加工，10:42-44.)。但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素以及得到的纤维素酶活力较低，尤其是β_葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累而影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。在产β-葡萄糖苷酶的微生物中有很多种都不止编码一种β-葡萄糖苷酶，该酶分子量变化较大，微生物中从18kD 480kD均有报道，酶学性质也可相差很远(韩笑，陈介南，王义强，2008，β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展。生物技术通报，3:8 13.)。除了在降解纤维素方面有着重要作用外，葡萄糖苷酶在其他领域也有广泛应用，特别是在医药、食品、生物转化中具有重要的应用价值(Mi chae I Ε. H.，MarkF.R. , Charles E. ,1999,Cellulase for commodity products from cellulosic biomass.Curr. Opin. Biotechnol.，10 (4) : 358 364.)。在医学中，β -葡萄糖苷酶应用在某些癌症的诊断和治疗中，并获得了许多成功(邵金辉，韩金祥，等，2005，β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用.生命的化学，5 (01) 22-24.)。在水果、蔬菜、茶叶等食料和中草药中，许多风味前体物质和药理活性成分主要以糖苷形式存在，需要葡萄糖苷酶这种风味酶将其释放出挥发性糖苷配基，起到增香作用(金凤燮，庄子瑜，鱼红闪，等，2009，特异的中草药配糖体苷酶微生物及其发酵与酶学特性.生物工程学报，25(12) : 1863-1870.)。除此 之外，β -葡萄糖苷酶普遍还具有葡萄糖基转移活性，可用于低聚龙胆糖的生产(刘玲玲，朱松，朱婷，等，2009，重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化.微生物学报，49 (5) :597-602.)、红景天苷的酶法合成(王梦亮，李万丽.2009，固定化β -葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究.生物技术，19(1) :68-70.)以及非离子表面活性剂烷基糖苷的合成(朱云，2007，葡萄糖酶法生物合成烷基糖苷工艺.浙江化工，38(11) :3-6.)。以葡萄糖苷酶为关键词查找中国国家知识产权局专利检索数据库，共出现143项发明专利。其中有23项发明专利是描述编码β_葡萄糖苷酶的基因及其应用，而其他120项是与β_葡萄糖苷酶在各种领域上的应用有关。在这23项与编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用相关的发明专利中的β-葡萄糖苷酶基因有5个是来自未培养微生物的、其它18个是来自15种不同生物一一嗜热脱氨芽孢杆菌NG80-2、里氏木霉、根瘤土壤杆菌HCCB20052、瓶霉ΧΗ8、Pyrococcusfuriosus、嗜热菌ΜΒ4、黑曲霉、端氏木霉QM9414、黑曲霉WX-07、黑翅土白蚁、Clostridium sp.WGC702、曲霉菌株CICC2193、嗜热拟青霉、Dictyoglomusthermophilum DSM3960和极端嗜碱菌；1个来自白藜芦醇。本发明获得的β -葡萄糖苷酶是来自自行筛选到的新鞘氨醇菌M-9 (Novosphingobium sp.M_9),与基因数据库中公开的β_葡萄糖苷酶的氨基酸的同源性较低，是一个新的β_葡萄糖苷酶。
发明内容
本发明从广西南宁筛选到的新鞘氨醇菌M-9 (Novosphingobium sp.M_9)的基因组文库中克隆到一个编码葡萄糖苷酶的基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产β -葡萄糖苷酶，并能以纤维二糖为原料降解生成葡萄糖。本发明涉及一种β -葡萄糖苷酶的基因Sbgl，如序列表SEQ ID NO :1所述的碱基序列，是从实验室构建的新鞘氨醇菌M-9的基因组文库中亚克隆得到。该β-葡萄糖苷酶基因Sbgl的序列是由2235个碱基组成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF), Sbgl基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。葡萄糖苷酶的基因Sbgl编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，由744个氨基酸组成,和Sbgl催化功能域同源性最高的是NovosphingobiumaromaticivoransDSM12444 (溶芳经鞘氨醇单胞菌)的 glycoside hydrolase family3 domain protein (糖基水解酶家族3的功能域蛋白质)，两者的一致性=496/740 (67%)、相似性=592/740 (80%)。β -葡萄糖苷酶的基因Sbgl在大肠杆菌中表达的重组产物Sbgl能够分解纤维二糖。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。本发明提供了一个编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因，该基因所编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶具有分解纤维寡糖的用途。
图I是筛选含有β -葡萄糖苷酶基因Sbgl重组菌株的七叶苷选择平板图。
图2是β -葡萄糖苷酶Sbgl部分纯化物的SDS-PAGE图。图3是β -葡萄糖苷酶Sbgl水解纤维二糖的HPLC图。从图I 了解到，含有β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的重组菌株能够在七叶苷筛选平板上形成黑色圈。图2 了解到，β -葡萄糖苷酶Sbgl部分纯化物的分子量为77. 8kDa。图3中的A和B分别是葡萄糖和纤维二糖的标样。从图3的C 了解到，β -葡萄糖苷酶Sbgl能将纤维二糖水解成葡萄糖。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI300,购自Epicentre公司，载体pUC19,购自大连TaKaRa公司；表达载体pQE30和表达宿主M15，购自Qiagen公司，以及购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述I)新鞘氨醇菌M-9 (Novosphingobium sp. M-9)基因组文库的构建新鞘氨醇菌M-9的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目录号 BSC12S1)的使用说明来提取的。新鞘氨醇菌M-9的基因组文库构建是按照Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号 CCFOSl 10)的使用说明书来进行的。构建好的新鞘氨醇菌M-9的基因组文库涂布到在含12. 5 μ g/mL氯霉素的LA平板(每IOOmL LA培养基含蛋白胨lg，酵母粉0. 5g，NaCl :0. 5g，琼脂粉1. 5g)上。结果共获得约I. 2万个转化子。2)编码糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl序列的测定将在12. 5 μ g/mL含氯霉素的LA平板上得到的转化子菌落分别转点到含有12. 5 μ g/mL氯霉素、七叶苷、柠檬酸铁铵、酵母粉、硝酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁的初筛培养基(每IOOmL初筛培养基含:七叶苷0. 2g，柠檬酸铁铵0. 5g，酵母粉0. lg，硝酸铵0. 2g,磷酸氢二钾0. 2g，硫酸镁0. 04g，琼脂粉1. 5g)的平板上，将平板倒置于37°C培养箱培养12小时。结果筛选到四个能产黑色透明圈的克隆，本发明只涉及其中一个克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA，用限制性内切酶EcoR I酶切后，将获得的DNA片段与经EcoR I酶切的去磷酸化的PUC19质粒进行连接。再将连接产物用CaC12法转化到大肠杆菌EPI300中，在含100 μ g/mL氨苄青霉素的初筛培养基平板上筛选亚克隆转化子。结果共获得约50个产生黑色圈的亚克隆转化子。进一步提取其中6个亚克隆转化子的质粒DNA，用限制性内切酶EcoR I完全酶切后，进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳分析，结果这6个亚克隆转化子除了都含有一个2. 7kb的载体片段外，还含有另外一条大小约为9. 5kb的外源DNA片段。挑取其中一个亚克隆子进行测序，并命名为pUC-bgll，并送交华大基因公司测定DNA序列。3)编码糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的核苷酸序列分析用 NCBI (National Center for Biotechnologylnformation, http://www.ncbi.nlm. nih. gov)上的软件 ORF finder (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)和Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)对 DNA 序列进行分析。基因 Sbgl 的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)由2235个核苷酸组成,序列如SEQ ID NO :1。其中，Sbgl基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。4)编码糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl编码的产物Sbgl的氨基酸序列分析·β -葡萄糖苷酶基因Sbgl编码一个含744个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为77854. 42道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析 β -葡萄糖苷酶 Sbgl 的组件结构，结果是自N端的第84-301位和369-631位氨基酸为家族3糖基水解酶(glycosylhydroIase)功倉泛域。5)编码糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的克隆和表达使用上游引物5 ’ -AATAGATCTCAGGAAGCCGGTGCCCCGCCGGTA-3’ 和下游引物 5’ -ATCAAGCTTTCAATCCTTCCAGCTACGCGCCGG-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增β -葡萄糖苷酶基因Sbgl，用限制性内切酶BlII和Hind III酶切β-葡萄糖苷酶基因Sbgl后，与经BamH I和Hind III酶切的表达载体PQE30进行连接。再将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌ΕΡΙ300中，涂布到含100 μ g/mL氨苄青霉素的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100 μ g/mL氨苄青霉素、七叶苷、柠檬酸铁铵的LA复筛培养基(每IOOmL复筛培养基含七叶苷0. 2g，柠檬酸铁铵0. 5g，蛋白胨lg，酵母粉0. 5g，NaCl :0. 5g，琼脂粉1. 5g)平板上，将平板置于370Cfl温箱培养12小时，对每个转点菌落逐个滴加I μ L用LB培养基稀释成1%的IPTG诱导表达，然后，将平板置于37°C恒温箱继续培养12小时。时间到后，进行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒温箱使表达的Sbgl酶与七叶苷和柠檬酸铁铵反应12小时。观察复筛平板。然后进一步提取在复筛平板能形成黑色圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为PQE-Sbgl，用限制性内切酶BamH I和Hind 111完全酶切pQE_Sbgl后，进行0. 8 %琼脂糖凝胶电泳分析，结果PQE-Sbgl除有一个约3. 8kb的DNA片段外，还有一条大小约为I. 7kb的DNA片段。将质粒pQE-Sbgl用CaCl2法转化入大肠杆菌表达宿主Ml5 [pREP4]，涂布到含100μ g/mL氨苄青霉素和25μ g/mL卡那霉素的LA平板上。挑取转化得到的单菌落接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素和25 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，待OD6tltl为0. 4时，加入IPTG使其终浓度为O. 5mmol/L，20°C、180转诱导24小时。IlOOOrpm离心3min,收集菌体，用4mLpH7. OI OOmmo I/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min,取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入lmL50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL冲洗缓冲液(50mmol/LNaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH8. O)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤 4 次。加入洗脱缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8. O)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。6)编码糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶Sbgl水解纤维二糖的测定β -葡萄糖苷酶Sbgl以纤维二糖为底物、在ρΗ7. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和50°C下作用30分钟。反应时间到后，在100°C加热10分钟终止反应。Sbgl水解纤维二糖的产物用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。
HPLC检测的结果显示Sbgl能够将纤维二糖水解葡萄糖。以纤维二糖为底物的Sbgl 的酶活是 156. 87U/mg。HPLC条件仪器=AgilentllOO色谱仪；色谱柱氨基柱;流动相乙腈:水(70 30);流速1. OmL/min;检测器RID (折光检测器)。
权利要求
1.一个β-葡萄糖苷酶的基因Sbgl，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示。
2.根据权利要求I的基因所编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO2所示。
3.—种表达载体,其特征在于,它含有权利要求I所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求2所述的蛋白质在降解纤维二糖中的应用。
全文摘要
本发明涉及一个编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的基因及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述基因编码的β-葡萄糖苷酶Sbgl，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，所述基因编码的β-葡萄糖苷酶Sbgl在分解纤维二糖中的应用。
文档编号C12N15/56GK102888416SQ20121038727
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者杜丽琴, 王子龙, 黄日波, 韦宇拓, 闭海, 黄金群 申请人:广西大学