专利名称：一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是ー种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶(枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶简称BTG)活性的多肽及其筛选方法和应用。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(transglutaminase, EC2. 3. 2. 13,简称TG),是ー种催化酰基转移反应的酶，能催化蛋白质分子内、分子间以及蛋白质与氨基酸之间形成e -(Y-Glu)-Lys异肽键使其共价交联聚合，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能，因而该酶在食品エ业和医药エ业中具有广泛的应用。TG的生产方法有动植物组织提取法和微生物发酵法两种。TG的早期生产采用动物组织提取法，但由于动物组织来源少、提取エ艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵的缘故，酶的生产应用一直受到很大限制。微生物来源的TG因其酶活性不依赖Ca2+，且最有希望实现エ业生产，引起了广泛关注，目前仅茂源链霉菌来源的TG实现了商业化生产应用在食品加工中。链霉菌属来源的TG具有信号肽和前肽，由于前肽的作用，使得链霉菌来源的TG在细胞内没有活性，而不损害细胞，然后通过信号肽分泌到细胞外，实现TG的生产。和链霉菌来源的TG相比，枯草芽孢杆菌来源的TG研究要少得多，1996年才由Kobayashi等首次在枯草芽孢杆菌 中发现了 TG，其没有信号肽和前肽，只存在于芽孢上，交联芽孢表面蛋白，防止其被蛋白酶降解，从而起到保护芽孢的作用。由于TG具有蛋白交联的活性，对宿主细胞具有毒性作用，因此，虽然2007年葡萄牙Placido等实现BTG在大肠杆菌中表达，但是在不同的诱导和培养条件下酶得率都非常低。目前，仍难以大量制备枯草芽孢杆菌来源的BTG。通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了ー种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用，该多肽使BTG能够在宿主细胞低活性表达，减轻BTG对宿主细胞的毒性作用，而经过蛋白酶简单处理后其活性又能得到恢复，为BTG的高效表达奠定了基础。本发明采取的技术方案是氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中的应用。而且，应用的方法步骤如下将所述多肽和凝血因子Xa可识别酶切位点序列连接，形成polypeptide-1-E-G-R,枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因再定向克隆到polypeptide-1-E-G-R的下游，形成polypeptide-1-E-G-R-BTG片段；该多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，经凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢复枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性。抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽，所述多肽为将SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。一种筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，步骤如下(I)选择来源不同的链霉菌的谷氨酰胺转胺酶前肽序列；(2)通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌谷氨酰胺转胺酶前肽克隆到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶的N端，两者之间添加凝血因子Xa识别序列连接；(3)将全部编码序列克隆入pET_28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间；(4)在E. Coli BL21 (DE3)菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码序列的融合蛋白；(5)通过荧光法检测融合蛋白的酶活，筛选对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。而且，所述步骤⑴中来源不同的链霉菌为S. cinnamoneus、S. caniferus、
b.fraaiae、S. hygroscopicus、b.mobaraense、b.netropsis和 b. platensis。而且，所述步骤(5 )中荧光法检测的具体步骤如下将纯化浓缩后的蛋白液各取500 ii L，平分成两份，其中的ー份用凝血因子Xa酶切6h，获得去除了 N端多肽序列的成熟枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶，测得各蛋白液的荧光強度，计算得出酶活，通过比较未经凝血因子Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，得到各多肽序列对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的抑制率。而且，所述荧光強度的检测步骤为反应体系的总体积ImL :N，N-ニ甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC) 8. 33 y mo I/L, Tris HClpH7. 550mmol/L, DTT3mmol/L，酶液 200 u L ;反应体系于 37°C反应 30min，加入IOmmoVL(NH4)2SO4终止反应，于激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。本发明的优点和积极效果是1、本发明抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽通过融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可达到60%以上，可使细胞毒性较强的BTG先以活性受抑制的形式在宿主细胞中表达，然后在凝血因子Xa (Factor Xa)的作用下，去除抑制物，又使其活性得到恢复。2、本发明多肽由于可特异性抑制BTG的活性，而且可随时去除，解除抑制效应，可以应用于抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中，以及应用于制备枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转胺酶中。3、本发明多肽的筛选方法如链霉菌来源的TG，在BTG的N端加上一段多肽，先通过多肽来抑制BTG的活性，使其低活性表达，继而通过蛋白酶的切割，去除多肽，解除对BTG的抑制，充分发挥其生物活性，从而减轻其对宿主细胞的毒性作用，为其能够实现在宿主细胞中的高效表达奠定基础。
图1为本发明五种融合蛋白的纯化后浓缩图，泳道1-5依次为his-proCan-1-E-G-R-BTG、 his-proFra-1-E-G-R-BTG、 his-proHyg-1-E-G-R-BTG、his-proNet-1-E-G-R-BTG、his-proPIa-1-E-G-R-BTG ；图2为本发明另两种融合蛋白的纯化后浓缩图，泳道1-2依次为his-proMob-1-E-G-R-BTG、his-proCin-1-E-G-R-BTG ；图3为本发明七种融合蛋白对BTG活性的抑制效果图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进ー步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
链霉菌属来源的TG具有信号肽和前肽，由于前肽的作用，使得链霉菌来源的TG在细胞内没有活性，无法起到交联蛋白的作用，从而不损害细胞。但是枯草芽孢杆菌来源的BTG没有信号肽和前肽，只有具有活性的成熟肽，因此希望通过链霉菌属TG的前肽来抑制BTG的活性。选择与比较了来源于7种不同的链霉菌(S. cinnamoneus、S. caniferus、b. fradiae、S. hygroscopicus、b. mobaraense、b. netropsis、b. platensis) TG 目U月太序列，分别记为 proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla,与 BTG 结合及其抑制 BTG的情況。主要通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌TG前肽克隆到BTG的N端，两者之间添加FactorXa识别序列(ATCGAGGGAAGG)连接。再将全部编码序列克隆入pET_28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间，从而去除pET_28a(+)载体上的17 Tag,防止其对多肽抑制效应的干扰。在E. Coli BL21(DE3)菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码 7 种序列的融合蛋白 his-proCin-1-E-G-R-BTG、his-proCan-1-E-G-R-BTG、his-proFra-1-E-G-R-BTG, his-proHyg-1-E-G-R-BTG、 his-proMob-1-E-G-R-BTG、his-proNet-1-E-G-R-BTG、his_proPIa-1-E-G-R-BTG。本发明通过荧光法检测酶活，分析筛选得到了抑制作用较强的S. caniferus来源的TG前肽序列(序列表中序列I)。一、抑制BTG活性的多肽的设计合成与活性筛选1、多肽编码序列的设计合成首先设计出7种不同多肽的编码序列，分别由Al、A2、A3、A4、A5、A6、A7表示，该序列依次为 7 种 TG 前肢序列(proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla),Factor Xa特异识别序列以及BTG的N端31bp序列。由生物公司合成并克隆在pUC57的NdeI与HindIII酶切识别位点之间，质粒保存于E. Coli ToplO中。(基因委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)；然后利用质粒小提试剂盒从E. ColiToplO中提取质粒，80 U L体系双酶切3_4h。按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应组分加入量质粒50 ii L ;IOXK Buffer8 U L ；
NdeI2u L ；HindIII2u L ；ddH2018u L ；总体积80iiL。最后全部经琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到上述多肽基因Al、A2、A3、A4、A5、A6、A7，作为重叠PCR的上游基因。2、BTG基因的获得从本实验室保存的B. subtilisl68中提取基因组作为模板，PCR获得BTG基因，作为重叠PCR的下游基因B。
权利要求
1.氨基酸序列为SEQID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于应用的方法步骤如下 将所述多肽和凝血因子Xa可识别酶切位点序列连接，形成polypeptide-1-E-G-R,枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因再定向克隆到polyp印tide-1-E-G-R的下游，形成polyp印tide-1-E-G-R-BTG片段；该多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，经凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢复枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性。
3.抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽，其特征在干所述多肽为将SEQIDNo:1的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。
4.一种筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于步骤如下 ⑴选择来源不同的链霉菌的谷氨酰胺转胺酶前肽序列； ⑵通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌谷氨酰胺转胺酶前肽克隆到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶的N端，两者之间添加凝血因子Xa识别序列连接； ⑶将全部编码序列克隆入pET-28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间； ⑷在E. Coli BL21 (DE3)菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码序列的融合蛋白； (5)通过荧光法检测融合蛋白的酶活，筛选对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。
5.根据权利要求4所述的筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于所述步骤⑴中来源不同的链霉菌为S. cinnamoneus、S. caniferus、S. fradiae、b. hygroscopicus、S. mobaraense、S.netropsis 和 S. piatensis。
6.根据权利要求4所述的筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于所述步骤(5)中荧光法检测的具体步骤如下 将纯化浓缩后的蛋白液各取500 u L，平分成两份，其中的ー份用凝血因子Xa酶切6h，获得去除了 N端多肽序列的成熟枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶，测得各蛋白液的荧光强度，计算得出酶活，通过比较未经凝血因子Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，得到各多肽序列对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的抑制率。
7.根据权利要求6所述筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于所述荧光強度的检测步骤为 反应体系的总体积1111し队}ニ甲基酪蛋白0.67§/1，丹磺尸胺(MDC)8. 33umol/L,Tris HCl pH7. 5 50 mmol/L, DTT 3mmol/L，酶液 200 y L ;反应体系于 37°C反应 30min，加A IOmmoVL(NH4)2SO4终止反应，于激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。
全文摘要
本发明涉及一种氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶(枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶简称BTG)活性中的应用。本发明抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽通过融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可达到60%以上，可使细胞毒性较强的BTG先以活性受抑制的形式在宿主细胞中表达，然后在凝血因子Xa(Factor Xa)的作用下，去除抑制物，又使其活性得到恢复。
文档编号C12N9/10GK103060283SQ201210585268
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者路福平, 刘逸寒, 蔺松, 王春霞, 王建玲 申请人:天津科技大学