一种荧光检测dna残留量实验中dna提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法，其特点是：(1)磁珠法提取样品中残留DNA提取，A消化蛋白酶反应，B磁珠绑定DNA，C清洗DNA，D稀释样品DNA；(2)酚—异丙醇法提取DNA；(3)picogreen检验。本发明采用磁珠提取，代替传统的酚氯仿法提取疫苗中的残留DNA，并用PicoGreen试验验证此磁珠提取技术可以降低了污染物质，如酚?异丙醇、氯化钠等，对荧光信号的影响，从而得到相对准确的检验结果。
【专利说明】—种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物制备中的实验方法，特别是涉及一种生物制品中宿主细胞DNA残留量检测及微量基因组DNA提取的荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]细胞基质作为主要原材料，其质量的优劣，直接影响疫苗等生物制品的质量和产量，尤其是生物制品的安全性。一般认为，细胞基质存在的潜在危险因素包括:促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞DNA。其中残余DNA—直是人们关注的热点。由于连续传代细胞(continuous cell lines)调控生长的基因失调，使得传代细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致瘤活性的潜在能力，需要对其DNA残留量进行质量控制。
[0003]DNA提取技术是分子生物学研究的基础技术。DNA提取技术是DNA检验的第一步骤，也是最关键的步骤。能否成功地定量进行DNA检验，完全取决于能否从样品中获得全量的DNA。DNA提取技术的优劣，将直接关系到最终检验结果。
[0004]残余DNA分析需要对mg级样本中pg水平的DNA进行准确定量。样本本身，无论是蛋白还是其他化学成份，都可能产生基质效应从而影响检测过程，因此需要对有干扰样本进行前期处理。蛋白样本通常需要进行蛋白酶消化。传统的DNA抽提方法是分子生物学中常用的酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法，但这种抽提方法通常回收率较低，因此像糖原等载体分子的应用对于回收率的提高是必不可少的。美国药典USP32中推荐了一种商品化DNA提取试剂盒，它是利用离液剂(碘化钠)和表面活性剂(N月桂酰肌氨酸钠)来破坏DNA和样本的结合，然后DNA和载体分子糖原共同被异丙醇沉淀下来。
[0005]磁珠抽提DNA的方法是利用糖原、酵母tRNA将样本中残余DNA吸附于磁珠微粒上，利用磁力架进行DNA抽提，该方法的回收率能达到80%~100%。
[0006]样本提取是一个额外的处理步骤，可能会引起残余DNA不完全回收或引入环境中外源性DNA，因此在样本处理的每一步都需要格外细心，同时增加回收率试验进行评价。USP32中指出加标回收率在80%~120%是残余DNA检测中可以接受的标准。当样本中存在干扰因素或抽提过程达不到这一回收率范围时，可以通过加标回收率校正DNA检测结果。
[0007]在采用picogreen或Q-PCR等以荧光方式检测疫苗中宿主DNA残留量实验中，对样品中残留DNA的提取条件要求苛刻，不仅在样品回收率方面，在整个提取过程中引入外来试剂的残留都会对荧光信号产生影响。进而影响最终结果。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于解决现有技术的上述不足，公开一种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法。 [0009]本发明采用一种新的DNA提取技术(磁珠提取)代替传统的酚氯仿法提取疫苗中的残留DNA。并用PicoGreen试验验证此技术(磁珠提取)可以降低了污染物质(如酚异丙醇、氯化钠等)对荧光信号的影响，从而得到相对准确的检验结果。
[0010]本发明给出的技术方案是:这种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法，其特征在于有以下步骤:
[0011](I)磁珠法提取样品中残留DNA提取
[0012]A、消化蛋白酶反应
[0013]在1.5ml离心管中加入样品100 μ 1，加入0.2%蛋白酶K溶液20 μ 1，加入蛋白酶K缓冲液200 μ 1，56°C培养30min,培养后每管加肝素40 μ g、2 μ g tRNA ；
[0014]B、磁珠绑定DNA
[0015]将磁珠重悬、震荡混匀后，每管加15 μ I磁珠；再加入200 μ I无水乙醇、倒转2次、镟润混匀5min、spinl5s、磁力架静止5min,吸除悬浮液体；
[0016]C、清洗 DNA
[0017]I)从磁力架取下，加500 μ I缓冲液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩润混合5 s ；
[0018]2) spin 15s ;在磁力架静止Imin ;吸出悬浮液体(不要接触磁珠)；
[0019]3)从磁力架取下， 加500 μ I洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5 s ；
[0020]4) spin 15s、磁力架静止Imin吸出悬浮液体(不要接触磁珠)；
[0021]5)从磁力架取下，加500 μ I洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5 s ；
[0022]6) spin 15s、磁力架静止Imin ;吸出悬浮液体(不要接触磁珠)(尽量吸取干净)；
[0023]7)空气干燥5min (去除残留乙醇干扰)；
[0024]D、稀释样品DNA
[0025]I)每管加100 μ I TE (洗脱液)(吸头反复吹打);
[0026]2)高速漩涡混合10s、培养70°C、7min。在此期间混合2_3次，有助于悬浮；
[0027]3) spinl5s、磁力架静止2min、将含有DNA的洗脱液全部转移至新管,用于检测；
[0028](2)酚-异丙醇法提取DNA
[0029]在1.5ml离心管中加入样品100 μ I ;加入2%蛋白酶K溶液I微升；加入蛋白酶K缓冲液12 μ I ;37°C培养4小时Spin后，上述样品管加入等体积的Tris饱和酚，剧烈混合30秒,冰浴中放置5min。15000g离心IOmin ;小心移取上层液体至新管中，每管加入3mol/L乙酸钠溶液60 μ 1，再加入600 μ I预冷异丙醇，颠倒混合，-20°c过夜；15000g离心15min，弃去上清；加入500μ I 75%冰冷乙醇洗涤沉淀，15000g离心15min，弃去上清；沉淀在热蒸干器中干燥，直至管内液体全部蒸后，加IOOyl TE buffer溶解DNA;
[0030](3) picogreen 检验
[0031]I)使用前恢复室温，染料用TE缓冲液200倍稀释；使用塑料容器；需避光，防止染料见光分解；制备后几小时内使用；
[0032]2)将稀释后的标准品与样品与等体积的染料混合，每孔中加入200微升。测定各孔荧光值。
[0033]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0034]1.能够自动化操作,代替手工操作,避免人为的干扰。[0035]2.节省大量核酸提取时间，适用于在线监测。
【具体实施方式】:
[0036]下面结合实施例对本发明给出的技术方案做出进一步说明。
[0037]在提取样品前中加入了 IOng DNA，检测其在提取样品中的回收率；证明此提取方法对残留DNA是否损失。检验当采取两种提取方法处理的同一样品时，最终检测结果是否相同。
[0038]这种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法有以下步骤:
[0039]一磁珠法提取样品中残留DNA提取
[0040]A、消化蛋白酶反应
[0041]在1.5ml离心管中加入样品100μ I ;加入0.2%蛋白酶K溶液20μ I ;加入蛋白酶K缓冲液200 μ I。56°C培养30min。培养后每管加肝素40 μ g、2 μ g tRNA。
[0042]B、磁珠绑定DNA
[0043]将磁珠重悬、震荡混匀后，每管加15 μ I磁珠；再加入200 μ I无水乙醇、倒转2次、镟润混匀5min、spinl5s、磁力架静止5min,吸除悬浮液体。
[0044]C、清洗 DN A
[0045]I从磁力架取下，加500 μ I缓冲液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s。
[0046]2spin 15s ;在磁力架静止Imin ;吸出悬浮液体。(不要接触磁珠)
[0047]3从磁力架取下，加500 μ I洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s。
[0048]4spin 15s、磁力架静止Imin吸出悬浮液体。(不要接触磁珠)
[0049]5从磁力架取下，加500 μ I洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s。
[0050]6spin 15s、磁力架静止Imin ;吸出悬浮液体(不要接触磁珠)(尽量吸取干净)
[0051]7空气干燥5min。(去除残留乙醇干扰)
[0052]D、稀释样品DNA
[0053]I每管加100 μ I TE (洗脱液)(吸头反复吹打)
[0054]2高速漩涡混合10s、培养70°C、7min。在此期间混合2_3次，有助于悬浮。
[0055]3spinl5s、磁力架静止2min、将含有DNA的洗脱液全部转移至新管,用于检测。
[0056]二酚-异丙醇法提取DNA
[0057]在1.5ml离心管中加入样品100 μ I ;加入2%蛋白酶K溶液I微升；加入蛋白酶K缓冲液12 μ I。37°C培养4小时Spin后，上述样品管加入等体积的Tris饱和酚，剧烈混合30秒，冰浴中放置5min。15000g离心lOmin。小心移取上层液体至新管中。每管加入3mol/L乙酸钠溶液60 μ 1，再加入600 μ I预冷异丙醇，颠倒混合，_20°C过夜。15000g离心15min，弃去上清。加入500μ1 75%冰冷乙醇洗涤沉淀。15000g离心15min，弃去上清。沉淀在热蒸干器中干燥，直至管内液体全部蒸后，加IOOyl TE buffer溶解DNA。
[0058]三picogreen 检验
[0059]I使用前恢复室温，染料用TE缓冲液200倍稀释；使用塑料容器；需避光，防止染料见光分解；制备后几小时内使用。
[0060]2将稀释后的标准品与样品与等体积的染料混合。每孔中加入200微升。测定各孔荧光值
[0061]检验结果
[0062]
【权利要求】
1.一种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法，其特征在于有以下步骤: (1)磁珠法提取样品中残留DNA提取 A、消化蛋白酶反应 在1.5ml离心管中加入样品100 μ I，加入0.2 %蛋白酶K溶液20 μ I，加入蛋白酶K缓冲液200 μ 1，56°C培养30min,培养后每管加肝素40 μ g、2 μ g tRNA ； B、磁珠绑定DNA 将磁珠重悬、震荡混匀后,每管加15 μ I磁珠；再加入200 μ I无水乙醇、倒转2次、漩涡混匀5min、spinl5s、磁力架静止5min,吸除悬浮液体； C、清洗DNA 1)从磁力架取下，加500μ I缓冲液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s ； 2)spin 15s ;在磁力架静止Imin ;吸出悬浮液体(不要接触磁珠)； 3)从磁力架取下，加500μ I洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s ； 4)spin 15s、磁 力架静止Imin吸出悬浮液体(不要接触磁珠)； 5)从磁力架取下，加500μ I洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s ； 6)spin 15s、磁力架静止Imin ;吸出悬浮液体(不要接触磁珠)； 7)空气干燥5min(去除残留乙醇干扰)； D、稀释样品DNA 1)每管加100μ I TE洗脱液(吸头反复吹打); 2)高速漩涡混合10s、培养70°C、7min，在此期间混合2_3次，有助于悬浮； 3)spinl5s、磁力架静止2min、将含有DNA的洗脱液全部转移至新管,用于检测； (2)酚-异丙醇法提取DNA 在1.5ml离心管中加入样品100μ I ;加入2%蛋白酶K溶液I微升；加入蛋白酶K缓冲液12 μ I ;37°C培养4小时Spin后，上述样品管加入等体积的Tris饱和酚，混合30秒，冰浴中放置5min, 15000g离心IOmin ;小心移取上层液体至新管中，每管加入3mol/L乙酸钠溶液60 μ 1，再加入600 μ I预冷异丙醇，颠倒混合，-20°C过夜；15000g离心15min，弃去上清；加入500 μ I 75%冰冷乙醇洗涤沉淀，15000g离心15min，弃去上清；沉淀在热蒸干器中干燥，直至管内液体全部蒸后，加100 μ I TE缓冲液溶解DNA ； (3)picogreen检验 1)使用前恢复室温，染料用TE缓冲液200倍稀释；使用塑料容器；需避光，防止染料见光分解；制备后0.5小时内使用； 2)将稀释后的标准品与样品与等体积的染料混合，每孔中加入200微升。测定各孔荧光值。
【文档编号】C12N15/10GK103773754SQ201210397631
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2012年10月18日
【发明者】高旭哲 申请人:辽宁成大生物股份有限公司