一种流感病毒滴度的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种流感病毒感染滴度的检测方法，其特点是利用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染性滴度，于35℃培养箱，流感病毒吸附Vero细胞90min后，加入终浓度为1％Agarose覆盖物，3天后加入第二层覆盖物，完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。选择出斑数在10～100个进行数斑，计算出空斑形成单位，并分别与鸡胚法检测病毒滴度进行比较，利用空斑法检测流感病毒感染滴度。具有灵敏度高，重复性好的特点，精密度在1.5％～5.3％之间，适合用来检测流感病毒感染滴度。
【专利说明】一种流感病毒滴度的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种流感病毒感染滴度的检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]传统的流感病毒病毒滴度的检测方法是利用鸡胚法。选择9~11日龄的鸡胚，将流感病毒按10倍系列稀释，至少取3个稀释度尿囊腔注射，每只注射0.2ml.每个稀释度注射4只鸡胚。37°C孵箱培养3天，取尿囊液做血凝滴度检测。计算出病毒滴度。利用空斑法检测病毒滴度的方法早在50年代就开始研究使用了。1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-1Omm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58,接种量为0.2ml,病毒的稀释度为2.5X IO3,则病毒原液的滴度为:58 + 0.2X2.5 XlO3 = 7.25 X IO5 (PFU/ml)。
[0003]蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的`生物学特性。
[0004]1.病毒生物学纯化(Virus biological purification)在进行血清中和试验时，常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性，这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂，或者已有许多变异病毒粒子存在其中，甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时，有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化，应用病毒蚀斑技术，挑选出各个不同的纯化病毒，亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖，测定其滴度，选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化，必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度，一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近IOmm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。
[0005]2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test)蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法,试验以使蚀斑数减少50%的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(IOOPFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作，接种预先准备好的单层细胞，再覆盖上营养琼脂置37°C二氧化碳培养箱培养，数天后分别统计蚀斑数，用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于公开了一种利用VeiO细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的检测方法。
[0007]本发明给出的技术方案是:这种流感病毒滴度的检测方法，其特征在于:采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度，其步骤有:
[0008](I)将流感病毒10倍系列稀释，取各稀释度病毒液加入VeiO细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔。35°C吸附90min后倒掉病毒液。
[0009](2)加入保持37°C~42°C的第一层覆盖物，每孔3ml。完全凝固后35°C倒置培养72小时。
[0010](3)加入保持37°C~42°C的第二层覆盖物，每孔2ml。完全凝固后35°C倒置培养24~48小时判定结果。选择出斑数在10~100个进行数斑。
[0011](4)采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度。
[0012](5)将流感病毒稀释至每0.5ml含I~5个病毒(即每孔I~5个空斑)，分别用鸡胚法和空斑法检测流感病毒感染滴度。检测阳性检出率，比较两种方法的灵敏度。
[0013](6)分别采用终浓度为1%和0.5%的Agarose覆盖物，进行试验操作。比较不同的终浓度对出斑的影响。
[0014](7)35°C培养箱流感病毒分别吸附60min和90min后加入第一层覆盖物。比较不同吸附时间对出斑的影响。
[0015](8)流感病毒在33°C和35°C培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖。本次试验在33°C和35 °C条件下进行了比较。
[0016](9)按上述方法，五个不同操作者同时用空斑法检测同一个流感病毒感染滴度，分别重复5次以上，对结果进行分析。
[0017]为更好地实现本发明的目的，采用VeiO细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的病毒稀释液为含6ug/ml胰酶的无血清培养基。
[0018]为更好地实现本发明的目的，采用VeiO细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第一层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基43.2ml,2% Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml、(λ 25%胰酶 0.3ml、双抗 lml。
[0019]为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第二层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基38.2ml,2% Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml、(λ 25%胰酶 0.3ml、双抗 lml、中性红 5ml。
[0020]为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持37°C~42°C的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35°C倒置培养72小时。
[0021]为更好地实现本发明的目的，采用VeiO细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持37°C~42°C的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后35°C倒置培养24~48小时判定结果。
[0022]为更好地实现本发明的目的，采用VeiO细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时选择出斑数在30~70个进行数斑。
[0023]为更好地实现本发明的目的，采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的
【权利要求】
1.一种流感病毒滴度的检测方法，其特征在于:采用Ver0细胞空斑法检测流感病毒感染滴度，其步骤有: (1)将流感病毒按10倍系列稀释，取各稀释度病毒液加入Vero细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔，，35°C吸附90min后倒掉病毒液； (2)加入保持37°C~42°C的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35°C倒置培养72小时； (3)加入保持37°C~42°C的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后，35°C倒置培养24~48小时判定结果，选择出斑数在10~100个进行数斑； (4)根据Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度: (5)将流感病毒稀释至每0.5ml含I~5个病毒(即每孔I~5个空斑)，分别用鸡胚法和空斑法检测流感病毒感染滴度，检测阳性检出率，比较两种方法的灵敏度； (6)分别采用终浓度为I%和0.5%的Agarose覆盖物，进行试验操作，比较不同的终浓度对出斑的影响； (7)35°C培养箱流感病毒分别吸附60min和90min后加入第一层覆盖物，比较不同吸附时间对出斑的影响； (8)流感病毒在33°C和35°C培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖； (9)按上述方法，五个不同操`作者同时用空斑法检测同一个流感病毒感染滴度，分别重复5次以上，对结果进行分析。
2.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的病毒稀释液为含6ug/ml胰酶的无血清培养基。
3.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第一层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基43.2ml,2%Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml,0.25%胰酶 0.3ml、双抗Iml0
4.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第二层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基38.2ml,2%Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml,0.25%胰酶 0.3ml、双抗lml、中性红5ml。
5.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持40°C的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35°C倒置培养72小时。
6.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持40°C的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后35°C倒置培养24~48小时判定结果。
7.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时选择出斑数在30~70个进行数斑。
8.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的
【文档编号】C12Q1/70GK103773892SQ201210397723
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2012年10月18日
【发明者】周荔葆, 廖辉, 刘苗苗, 赵新, 吴琼, 曲格霆 申请人:辽宁成大生物股份有限公司