一种向微拟球藻叶绿体中导入外源dna的方法及相关的叶绿体基因组序列的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物基因工程【技术领域】，具体的说是一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。基因序列包括SEQID?NO:1所示的序列、SEQ?ID?NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因。具体方法通过电穿孔法将包括SEQ?ID?NO:1所示的序列、SEQ?ID?NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。本发明提供了根据七株微拟球藻叶绿体基因组之间的保守基因以及微拟球藻叶绿体和硅藻或褐藻叶绿体基因组的保守基因，可以用于设计构建在微拟球藻中通用的叶绿体遗传改造体系以及多个种属单细胞微藻通用的叶绿体遗传改造体系。
【专利说明】一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物基因工程【技术领域】，具体的说是一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。
技术背景
[0002]能源和资源短缺已经成为制约我国经济持续发展、影响我国国家安全的重大战略问题。基于生物催化剂清洁、高效、可再生等特点，生物制造可以大大减少工业发展对化石资源依赖，减少能耗、物耗、水耗和废弃物排放，显著提高经济效益，增强市场竞争力。与石化路线相比，生物制造可以平均节能30-50%，减少人类对环境的影响达20-60%。太阳光是地球上最充足的清洁能源。光合作用是唯一能捕捉太阳能的生物途径，还可以固定二氧化碳，因此是实现利用太阳能与大幅减排CO2进行清洁能源生产的有效途径。
[0003]微藻是最有潜力实现现实意义上的光能整合生物制造的细胞工厂之一，其优势在于：第一、高效光能转化生物质：微藻(包括原核蓝藻和真核藻类)，和绿色高等植物一样，有比较完整的光合作用系统。微藻的理论光合作用效率最高可达10%。相比而言，陆生作物一般仅能将O. 1-0. 7% (C3作物）或I. 5^2. 5% (C4作物）的太阳能转化为生物质。可见，微藻作为光能整合生物加工细胞工厂的优势远大于陆生植物。此外，一些微藻具备出色的环境耐受能力，可以在淡水、海水、生活废水、工业废水中生长；在通入烟道气时强劲生长，能够室外规模培养。第二、高效CO2固定：微藻遍布于地球海洋、河流和湖泊等淡水和海洋水体中以及各种土壤(包括酷暑和寒冷的荒芜环境）里，甚至人迹罕至的南北极等极端环境中。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球二氧化碳固定量的40%以上，在能量转化和碳元素循环中起到重要的作用。大规模微藻培养有望实现工业化方式固定太阳能和大幅度减排CO2，提供低碳的清洁能源。第三、高效积累高能量密度、高附加值产物：微藻代谢途径丰富，以微拟球藻为例，它不仅可以在静止状态下大量积累油脂(甘油三酯，即生物柴油)，还可以积累微藻蛋白（藻蓝蛋白、饲料蛋白、必需氨基酸)、长链多不饱和脂肪酸（AA、EPA、DHA)、多种色素(虾青素、胡萝卜素、叶黄素）等高附加值产物，可以用于开发颜料、肥料、土壤调节剂、抗氧剂、食品添加剂、化妆品。
[0004]海洋微拟球藻（Nannochloropsis sp.),是一种海洋单细胞微藻,在分类学上归属于褐藻门（Phaeophyta),大眼藻纲（Eustigmatophyceae),单珠藻科（Monodopsidaceae)。微拟球藻直径2-5 μ m，无组织分化，生态分布广泛；具有丰富的在藏藻株资源；进化地位独特，是单细胞微藻中独立的一个属。有研究比较了 31种微藻的生物量、脂质含量及产量，其中海洋微藻Nannochloropsis的脂质产量排在第一位(表1)。已发现许多株Nannochloropsis都具有I)生长迅速；2)在高光强或营养缺失条件下积累大量三脂酰甘油（TAG)等优点。此外，在一些大型(如美国Solix公司）和半工业规模(亚利桑那州立大学、中国科学院青岛生物能源与过程研究所）室外培养中发现，当通入烟道气时，Nannochloropsis (如 Nannochloropsissalina和 Nannochloropsis oculata 0Z—I)倉泛强劲生长，且能在生长静止期积累大量的油脂，具备大规模工业化培养的潜力。此外，微拟球藻藻体微小，富含碳水化合物、蛋白质和多不饱和脂肪酸，已被作为优良饵料大量应用于水产养殖；微拟球藻还含有多种经济价值较高的色素，如玉米黄素、斑蝥黄素和虾青素等。可见，微拟球藻作为功能基因组学研究和商业化应用具有明显的优势。
[0005]表1代表性藻种生物量积累、油脂含量和油脂产量
[0006]
【权利要求】
1.一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的序列，其特征在于：序列包括SEQ ID NO: I所示的序列、SEQ ID N0:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因。
2.按权利要求1所述的向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的序列，其特征在于：所述基因序列包括SEQ ID NO: I所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列、SEQ ID N0:2所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列以及插入两者之间的外源基因。
3.按权利要求1或2所述的向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的序列，其特征在于：所述外源基因为一个或多个基因。
4.按权利要求1或2所述的向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的序列，其特征在于：所述DNA序列具有叶绿体适用的启动子、终止子和选择标记的DNA片段。
5.一种权利要求1所述的利用向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的基因序列的导入外源DNA的方法，其特征在于：通过电穿孔法将包括SEQID NO: I所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。
6.按权利要求5所述的利用向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的基因序列的导入外源DNA的方法，其特征在于：通过电穿孔法将包括SEQ IDNO: I所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列、SEQ ID N0:2所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。
【文档编号】C12R1/89GK103834640SQ201210494514
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2012年11月27日
【发明者】路延笃, 徐健, 辛一, 魏力 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所