专利名称：环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，以及该突变体酶在以淀粉为底物生产麦芽糖中的应用。
背景技术：
多功能淀粉酶是α淀粉酶家族(a-amylase family)的新一类成员，包括新普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶和环糊精葡萄糖基转移酶，它们在结构上具有α淀粉酶家族共有的4个高度保守的区域，但在功能上又兼有糖苷水解酶和糖基转移酶的催化活性，而不同的多功能淀粉酶虽然在结构与功能上具有一定的相似性，但不同来源的酶在底物特 异性和水解、转移糖苷键的特异性等方面存在着差异(Lee H S，Kim M S，Cho H S, et al.2002，Cyclomaltodextrinasejneopullulanase，and maltogenic amylase are nearlyindistinguishable from each other. J. Biol. Chem.，277(24):21891-21897)。环糊精葡糖基转移酶(CGTase :EC2. 4. I. 19)是由芽孢类细菌产生的一类酶，主要出现在杆状细菌中，最初在Bacillus macerans中分离出来，并在多种微生物发现(Cristiane Moriwakiaj Glauciane L. Costaaj Rubia Pazzettoaj et al. 2007, Productionand characterization of a new cyclodextrin glycosyItransferase from Bacillusfirmus isolated from Brazilian soil,Process Biochemistry. 42 (10) :1384-1390)。环糊精葡萄糖基转移酶催化糖基反应通常包括以下四种作用方式(Qi Q S, ZimmermannW. 2005，Cyclodextrin glucanotransferase from gene to application.Appl.Microbiol. Biotechnol.，66，475-485. ) (I)环化作用α 一( I — 4)葡聚糖分子通过分子内糖基转移反应生成环糊精。(2)偶合作用是环化作用逆反应，打开环糊精环，把它结合到葡萄糖和麦芽糖等受体上。(3)歧化反应直链寡糖分子间进行糖基转移作用，生成聚合度不同各种糖分子。(4)水解作用其水解速度一般为环化反应速度万分之十五左右。麦芽糖淀粉酶(Maltogenica -amylase, MAase)全称 l，4_a-D_ 葡聚糖 a-麦芽糖基水解酶[1，4- a -D-glucan a -maltohydrolase, EC3. 2. I. 133]，是一类水解a-l，4_D-葡萄糖苷键的内切淀粉酶，作用于淀粉及相关多聚糖、寡糖，产物为a-麦芽糖。麦芽糖单位从淀粉链的非还原末端按顺时针方向被水解下来(Kim DY，Cha CHj OhWSj et al. 2004, Expression of the promoter for the maltogenic amylase gene inBacillus subtilis 168. J Microbiol，42:319 327)。麦芽糖淀粉酶基因主要来源于枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、嗜热脂肪芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、栖热菌属(Thermus sp.)、嗜热放线菌(Thermusvulgaris)等。麦芽糖淀粉酶主要应用于焙烤工业。在面团中加入适量的麦芽糖淀粉酶，该酶在焙烤过程的前期分解面团中的淀粉分子产生麦芽糖等小分子糖类，这些小分子糖类能阻止面包中蛋白质网络与淀粉颗粒之间形成铰链，从而延缓面包的老化(王学东，杨浩，姚娟，等.真菌α-淀粉酶和麦芽糖α-淀粉酶对馒头粉品质改良的比较研究.2006，食品科技，31(10) :48 — 52.)。另一方面，麦芽糖淀粉酶还可以直接催化淀粉转化生成异麦芽寡糖(IMO) (Park K H, Kim T J, Cheong T K, et al. 2000, Structure, specificityand function of cyclomaltodextrinase, a multispecific enzyme of the a -amylasefamily. Biochim BiophyActa, 1478 (2) : 165-185)。异麦芽寡糖是有效的双歧因子，对维持和增强人体健康、提高人体免疫力有重要的作用。麦芽糖淀粉酶的发掘和应用势必极大地促进将较廉价淀粉转化为较昂贵的IMO的技术发展(Park K H. 2006, Function andtertiary-and quaternary-structure of eyelodextrin-hydrolyzing enzymes (CDase), agroup of multisubstrate specific enzymes belonging to the a -amylase family. JAppl Glycosci, 53(I):35-44)。于是，我们通过酶分子改造技术将环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt突变成了麦芽糖淀粉酶Mcgt，使得突变酶Mcgt的环化功能有较大的降低、水解活性获得很大提高——麦芽糖的产量占总反应产物的66. 39%。这样，高产麦芽糖的性质使得突变酶Mcgt还可以用于以淀粉为底物生产高麦芽糖浆。 高麦芽糖浆是一种麦芽糖含量高，葡萄糖含量低的中等转化糖浆。它的特点是清亮透明，熬煮温度高，与葡萄糖浆相比，还具有甜味柔和，保湿性好，热稳定性高，抗结晶等优良性能，因此在食品工业中有着广泛的应用前景。高麦芽糖浆用于甜食中有保水，保香；用于棉花糖、奶油冰淇淋可降低其甜度；用于馅类甜食，有提味、保色以及防腐的效果；用于年糕、江米团等食品能保持其柔软度，延长保存时间；用于鱼肉冻等胶冻类食品能保持其鲜度，改进质量。高麦芽糖浆不仅用于食品工业，而且在酶制剂及医药工业中也有广泛的用途。以麦芽糖淀粉酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现10项发明专利。只有I项是关于麦芽糖淀粉酶的，是通过HN02对天然生麦芽糖淀粉酶进行化学修饰，获得了最适PH较低的麦芽糖淀粉酶；其它9项发明专利是描述麦芽糖淀粉酶在食品领域中的应用。以环糊精葡萄糖基转移酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现16项发明专利。其中只有两项是关于环糊精葡萄糖基转移酶突变的，这两项发明专利都是对来自 Peanibacillus macerans JFB05-01 (CCTCC NO M208063)的 CGT 酶分别进行多个氨基酸位点的突变，分别获得了高产α-环糊精和高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体。
发明内容
本发明的目的是通过对环糊精葡萄糖基转移酶的改造，使之获得新的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，这个突变体酶可用于以淀粉为底物生产麦芽糖。本发明所述的新的环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt (SEQ ID Ν0:1)，其是通过分子改造β -环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt而得到的，基因Pcgt来自专利申请号为201110171181. 0，具体是通过在Pcgt分子上突变200位和201位的氨基酸，由亮氨酸Leu和酪氨酸Tyr突变成苯丙氨酸Phe和苏氨酸Thr,同时加入了 5个氨基酸序列，改造得到一个新的环糊精葡萄糖基转移酶突变体。这个环糊精葡萄糖基转移酶突变体和原酶相比，能够以淀粉为原料高产麦芽糖。
SEQ ID NO :1的蛋白质是环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt，由697个氨基酸组成。本发明还涉及含有本发明环糊精葡萄糖基转移酶突变体的宿主。本发明所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体在以淀粉为原料生产麦芽糖中具有广泛的用途。本发明所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法包括β -环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因的获得、环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因的表达和纯化以及环糊精葡萄糖基转移酶突变体水解淀粉产物的测定等步骤。
图I是环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt部分纯化物的SDS-PAGE图。 图2是突变前环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt的淀粉水解产物的HPLC图。图3是环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt的淀粉水解产物的HPLC图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。材料准备大肠杆菌(Escherichiacoli) XLIO-Gold、载体 pSE380 购自Invitrogen公司、Ni-NTA蛋白质组氨酸纯化介质购自Novagen公司、聚合酶购自TaKaRa公司、修饰酶DpnI购自MBI公司。I)环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt的克隆使用上游引物5 ’ -TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACATTACGCCAGCTTGCATGCTGCAG-3’ (包含一个Nco I酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和下游引物5’-CACAAGCTTTTAAGGCTGCCAGTTCACGTTAATG-3’ (包含一个Hind III酶切位点)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt，用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt后，插入到经Nco I和Hind III酶切的表达载体PSE380进行连接。获得的重组质粒命名为pSE-Pcgt。2)环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因Mcgt的获得Mcgt基因是根据Pcgt基因序列信息通过在正向引物中将编码亮氨酸CTG和酪氨酸TAC人为地突变成苯丙氨酸TTC和苏氨酸ACT和加入了 5个氨基酸的核苷酸序列(CAGCTGGCTTCTCGC)来进行改造。以I)中构建的pSE-Pcgt为模板，使用正向引物5’ -TACAAAAACCTGTACGATCCAGCTGGCTTCTCGCTCGCCGACCTGAACCAT-3’和反向引物 5’-ATGGTTCAGGTCGGCGAGCGAGAAGCCAGCTGGATCGTACAGGITITTGTA-3’ 进行 PCR，PCR 反应程序第一步 95°C 2 分钟；第二步进行30个循环，循环为98°C 10秒，68°C 6. 5分钟；第三步72°C 10分钟。PCR产物使用IuL Dpn I在37°C酶切一个小时，然后用CaCl2化学法转化大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞。转化产物克隆送交华大生物公司进行DNA测序分析确定正确的转化子。3)环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因Mcgt的表达和表达产物的部分纯化将含有质粒pSE-Mcgt的重组大肠杆菌XLlO-Gold菌株接种到20mL含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，待OD6tltl为O. 6时，加入IPTG(终浓度为O. 5mmol/L)、L-三梨醇(终浓度为100mmol/L)和甜菜碱(终浓度为2. 5mmol/L)，20°C诱导20小时。11000 转离心 3min,收集菌体，用 4mL 裂解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl,IOmmoI/L咪唑，pH8. O)重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000转离心lOmin，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4ml上清液加入lmL50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加Iml冲洗缓冲液(50mmOl/LNaH2P04，300mmOl/LNaCl, 20mmol/L咪唑，pH8. O)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8. O)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。4)环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt水解淀粉的产物测定环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt水解淀粉的反应取3 μ I环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt的部分纯化物，与l%(w/v)淀粉溶液(用50mmol/L pH7. O磷酸缓冲液溶解)
在500 μ I的反应体系中37°C作用3个小时。反应时间到后，在100°C加热10分钟终止反应。Mcgt的产物用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。HPLC检测的结果显示Mcgt的产物中有葡萄糖、麦芽糖、α-环糊精和β-环糊精存在，其中水解产物中麦芽糖的产量占总的水解产物的66. 39%。HPLC条件仪器=AgilentllOO色谱仪；色谱柱氨基柱;流动相乙腈:水(70 30);流速1. OmL/min;检测器折光检测器RID。从图I 了解到，环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt部分纯化物的分子量为
75.7kDa。图2中的A、B和C分别是葡萄糖、α -环糊精和β -环糊精的标样，D是Pcgt转化淀粉的产物。从图2的D中了解到，β -环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt能将淀粉转化成葡萄糖、α-环糊精、β-环糊精和Y-环糊精。图3中的Α、B、C和D分别是葡萄糖、麦芽糖、α -环糊精和β -环糊精的标样，E是Mcgt转化淀粉的产物。从图3的E中了解到，环糊精葡萄糖基转移酶突变体Mcgt能将淀粉转化成葡萄糖、麦芽糖、α -环糊精和β -环糊精。其中水解产物中麦芽糖的产量占总水解产物的66. 39%，见表I所示。表I
权利要求
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所/Jn ο
2.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求I所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的原核细胞或真核细胞。
3.权利要求I所述的突变体蛋白质在以淀粉为原料生产麦芽糖中的应用。
全文摘要
一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。该突变体酶相对于突变前的酶具有高产麦芽糖的功能。该突变体酶能够在以淀粉为原料生产麦芽糖中应用。
文档编号C12P19/18GK102876640SQ20121038724
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者庞浩, 黄日波, 韦廷宗, 李涛, 裴建新 申请人:广西科学院