专利名称：一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及水产鱼类深加工利用的方法，特别是一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一种源自于生物体内的氧自由基清除剂，它能够维持生物体内超氧阴离子的动态平衡，防止因体内O2 ■ ·浓度过高而引起的不良反应，被誉为“人体垃圾清道夫”，在抗衰老、抗炎症、抗氧化、抗辐射和防治肿瘤等方面显示出了独特的功能，已广泛应用于食品、医药和日用化工等行业。目前，国内外利用陆生动植物(特别是猪、牛、羊血液和大蒜)和微生物开发SOD的研究较多，而有关从水生生物如鱼、虾等中开发SOD的研究甚少，特别是利用罗非鱼血液提纯SOD的研究未见报道。
中国是世界上最大的罗非鱼养殖生产国家，罗非鱼加工厂将罗非鱼血作为废物排放，每年向环境中排放的罗非鱼血达I. 2X IO4吨。而罗非鱼血中富含如超氧化物歧化酶、血红蛋白等多种有效成分，实现罗非鱼血的综合利用不仅可以避免环境污染，而且能够显著地增加企业的附加值，优化企业的产业结构。常见的SOD提纯技术有热变性法、盐析法、有机溶剂法和层析法等，但是迄今报道的众多关于不同原材料的SOD提纯工艺和参数不尽相同，因此，开发一条适合罗非鱼血综合利用的SOD提纯工艺路线显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法，从而使这些废弃罗非鱼血液资源得到高值化利用。为实现上述目的，本发明是通过以下实施方案来实现的一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法，其步骤包括a.红细胞破碎将收集到的洁净罗非鱼血红细胞用广2倍体积的双蒸水稀释后，在超声功率30(T400W条件下作用15 20min进行红细胞破碎处理，然后5000 Xg离心15min，收集上层红细胞液；b.乙醇、氯仿沉淀先后加入无水乙醇和氯仿到红细胞液中，边加边搅拌，搅拌20min后，静置30min，然后10000 Xg离心15min，收集上清液；再用氮吹仪处理去除乙醇和氯仿；c.热变性处理将步骤b所得上清液在60°C条件下恒温水浴15 20min，冷却后10000 X g离心15min,收集上清液；d.阴离子交换将步骤c所得上清液在多功能蛋白快速纯化液相色谱系统辅助下，采用阴离子交换法，制得SOD液。本发明还将得到的SOD液用可截留分子量为IOKDa的膜系统离心超滤，进行脱盐和浓缩，收集浓缩液，并在-20°C条件下封存。本发明与现有技术相比，具有以下的效果
(I)本发明首次从罗非鱼血液中提纯S0D，为罗非鱼血液的综合利用提供了一条有效的途径，使这些原本废弃的资源得到高效利用，从而可以大大提高企业的经济效益，还能带来莫大的社会效益。(2)本发明首先是利用超声技术 进行有效的细胞破碎，然后采用乙醇、氯仿沉淀实现SOD与血红蛋白的同步分离，再利用SOD耐热性好的特点，通过热变性处理去除杂蛋白；并使用多功能蛋白快速纯化液相色谱系统对阴离子交换过程进行控制，最后用离心超滤进行脱盐和浓缩后得到SOD ;这样SOD纯化过程变得非常简捷、高效。结果表明，本发明制备的SOD比活力为7541U/mg，回收率为50. 8%，纯化倍数为1832，经PAGE鉴定为一条带，达到了电泳纯，SOD分子量为32KDa。(3)本发明工艺过程简单，生产周期短，条件稳定，适合工业化生产，可向食品、医药和日用化工等行业提供价格低廉、安全可靠的SOD产品。
具体实施例方式实例一取洁净罗非鱼血红细胞100ml，加入IOOml双蒸水轻轻混匀，放入超声仪中，将功率调至300W，作用15min，5000Xg离心15min，收集上层红细胞液。先后缓慢加入15ml的无水乙醇和IOml的氯仿到红细胞液中，边加边搅拌，搅拌15min后，静置30min，10000Xg离心15min，收集上清液，再用氮吹仪处理去除乙醇和氯仿。将上步所得上清液在60°C条件下恒温水浴15min，迅速冷却后IOOOOXg离心15min,再次收集上清液。配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液作为离子交换起始缓冲液(A液)，配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(内含lmol/L NaCl)作为离子交换洗脱缓冲液(B液)，在多功能蛋白快速纯化液相色谱系统控制下(系统可选用AKTA purifier 10品牌产品)，用A液将再次收集的上清液加载到离子交换柱上(离子交换柱可选用和上述品牌配套的HiTrap DEAE FF产品)，用B液进行线性梯度洗脱，收集活性峰，即得高纯度SOD 液。实例二取洁净罗非鱼血红细胞100ml，加入200ml双蒸水轻轻混匀，放入超声仪中，将功率调至400W，作用20min，5000Xg离心15min，收集上层红细胞液。先后缓慢加入IOml的无水乙醇和15ml的氯仿到红细胞液中，边加边搅拌，搅拌20min后，静置30min，10000Xg离心15min，收集上清液，再用氮吹仪处理去除乙醇和氯仿。将上步所得上清液在60°C条件下恒温水浴20min，迅速冷却后IOOOOXg离心15min,再次收集上清液。配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液作为离子交换起始缓冲液(A液)，配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(内含lmol/L NaCl)作为离子交换洗脱缓冲液(B液)，用A液将再次收集的上清液加载到离子交换柱上，用B液进行分步洗脱，收集活性峰，即得高纯度SOD液。将得到的SOD液用可截留分子量为IOKDa的膜系统离心超滤，进行脱盐和浓缩，收集浓缩液，即为纯净的SOD终产品，将其在_20°C条件下封存。
实例三取洁净罗非鱼血红细胞1000ml，加入2000ml双蒸水轻轻混匀，放入超声仪中，将功率调至400W，作用20min，5000Xg离心15min，收集上层红细胞液。先后缓慢加入IOOml的无水乙醇和IOOml的氯仿到红细胞液中边加边搅拌，搅拌20min后,静置30min, 10000 Xg离心15min,收集上清液,再用氮吹仪处理去除乙醇和氯仿。将上步所得上 清液在60°C条件下恒温水浴15min，迅速冷却后IOOOOXg离心15min,再次收集上清液。配制5000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液作为离子交换起始缓冲液(A液)，配制5000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(内含lmol/L NaCl)作为离子交换洗脱缓冲液(B液)，用A液将上述再次收集到的上清液加载到离子交换柱上，用B液进行分步洗脱，收集活性峰，即得高纯度SOD液。将得到的SOD液用可截留分子量为IOKDa的膜系统离心超滤，进行脱盐和浓缩，收集浓缩液，将浓缩液在_20°C条件下急冻后，进行真空冷冻干燥，即得SOD干粉终产品。本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。
权利要求
1.一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于包括以下步骤 a.红细胞破碎将收集到的洁净罗非鱼血红细胞用广2倍体积的双蒸水稀释后，在超声功率30(T400W条件下作用15 20min进行红细胞破碎处理，然后5000 Xg离心15min，收集上层红细胞液； b.乙醇、氯仿沉淀先后加入无水乙醇和氯仿到红细胞液中，边加边搅拌,搅拌20min后，静置30min，然后10000Xg离心15min，收集上清液；再用氮吹仪处理去除乙醇和氯仿； c.热变性处理将步骤b所得上清液在60°C条件下恒温水浴15 20min，冷却后10000 X g离心15min,收集上清液； d.阴离子交换将步骤c所得上清液在多功能蛋白快速纯化液相色谱系统辅助下，采用阴离子交换法，制得SOD液。
2.根据权利要求I中所述的一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于将得到的SOD液用可截留分子量为IOKDa的膜系统离心超滤，进行脱盐和浓缩，收集浓缩液，并在-20°C条件下封存。
3.根据权利要求I中所述的一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的步骤b中先后按罗非鱼血红细胞体积比加入1(Γ15%的无水乙醇和1(Γ15%的氯仿。
4.根据权利要求I中所述的一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤d中多功能蛋白快速纯化液相色谱系统中，配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液作为离子交换起始缓冲液；配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl缓冲液并内含lmol/L NaCl作为离子交换洗脱缓冲液；用起始缓冲液将上清液加载到离子交换柱上，用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，收集活性峰，即得高纯度SOD液。
全文摘要
本发明公开了一种从罗非鱼血液中提纯超氧化物歧化酶(SOD)的方法，包括以下步骤将收集到的洁净罗非鱼血红细胞用双蒸水稀释后，经超声波辅助细胞破膜处理；依次加入无水乙醇和氯仿沉淀杂蛋白，离心，收集上清液，并用氮吹仪去除有机溶剂；将收集到的上清液在60℃条件下加热处理，离心，收集上清液；采用多功能蛋白快速纯化液相色谱系统控制，将经上述步骤得到的SOD液用阴离子交换进行纯化，得到的高纯度SOD液。本发明提纯方法耗时短，操作单元精简，适合于工业化生产；能较好地解决罗非鱼血排放造成的环境污染问题，并能够显著地增加企业的附加值。
文档编号C12N9/02GK102888386SQ20121043409
公开日2013年1月23日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者李来好, 岑剑伟, 杨贤庆, 郝淑贤, 刘在军, 吴燕燕, 黄卉, 魏涯, 林婉玲, 邓建朝, 周婉君, 石红 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所