专利名称：一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法
技术领域：
本发明属于菌种培养技术领域，涉及一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法。
背景技术：
金花菌是茯砖茶发花 过程中自然形成的一种具有益生性能的优势菌，学名为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。获砖茶是一种主销边疆地区的古老茶品，具有生津止渴、消滞减肥等益生功效，研究表明这与金花菌的存在是密不可分的。自然发酵的茯砖茶中易生长曲霉、青霉等多种杂菌，影响了金花菌的正常生长，从而降低了茯砖茶的品质，且发酵周期较长。若能人工培养获得金花菌的孢子粉，用以接种发酵茯砖茶，不仅可以缩短发酵周期，而且降低杂菌的污染，从而提高茯砖茶的品质。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，以获得人工培养金花菌的孢子粉，用以接种发酵茯砖茶，不仅可以缩短发酵周期，而且降低杂菌的污染。本发明是通过以下技术方案来实现一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，包括以下步骤I)将金花菌接种至种子培养基斜面，26 30°C培养5d，得到种子培养物；2)向种子培养物加入无菌水，洗下金花菌孢子，充分振荡后，得到均匀分散的孢子悬液；3)将麸皮与水以IOOg:80 IOOmL的比例充分混合后作为培养基，在培养容器中铺平，厚度为O. 8 I. 5cm,湿热灭菌；灭菌后，以5 15%的体积比接种孢子悬液，充分摇匀，在26 30°C恒温培养，接种后培养容器的出口用纱布封盖，待白色菌丝开始萌发时在纱布上加盖无菌透气封口膜，在白色菌丝萌发结束黄色菌丝开始萌发时去掉无菌透气封口膜，培养6 8d后得到曲种；4)将麸皮与水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作为培养基，在培养容器中铺平，厚度为2. O 3. Ocm,湿热灭菌；灭菌后，以5 10%的质量比接种曲种,在26 30°C恒温培养，接种后O 36h内培养容器的出口用纱布封盖，并在白色菌丝萌发结束黄色菌丝刚刚萌发时去掉无菌透气封口膜，继续培养3 4d后停止培养，得到麸曲；5)将麸曲粉碎后过筛，得到金花菌孢子粉。所述的金花菌是自茯砖茶中分离纯化得到，其分离纯化方法为取茯砖茶茶叶10g，加入90mL无菌水，IlOr mirT1震荡IOmin得到菌悬液，并进行梯度稀释，将梯度浓度的菌悬液分别涂布到CZG(5%NaCl)培养基上，28°C恒温培养；取适宜稀释浓度的菌落，进行划线分离，28°C培养5d后挑取单菌落，再次划线分离，直至挑取单菌落后镜检无杂菌，得到金花菌的纯菌种，转接至斜面于4°C保存。所述的步骤I)中所用的种子培养基为CZG培养基(5%NaCl)。
所述的步骤2)中，向种子培养物加入无菌水，洗下金花菌孢子，无菌操作倒入装有等体积玻璃珠的锥形瓶中，以100 120r · mirT1振荡5 15min,得到均勻分散的孢子悬液。所述的步骤3)中，所述的湿热灭菌时，将麸皮与水充分混匀后分装锥形瓶中，110 121°C灭菌20 30min ;灭菌结束后，立即振荡摇散培养基。置于无菌操作台中冷却
至室温。所述还继续培养3 5d后金花菌的闭囊壳数量丰富，呈均匀金黄色。
所述步骤4)中当白色菌丝萌发前加盖无菌透气封口膜，菌丝变黄前去掉，培养至金黄色停止培养。所述步骤5)中麸曲经粉碎后过100目筛；或者麸曲粉碎后置于密闭的无菌容器中，低温储藏。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，以粗代精选用了麸皮培养基，不仅成本低、方法稳定、易于操作，且获得的孢子肥大而稠密；而且在白色菌丝萌发期间，通过加盖无菌透气封口膜，一方面控制通气量，另一方面控制培养基的水分，保证了培养基表面的湿度适宜，避免了金花菌在白色菌丝萌发期间以无性孢子萌发，减少了杂菌污染，从而提高所需的有性孢子的质量。所获得的金花菌孢子粉中，其孢子含量为8 X IO8个/g。本发明提供的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，短时间即可获得大量的金花菌孢子粉，所获得的金花菌孢子粉可以用以微生物有效成分的提取，也可以直接用作人工发酵茯砖茶的菌种，大大缩短茯砖茶制作周期，减少杂菌的污染，从而提高茯砖茶品质。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明所述的金花菌可以采用现有各菌种保藏中心的保藏菌种，也可以自行分离纯化。比如采用划线法进行分离纯化取获砖茶茶叶IOg,加入90ml无菌水，IlOr .mirT1震荡IOmin得到菌悬液,并进行梯度稀释(至IO6倍)，将梯度浓度的菌悬液分别涂布到CZG(5%NaCl)培养基上，28°C恒温培养；取适宜稀释浓度的菌落，进行划线分离，28°C培养5d后挑取单菌落，再次划线分离，直至挑取单菌落后镜检无杂菌，得到金花菌的纯菌种，转接至斜面于4°C保存。实施例I—种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，包括以下步骤步骤I)菌种活化取自茯砖茶中分离纯化得到的金花菌接种至CZG(5%NaCl)斜面培养基(试管18X 180mm)，28°C培养(需氧)，培养至5d时菌落呈现金黄色，即得到种子培养物，备用。步骤2)制备孢子悬液将上述培养好的种子培养物加入30mL无菌水，洗下金花菌孢子，无菌操作倒入装有等体积玻璃珠的锥形瓶中，以lOOi^mirT1振荡lOmin，得到均匀分散的孢子悬液，备用。步骤3)孢子培养取麸皮，以每IOOg加水80mL配制固体培养基，充分混匀后分装250mL锥形瓶中，铺平厚度为1.0 1.3(^，以八层纱布包好，1211灭菌301^11。灭菌结束后，立即振荡摇散培养基。置于无菌操作台中冷却至室温，接种步骤2)的孢子悬液lmL，并充分摇匀后于28°C恒温培养箱培养。待培养至第2d白色菌丝萌发，在锥形瓶的出口加盖无菌透气封口膜，白色菌丝逐渐长满培养基并在培养第3d时去掉。继续于28°C恒温培养箱中培养至7d，培养基呈现干燥紧致的饼状，且金花菌的闭囊壳数量丰富，均匀金黄色，即得到曲种，备用。步骤4)扩大培养按上述加水量润料均匀后，取曲盘，摊平厚度为2. O 3. 0cm，八层纱布覆盖，灭菌后冷却至室温，以10%的接种量接种至曲盘，培养4 5d。其中培养12h后加盖无菌透气封口膜，至培养36h后菌丝变黄前去掉,继续于28°C恒温培养箱中培养至4 5d，停止培养。步骤5):孢子收集将上述麸曲经粉碎后过100目筛，即得到 金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密闭的无菌容器中，低温长期储藏。实施例2步骤I):菌种活化取自茯砖茶中分离纯化得到的金花菌接种至CZG(5%NaCl)斜面培养基(试管15 X 150mm)，30°C培养，培养至5d时菌落呈现金黄色，即得到种子培养物，备用。步骤2):制备孢子悬液将上述培养好的种子培养物加入20mL无菌水，洗下金花菌孢子，无菌操作倒入装有等体积玻璃珠的锥形瓶中，以IlOr min—1振荡lOmin，得到均匀分散的孢子悬液，备用。步骤3):孢子培养取麸皮，以每IOOg加水IOOmL配制固体培养基，充分混匀后分装500mL锥形瓶中，铺平厚度为O. 8 I. Ocm,以八层纱布包好，121°C灭菌30min。灭菌结束后，立即振荡摇散培养基。置于无菌操作台中冷却至室温，接种步骤2)的孢子悬液2mL，并充分振荡摇匀后放置29°C恒温培养箱，培养第2d加盖无菌透气封口膜，并于培养第3d去掉。继续在培养至7d，培养基呈现干燥紧致的饼状，且金花菌的闭囊壳数量丰富，均匀金黄色，即得到曲种，备用。步骤4):扩大培养按上述加水量润料均匀后，取曲盘，摊平厚度为2. O 2. 5cm,八层纱布覆盖，灭菌后冷却至室温，以5%的接种量接种至曲盘，培养4d。其中第14h加盖无菌透气封口膜，并继续培养15 20h后菌丝变黄前去掉，培养至金黄色停止培养。步骤5):孢子收集将上述麸曲经粉碎后过100目筛，即得到金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密闭的无菌容器中，低温长期储藏。实施例3步骤I):菌种活化取自茯砖茶中分离纯化得到的金花菌接种至CZG(5%NaCl)斜面培养基(试管20X200mm)，28°C培养，培养至5d时菌落呈现金黄色，即得到种子培养物，备用。步骤2):制备孢子悬液将上述培养好的种子培养物加入30mL无菌水，洗下金花菌孢子，无菌操作倒入装有等体积玻璃珠的锥形瓶中，以IlOr · min—1振荡5min，得到均匀分散的孢子悬液，备用。步骤3):孢子培养取麸皮，以每IOOg加水80mL配制固体培养基，充分混匀后分装500mL锥形瓶中，铺平厚度为O. 8 I. Ocm,以八层纱布包好，121°C灭菌30min。灭菌结束后，立即振荡摇散培养基。置于无菌操作台中冷却至室温，接种步骤2)的孢子悬液2mL，并充分摇匀于28°C恒温培养箱培养，并培养第2d加盖无菌透气封口膜，菌丝逐渐变黄于第3d时去掉。继续在28°C恒温培养箱中培养至6d，培养基呈现干燥紧致的饼状，且金花菌的闭囊壳数量丰富，均匀金黄色，即得到曲种，备用。步骤4):扩大培养按上述加水量润料均匀后，取曲盘，摊平厚度为2. O 3. Ocm,八层纱布覆盖，灭菌后冷却至室温，以10%的接种量接种至曲盘，培养4d。其中第12h加盖无菌透气封口膜，并继续培养20 24h后菌丝变黄前去掉，培养至金黄色停止培养。步骤5):孢子收集将上述麸曲经粉碎后过100目筛，即 得到金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密闭的无菌容器中，低温长期储藏。
权利要求
1.一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将金花菌接种至种子培养基斜面，26 30°C培养5d，得到种子培养物； 2)向种子培养物加入无菌水，洗下金花菌孢子，充分振荡后，得到均匀分散的孢子悬液； 3)将麸皮与水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作为培养基，在培养容器中铺平，厚度为O. 8 I. 5cm,湿热灭菌； 灭菌后，以5 15%的体积比接种孢子悬液，充分摇匀，在26 30°C恒温培养，接种后培养容器的出口用纱布封盖，待白色菌丝开始萌发时在纱布上加盖无菌透气封口膜，在白色菌丝萌发结束黄色菌丝开始萌发时去掉无菌透气封口膜，培养6 8d后得到曲种； 4)将麸皮与水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作为培养基，在培养容器中铺平，厚度为2. O 3. 0cm，湿热灭菌； 灭菌后，以5 10%的质量比接种曲种，在26 30°C恒温培养，接种后O 36h内培养容器的出口用纱布封盖，并在纱布上加盖无菌透气封口膜，并在白色菌丝萌发结束黄色菌丝刚刚萌发时去掉无菌透气封口膜，继续培养3 4d后停止培养，得到麸曲； 5)将麸曲粉碎后过筛，得到金花菌孢子粉。
2.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述的金花菌是自茯砖茶中分离纯化得到，其分离纯化方法为取茯砖茶茶叶10g，加入90mL无菌水，IlOr · HiirT1震荡IOmin得到菌悬液，并进行梯度稀释，将梯度浓度的菌悬液分别涂布到CZG(5%NaCl)培养基上，28°C恒温培养；取适宜稀释浓度的菌落，进行划线分离，28°C培养5d后挑取单菌落，再次划线分离，直至挑取单菌落后镜检无杂菌，得到金花菌的纯菌种，转接至斜面于4°C保存。
3.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤I)中所用的种子培养基为CZG培养基(5%NaCl)。
4.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)中，向种子培养物加入无菌水，洗下金花菌孢子，无菌操作倒入装有等体积玻璃珠的锥形瓶中，以100 120r · mirT1振荡5 15min,得到均勻分散的孢子悬液。
5.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)中，所述的湿热灭菌时，将麸皮与水充分混匀后分装锥形瓶中，110 121°C灭菌20 30min;灭菌结束后，立即振荡摇散培养基，置于无菌操作台中冷却至室温。
6.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)中，去掉无菌透气封口膜后，继续培养3 5d金花菌的闭囊壳数量丰富，呈均匀金黄色。
7.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中当白色菌丝萌发前加盖无菌透气封口膜，菌丝变黄前去掉，培养至金黄色停止培养。
8.如权利要求I所述的茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中麸曲经粉碎后过100目筛；或者麸曲粉碎后置于密闭的无菌容器中，低温储藏。
全文摘要
本发明公开了一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，包括将金花菌接种至CZG斜面培养基，26～30℃培养5d，得到种子培养物；向种子培养物加入无菌水，洗下金花菌孢子，充分振荡后，得到均匀分散的孢子悬液；在培养基上接种孢子悬液，在26～30℃恒温培养，在白色菌丝萌发前加盖无菌透气封口膜，并在黄色菌丝萌发时去掉，继续培养3～5d后得到曲种；然后再进行扩大培养得到麸曲；将麸曲粉碎后过筛，得到金花菌孢子粉。本发明以获得人工培养金花菌的孢子粉，既可以用于金花菌有效成分的提取，也可以用以接种发酵茯砖茶，不仅可以缩短发酵周期，而且降低杂菌的污染。
文档编号C12N3/00GK102965328SQ20121047047
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者吕嘉枥, 李玉婷 申请人:陕西科技大学