猪流行性腹泻病毒分离培养方法
【专利摘要】本发明涉及猪流行性腹泻病毒分离培养方法，将仔猪动小肠冲洗干净后利用培养基进行培养，并进行接种，检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液，培养收获出现细胞病变(CPE)后收获细胞，继续冻融接种单层vero细胞，利用培养基培养得到出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。与现有技术相比，本发明的分离成功率高，分离得到的猪流行性腹泻病毒病毒毒力强、分离的病毒纯度高。
【专利说明】猪流行性腹泻病毒分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒分离培养方法，尤其是涉及猪流行性腹泻病毒分离培养方法。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种主要引起猪的接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，病毒的感染途径主要是消化道，病毒经口和鼻感染后，进入小肠，而后病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结。病毒的复制是在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行。由于病毒增殖首先造成细胞器的损伤，继而出现细细胞功能障碍。肠绒毛萎缩，造成了吸收表面积的减少，小肠黏膜碱性磷酸酶含量显著减少进而引起营养物质吸收障碍，这是引起腹泻的主要原因。
[0003]原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，原代培养的细胞生物学特性变化较少，最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载体。国外早在1993年就有猪肠细胞原代培养的报道。其它类型的猪组织细胞原代培养的报道也不少，国内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动物身上，而关于猪IEC原代培养的方法一直较少。目前，国内外尚无通过猪小肠黏膜上皮细胞(IEC)的原代培养分离猪流行性腹泻病毒的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就 是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种分离成功率高、分离的病毒毒力强、分离的病毒纯度高的猪流行性腹泻病毒分离培养方法。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]猪流行性腹泻病毒分离培养方法，该方法包括以下步骤:
[0007](I)将仔猪动脉放血致死，无菌操作取出小肠，剔除肠系膜，置于37°C预热的DMEM-F12不完全培养基的平皿中备用；
[0008](2)将小肠剪成8~10cm，用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗，反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出，液体清亮为止，纵向剖开肠管，用清洗液清洗数次，取出小肠，利用DMEM-F12完全培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻刮取肠粘膜组织，用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入无菌II型胶原酶至0.lwt%终浓度；分别置4°C和37°C各消化12h和2h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，在1000r/min离心IOmin后移去上层清液并用DMEM-F12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按(I~5) XlO5密度接种六孔板，37°C、5v/v% CO2培养；
[0009](3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1:1的悬液，反复冻融3次，上清液经0.45u滤膜过滤，接种于单层猪IEC细胞，37°C吸附lh，加DMEM-F12完全培养基培养，37°C、5v/v% CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞；[0010](4)将收获的病变细胞反复冻融三次，接种单层vero细胞，37°C吸附lh，加DMEM-F12完全培养基培养，37°C、5V/V% CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。
[0011]所述的DMEM-F12 不完全培养基的组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L> L-Arginine HCl 147.5mg/L>D-Glucose 3151mg/L。
[0012]所述的清洗液为无血清的DMEM/F12清洗液。
[0013]所述的无血清的DMEM/F12清洗液的组成为NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L> L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose 3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHC031200mg/L。
[0014]所述的DMEM-F12 完全培养基的组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L>L-Arginine HCl 147.5mg/L>L-Clutamine 365mg/L、D_Glucose3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHC031200mg/L，加入 10% 的胎牛血清。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0016](I)分离成功率高:猪小肠粘膜上皮细胞是猪流行性腹泻病毒的靶细胞，与其他传代细胞相比更适合PEDV的生长繁殖。
[0017](2)分离的病毒毒力强:猪小肠粘膜上皮细胞最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载体，病毒在肠上皮细胞中复制增殖，相当于病毒在动物体内的一次复壮过程。
[0018](3)分离的病毒纯度高:一种传代细胞通常可以适应几种不同的病毒生长繁殖，而猪小肠粘膜上皮细胞选择性较单一，作为PEDV的靶细胞，分离的病毒也较为单一。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0020]实施例
[0021]猪流行性腹泻病毒分离培养方法，包括以下步骤:
[0022](I)将仔猪动脉放血致死，无菌操作取出小肠，剔除肠系膜，置于37°C预热的DMEM-F12不完全培养基的平皿中备用；
[0023](2)将小肠剪成8~10cm，用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗，反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出，液体清亮为止，纵向剖开肠管，用清洗液清洗数次，取出小肠，利用DMEM-F12完全培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻刮取肠粘膜组织，用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入无菌II型胶原酶至0.lwt%终浓度；分别置4°C和37°C各消化12h和2h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，在1000r/min离心IOmin后移去上层清液并用DMEM-F 12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按(I~5) XlO5密度接种六孔板，37°C、5v/v% CO2培养；
[0024](3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1:1的悬液，反复冻融3次，上清液经0.45u滤膜过滤，接种于单层猪IEC细胞，37°C吸附lh，加DMEM-F12完全培养基培养，37°C、5v/v% CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞；
[0025](4)将收获的病变细胞反复冻融三次，接种单层vero细胞，37°C吸附lh，加DMEM-F12完全培养基培养，37°C、5V/V% CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。
[0026]其中，使用的DMEM-F12不完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KC131L 8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L> D-Glucose 3151mg/L。清洗液为无血清的 DMEM/F12 清洗液，其组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose 3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L。DMEM-F12 完全培养基的组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L> L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose 3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHC031200mg/L，加入 10% 的胎牛血清。
[0027]对实施例分离得到的猪流行性腹泻病毒进行病毒毒力测定，其结果如下所示:
[0028]表1
[0029]
【权利要求】
1.猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)将仔猪动脉放血致死，无菌操作取出小肠，剔除肠系膜，置于37°c预热的DMEM-F12不完全培养基的平皿中备用； (2)将小肠剪成8~10cm，用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗，反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出，液体清亮为止，纵向剖开肠管，用清洗液清洗数次，取出小肠，利用DMEM-F12完全培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻刮取肠粘膜组织，用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入无菌II型胶原酶至0.lwt%终浓度；分别置4°C和37°C各消化12h和2h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，在1000r/min离心IOmin后移去上层清液并用DMEM-F 12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按(I~5)X IO5密度接种六孔板，37°C、5v/v% CO2培养； (3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1:1的悬液，反复冻融3次，上清液经0.45u滤膜过滤，接种于单层猪IEC细胞，37°C吸附lh，加DMEM-F12完全培养基培养，37°C、5V/V% CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞； (4)将收获的病变细胞反复冻融三次，接种单层veix)细胞，37°C吸附lh，加DMEM-F12完全培养基培养，37°C、5V/V% CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的 DMEM-F12 不完全培养基的组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L>D-Glucose 3151mg/L。
3.根据权利要求1·所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的清洗液为无血清的DMEM/F12清洗液。
4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的无血清的 DMEM/F12 清洗液的组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D_Glucose3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHC031200mg/L。
5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的 DMEM-F12 完全培养基的组成为 NaCl 7000mg/L、KC1311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl147.5mg/L>L-Clutamine 365mg/L、D_Glucose3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L，加入10%的胎牛血清。
【文档编号】C12N7/00GK103820396SQ201210470116
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月19日 优先权日:2012年11月19日
【发明者】张春玲, 倪建平, 訾玉华, 何锡忠, 李春华, 蒋凤英, 张婉华, 周宗清, 彭丽英 申请人:上海佳牧生物制品有限公司, 上海市农业科学院