专利名称：同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。
背景技术：
樱桃是经济价值很高的果品之一，但是容易受病毒的为害。至今已发现68种侵染楼桃的病毒，其中苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)和李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)危害较为严重。近年来，由于不断从国外大量引进樱桃种子和苗木新品系以及国内不同地区苗木和种子的频繁调运，加快了病毒的传播。李春敏等(1997)利用PAS-ELISA检测出昌黎地区甜樱桃ACLSV的感染率为47. 1%。牛建新等(2003)用RT-PCR检测出了库尔勒香梨上的ACLSV。李青等(1996)利用ELISA法对北京地区的桃、樱桃携带PNRSV的情况进行了检测；阮小凤等(1998，2004)对陕西省甜樱桃、桃上的病毒病的发生情况进行了 ELISA检测，发现在这两种果树上，PNRSV、PDV,ACLSV的发生率较高，之后用改良RT-PCR对樱桃PDV和PNRSV进行了检测。侯义龙等(2005，2006)应用RT-PCR检测桃和樱桃及起组培苗上的PNRSV，调查大连市甜樱桃品种‘红灯’的田间植株时发现被检植株PNRSV的感染率达100%。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。本发明所提供的用于 检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙；所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No. 2所示；所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No. 3所示，另一条引物序列如SEQ IDNo. 4所示。所述植物病毒可为所述苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒。本发明所提供的辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测樱桃的叶片的反转录cDNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为同时感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为632bp的条带，则待测樱桃候选为感染苹果褪绿叶斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为455bp的条带，则待测樱桃候选为感染李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物中无大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为没有感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒。上述方法中，所述用引物对进行PCR扩增的方法为先用引物对甲进行PCR扩增，10个循环后，再加入引物对乙继续进行PCR扩增，直至扩增结束。上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中每条引物的浓度为O. 5μΜ ;所述PCR扩增的退火温度为57°C。含有上述引物的用于检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒中的应用也属于本发明的保护范围。本发明中所建立的多重RT-PCR可以同时检测出生产中樱桃ACLSV和PNRSV病毒复合侵染现象，比单一 RT-PCR节省时间；操作上也更为简单；此外，也减少了试验中所消耗的药品，更为经济。当反转录体系中的带病植株的总RNA量为10_4yg时，经过PCR扩增后，仍可以同时检测到两种病毒。
图1为CTAB法提取樱桃叶片RNA电泳。1-4 ‘红灯’、考特、Chelan、F8。图2为ACLSV、PNRSV病毒引物AF1/AR1和PF/PR ‘红灯’叶片的PCR预扩增。A ACLSV ；B PNRSV ；M D2000DNA 分子标准量。图3为ACLSV、PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在不同退火温度下PCR扩增‘红灯’樱桃叶片电泳。A =ACLSV ；B =PNRSV0 M:2000bp DNA分子标准量;1-6分别为45°C、48°C、51°C、55°C、57°C和 60°C ;A:引物 AF2/AR2 ;B:引物 PF/PR。图4为ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在复合侵染的‘红灯’叶片的多重PCR预扩增电泳。M:D2000DNA分子标准量；1 :只加入AF2/AR2 ；2 :只加入PF/PR ；3 :同时加入 AF2/AR2 和 PF/PR。图5为ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在复合侵染的‘红灯’叶片的多重 PCR 扩增电泳。M:D2000DNA 分子标准量；1 =ACLSV ;2，3 ACLSV+PNRSV ；4 =PNRSV ；5 :健康叶片；6 :空白对照。图6为ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在复合侵染‘红灯’叶片的多重RT-PCR灵敏度检测。M :D2000DNA分子标准量；1-7 :以RNA总量分别为10'10'10'10'10_5、10_6、10_7μ g反转录后进行PCR反应；8 :健康叶片；9 :空白对照。图7为引进的无毒苗ACLSV和PNRSV病毒mRT-PCR检测电泳图。M D2000marker ；1-8 Chelan λ Cristalina、Skeana、Sonata、Black republican、Sonet、Selah Λ BlackYork + :阳性对照。 图8为147份樱桃资源ACLSV和PNRSV病毒mRT-PCR检测电泳图。1-147品种(种)名见表3-1 ；M D2000marker ； + :阳性对照；—:健康植物。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本申请说明书中ACLSV均指苹果褪绿叶斑病毒，PNRSV均指李属坏死环斑病毒。材料采自北京市农林科学院林业果树研究所樱桃资源圃的147份待检测樱桃资源叶片，具有ACLSV和PNRSV病毒感病特征的樱桃‘红灯’叶片作为阳性对照。感病的‘红灯’叶片症状为叶片细长，叶面不平展；主叶脉皱缩；叶片褪绿，甚至叶片全为黄色，部分有穿孔。检测方法( I)樱桃叶片总RNA的提取CTAB 裂解液10mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)25mM EDTA (ρΗ8· O), 2. OmM NaCl，O. 5g/L 亚精胺(spermide),1-巯基乙醇(用前加)；I)、叶片材料lg，加入少许PVP-40，液氮研磨充分后，迅速加入预热好CTAB裂解液，涡旋振荡30-60s，65°C水浴lOmin，期间振荡摇匀1_2次；2)、迅速置冰上，冰浴3min，加入等体积积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，振荡摇匀，冰浴 lOmin,4°C 13000rpm 离心 IOmin ； 3)、重复步骤2 —次；4)、取上清液，加入I / 4体积的IOMLiCl混匀，(TC沉淀4h ；5)、4°C 13000rpm离心20min,弃上清，加入O. 5ml0. 5M SDS溶解沉淀，加入等体积氯仿/异戍醇(体积比24:1)抽提一次,冰浴5min ；6)、4°C 13000rpm离心lOmin，取上清，加入2. 5倍体积无水乙醇，_80°C沉淀30min ；7)、4°C 13000r pm 离心 20min,弃上清；8)、用75%的乙醇沉淀洗漆，4°C 5000rpm离心3min ;重复一次；9)、瞬时离心30s，吸出残余的酒精，常温凉干沉淀3min ;用适量无RNase水溶解沉淀，-80°C保存。(2)引物的设计
Γ 引物名称i 列5· -3'·度Usp)大小(bp)
权利要求
1.一种用于检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙； 所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No. 2所示； 所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No. 3所示，另一条引物序列如SEQ ID No. 4所示。
2.一种辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测樱桃的叶片的反转录cDNA为模板，用权利要求1中所述引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为同时感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为632bp的条带，则待测樱桃候选为感染苹果褪绿叶斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为455bp的条带，则待测樱桃候选为感染李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物中无大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为没有感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述用权利要求1中所述引物对进行PCR扩增的方法为先用所述引物对甲进行PCR扩增，10个循环后，再加入所述引物对乙继续进行PCR扩增，直至扩增结束。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系中每条引物的浓度为0. 5 μ M ;所述PCR扩增的退火温度为57°C。
5.含有权利要求1所述引物的用于检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒的试剂或试剂盒。
6.权利要求1所述引物或权利要求5所述的试剂或试剂盒在检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。该用于检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙；所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No.2所示；所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.3所示，另一条引物序列如SEQ ID No.4所示。本发明中所建立的多重RT-PCR可以同时检测出生产中樱桃ACLSV和PNRSV病毒复合侵染现象，比单一RT-PCR节省时间；操作上也更为简单；此外，也减少了试验中所消耗的药品，更为经济。当反转录体系中的带病植株的总RNA量为10-4μg时，经过PCR扩增后，仍可以同时检测到两种病毒。
文档编号C12Q1/70GK103031387SQ20121058559
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者李天忠, 马国玲, 张开春 申请人:中国农业大学