L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生l-氨基酸的方法
【专利摘要】本发明提供了一种L-氨基酸生产力增强的埃希氏菌属微生物及利用所述埃希氏菌属微生物生产L-氨基酸的方法，其中将所述微生物转化为具有增强的NAD激酶活性和tehB基因编码的具有SEQ?ID?NO.2氨基酸序列的酶失活。
【专利说明】L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生L-氨基酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有用氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生L-氨基酸的方法，由于还原力增加致使细胞活性提高并缩短细胞培养时间。
【背景技术】
[0002]已知微生物通过发酵作用产生有用产物，需要大量的能量，如ATP (5’ -三磷酸腺苷)或还原力，如NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，以增强其生物合成途径。
[0003]在微生物的代谢过程中，分解反应所用的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和合成反应所用的NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)二者在细胞内的平衡是非常重要的。该平衡通过下式所示的NAD磷酸化或NADP的去磷酸化进行控制。
[0004]NAD++ATP — NADP++ADP
[0005]NADP+ — NAD++ 磷酸盐
[0006]在大肠杆菌(E.coll)中，已知NAD的磷酸化被nadK (或yf jB)基因编码的NAD激酶(EC2.7.1.23)催化。NAD激酶利用Mg2+作为酶反应的辅助因子，并被NADPH和NADH别构抑制。现已知 NAD+ 的 Km 值是 2000 μ Μ, ATP 的 Km 值是 2500 μ M (Eur.J.Biochem.，(2001)268:4359-4365)。
[0007]尽管其在代谢途径中具有明显的重要性，然而，对NADP的去磷酸化的研究却很少。虽然古生菌詹氏甲烧球菌(Methanococcus jannaschii)的NAD激酶同系物，经证明具有NADP磷酸酶活性 ，然而在真核生物和真细菌中仍然未鉴定到编码具有这类活性的酶的基因。在大肠杆菌中，cysQ基因的产物显示出高NADP和NADPH磷酸酶活性，但纯化的酶的动力学研究表明，它不是所述有机体真正的NADP磷酸酶(BiochemJ., (2007)402:205-218, Biosc1.Biotechnol.Biochem., (2008)72:919-930)。
[0008]在许多微生物中发现了 NAD激酶活性，对催化活性具有重要意义的NAD-结合位点和NAD激酶的活性位点显示了物种之间高度保守的氨基酸序列。例如，各种微生物，包括革兰氏阳性菌，都显示在螺旋2、4和5 (其各自以H2、H4和H5表示)的三级结构预测中显示出高度的同源性(Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:583-593)。
[0009]NAD激酶产生的NADP最后提供还原力，特别是在大肠杆菌中大量产生有用产物所需的NADP+/NADPH是合成代谢反应的必需元素(Biochem J.，(2007)402:205-218)。在大肠杆菌中，NADPH主要通过以下方式产生:1)氧化磷酸戊糖途径，2)TCA循环中的NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶(icd基因)，以及3)转氢酶(pntAB基因)(J BiolChem., (2004)279:6613-6619)。
[0010]这些反应使用NADP作为底物产生NADPH，从而通过增加NADP的细胞内水平来增加NADPH的水平。因此，为了各种代谢物质的工业化生产，在增加NADP的细胞内水平上做了许多尝试，如，I)通过在大肠杆菌中超表达nadK增加NADPH和胸苷产量(BiotechnolLett.，(2009) 31:19291936)，2)通过在大肠杆菌中超表达nadK增加NADPH和PHB (聚羟基丁酸酯)的产量(Appl Microbiol Biotechnol., (2009) 83:939947)，以及 3)与在大肠杆菌中超表达nadK相似,通过在棒状杆菌(Corynebacterium)中超表达ppnK增加赖氨酸产量。以上尝试的关键点在于增加nadK基因的表达。然而，在上述每种情况下，还必须增加诸如ATP的磷酸源，以通过增加NADPH的水平来增加还原力，其源于通过NAD激酶的高表达而增加的NADP水平。
[0011]在微生物中，ATP主要通过电子传递系统或底物水平磷酸化产生。产生的ATP通过分解为细胞提供能量，也通过糖酵解反应或氧化磷酸化反应重新生成。基于这一事实，已经对将细菌ATP再生系统应用到生产过程中进行了研究，以便在有用产物的大量生产过程中提供能量(Biosci Biotechnol Biochem., (1997)61:840-845)。然而，如上所述，有关增加磷酸源方法的研究很少，而增加磷酸源是通过NAD激酶的高表达来增加还原力以及随后增加生物合成产物所需的。此外，在向细胞供应能量方面，对通过大量产生ATP来增加能量供应的研究很少，并且相关技术中也没有进行利用ATP作为磷酸源的研究。
【发明内容】
[0012]技术问题
[0013]因此，为了研发产生高浓度L-氨基酸的微生物，本发明人已经研究了参与各种能量和还原力代谢的基因。结果，本发明人发现了一种能够有效产生高浓度的L-氨基酸的微生物，其具有增强的nadK编码的NAD激酶的表达，并且tehB基因编码的氨基酸序列如SEQID N0.2的酶失活，并在此基础上，能够有效地增加磷酸源ATP，从而完成了本发明。
[0014]换而言之，本发明涉及通过在微生物中有效增加还原力来增加所需氨基酸产量的方法，其中，额外供应在NADP生物合成过程中待还原的ATP，以增加具有L-氨基酸生产力的埃希氏菌属(Escherichia)的还原力。
[0015]因此，本发明的目的在于提供一种L-氨基酸生产力增强的埃希氏菌属微生物，其中所述微生物经转化而具有增强的NAD激酶活性并且tehB基因编码的具有SEQ ID N0.2氨基酸序列的酶失活，从 而具有增强的还原力。
[0016]本发明的另一个目的在于提供一种利用所述埃希氏菌属微生物产生L-氨基酸的方法。
[0017]技术方案
[0018]为了实现以上目的，本发明提供了具有增强的L-氨基酸生产力的埃希氏菌属微生物，其中所述微生物经转化具有增强的NAD激酶活性且tehB基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2的酶失活。本发明的另一目的是，提供利用所述埃希氏菌属微生物产生L-氨基酸的方法。
[0019]有益效果
[0020]根据本发明，通过增强NADP，在具有L-氨基酸生产力的微生物的细胞内能量代谢中补充还原剂NADPH，并且通过使tehB基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2的酶失活，来供应随后缺乏的ATP，从而通过恢复能量代谢平衡、增加细胞活性及减少培养时间，来提高L-氨基酸生产力。
【专利附图】
【附图说明】[0021]图1为所示为用于增加大肠杆菌nadK基因拷贝数的载体nadK_pINT17E。
[0022]最佳实施方式
[0023]本发明提供了具有增强的L-氨基酸生产力的微生物和利用所述微生物产生L-氨基酸的方法。
[0024]本发明的产生L-氨基酸的微生物包括任何原核或真核微生物，其实例包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。本发明的微生物优选是属于埃希氏菌属的微生物，更优选为大肠杆菌。
[0025]在本发明中，L-氨基酸优选为L-苏氨酸或L-色氨酸。
[0026]在本发明优选的实施方案中，本发明提供了具有增强的L-氨基酸生产力的埃希氏菌属微生物，其中所述微生物经转化具有增强的NAD激酶活性且tehB基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2的酶失活，从而提高还原力。
[0027]本发明中，NAD激酶是指一种具有利用来自于ATP或其他化合物的磷酸基团将NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转换为NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)活性的酶。
[0028]本发明具体公开的具有NAD激酶活性的蛋白质序列为SEQ ID N0.4的氨基酸序列，并且编码所述NAD激酶的nadK基因优选为具有SEQ ID N0.3的碱基序列的多核苷酸。
[0029]在本发明中，可以通过本领域公知的各种方法增强具有L-氨基酸生产力的埃希氏菌属的NAD激酶活性。例如，所述方法可以包括但并不限于:在染色体中插入编码NAD激酶的碱基序列本身或包括外源表达调控区的多核苷酸的方法，通过将其导入载体系统增加拷贝数的方法，或者通过用其他调控序列取代基因表达调控区、修饰全部或部分的表达调节序列或基因本身突变 来增强酶活性的方法。
[0030]更优选地，本发明可以利用通过将编码NAD激酶的碱基序列导入菌株的染色体DNA上以增加拷贝数的方法来增强具有L-氨基酸生产力的属于埃希氏菌属微生物的NAD激酶活性。
[0031]本领域技术人员应当理解，染色体DNA内NAD激酶拷贝数增加，与通过染色体外载体增加NAD激酶拷贝数，具有相同的效果，或与通过在染色体内或染色体外位点修饰编码NAD激酶的nadK基因的表达调控区通过基因本身突变而增加表达水平，具有相同的效果。当使用载体时，用导入碱基序列的重组载体转化具有L-氨基酸生产力的埃希氏菌属微生物，从而制备NAD激酶活性增强的埃希氏菌属的微生物。
[0032]本发明所用的载体没有特别的限定，可以使用任何已知的表达载体。优选地，可以使用 pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322 或 pMW118 载体。
[0033]根据本发明的一个实施方案,通过转化增强NAD激酶活性，增加了菌株的细胞内NADP 和 NADPH 水平。
[0034]为了增加ATP的产生，本发明还应用了使tehB基因编码的酶活性失活的方法。
[0035]在本发明中，已知tehB基因(NCBI Gene ID:945979)为编码碲酸盐抗性蛋白或预测的S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的基因，但他的作用至今尚不清楚。
[0036]然而，最近的研究报告称，大肠杆菌tehB基因的缺失，与亲本菌株相比，表现出ATP产量增加150%，这意味着，该结果归因于由甲硫氨酸生物合成S-腺苷甲硫氨酸所需的ATP 减少(FEMS Microbiol Lett., (2009)297:217-224)。[0037]具体而言，预测的S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的序列可能由SEQ IDN0.2的氨基酸序列所披露。另外，编码所述酶的tehB基因来自于大肠杆菌，优选地，具有SEQ ID N0.1的碱基序列的多核苷酸。
[0038]使tehB基因编码的酶活性失活的方法，包括修饰相应基因以防止产生具有SEQ IDN0.1的碱基序列的基因编码的酶的所有方法。所述方法的示例为，通过同源重组的方法缺失全部或部分基因，或通过在相应基因内插入转座子以抑制酶的表达，或通过插入抗生素抗性基因以抑制酶的表达，但并不限于此。
[0039]如本发明所用的术语“转化”是指一种将基因导入到宿主细胞中以在宿主细胞中表达的方法。如果转化的基因在宿主细胞中处于表达的状态，则所述转化的基因包括插入到宿主染色体或位于该染色体其他部分上的任何基因。此外，所述基因包括DNA和RNA，作为能编码多肽的多核苷酸。只要该基因可以被导入宿主细胞并在其中表达，则基因可以以任何形式被导入。例如，基因可以以表达盒的方式被导入宿主细胞，所述表达盒是自身包含用于表达该基因的全部元件的多核苷酸表达体(expressome)。表达盒包含与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。所述表达盒可以采用能够自我克隆的表达载体类型。所述基因也可以通过自身或以待可操作地连接于在宿主细胞表达所需序列的多核苷酸表达体形式，导入宿主细胞。
[0040]在本发明优选的实施方案中，所述方法转化的微生物可以为大肠杆菌，优选为大肠杆菌(E.coli)CA03-448(KCCM11167P)、CA03-449(KCCM11168P)或CA04-200 KKCCMl 1166P)。
[0041]本发明还提供了利用埃希氏菌属微生物产生L-氨基酸的方法。
[0042]在本发明优选的实施方案中，本发明提供了生产L-氨基酸的方法，其通过在包含蔗糖或葡萄糖作为主要碳源的培养基中培养L-苏氨酸或L-色氨酸生产力增强的埃希氏菌属的重组微生物，产生L-氨基酸。具体而言，本发明提供了产生L-氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤:将埃希氏菌 属的重组微生物接种和培养于全部或部分含有蔗糖或葡萄糖作为碳源的培养基中，以及从该培养基中分离L-氨基酸。
[0043]本发明的培养过程，可以在本领域已知的合适培养基和培养条件下进行。根据所用的菌株，本领域技术人员可容易地对培养过程进行调整。培养过程的实例包括分批式、连续式和补料分批型，但并不限于此。培养方法所用的培养基应当优选满足特定菌株的要求。
[0044]本发明所用的培养基含有蔗糖或葡萄糖作为主要碳源。含有高浓度蔗糖的糖蜜也可作为碳源，培养基可以含有适量的各种碳源，并无限制。能够使用的氮源的实例包括，有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆和大豆粗粉，以及无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，并且它们可以单个使用或组合使用。可以向培养基中添加磷源，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠的盐。此外，培养基还可含有金属盐如硫酸镁和硫酸亚铁。另外，培养基可以补充有氨基酸、维生素和适当的前体。这些培养基或前体可以通过分批式或连续式方法添加到培养物中。
[0045]在培养过程中，可以适当添加化合物，如氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸，以调节培养物的PH值。进一步，在培养期间，可以适当加入消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以减少培养物中泡沫的形成。为了将培养物维持于有氧状态，可以将氧气或含氧气体注入到培养物中。为了保持培养物处于厌氧及微需氧状态，可以不注入气体，或将氮气、氢气或二氧化碳注入到培养物中。
[0046]将培养物维持在27-37°C，优选30-35°C。培养可以持续，直到获得所需量的所需物质，优选培养时间为10-100小时。
[0047]可通过本领域已知的适当方法，根据例如分批式、连续式或分批补料类型，实施收集和回收本发明的培养步骤产生的氨基酸的方法，以便从培养基中收集所需氨基酸。
【具体实施方式】
[0048]下文将参照实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅供说明之用，并非意图限制本发明的范围。
[0049]实施例1.制备源自大肠杆菌(E.coli)的tehB基因编码的酶失活的产L-苏氨酸菌株
[0050]通过同源重组，使产L-苏氨酸的菌株即大肠杆菌KCCM10541 (Korean PatentN0.10-0576342)的 tehB 基因缺失。
[0051]大肠杆菌KCCM10541菌株来源于产L-苏氨酸的菌株大肠杆菌KFCC10718 (KoreanPatent Publication N0.10-1992-0008365)的菌株，其亲本菌株大肠杆菌 KFCC10718 具有L-甲硫氨酸类似物抗性，甲硫氨酸营养缺陷型表型，L-苏氨酸类似物抗性，渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型，L-赖氨酸的类似物抗性，和α -氨基丁酸抗性，并能产生L-苏氨酸。
[0052]待缺失的tehB基因(NCBI基因ID:945979)已知编码预测的S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶。当基因缺失后，不再需要S-腺苷甲硫氨酸的产生中所用的ATP，因此为了减少能量消耗量，选择tehB基因作为靶基因，并且其具有SEQ ID N0.1的碱基序列。
[0053]对于失活，使用一步失活，其是采用Datsenko KA等(Datsenko KA et al., ProcNatl Acad Sci USA., (2000)97:66406645)开发的λ Red重组酶构建突变体的技术。
[0054]为了确认插入到基因中，使用氯霉素抗性基因作为标记。为了除去氯霉素抗性基因，使用 Cre/loxP 位点特异性重组系统(BMC Biotechnology (2001) 1:7)。
[0055]聚合酶链式反应(下文称为PCR)通过利用pMloxCm载体为模板和具有部分tehB基因和部分氯霉素抗性基因序列的下述引物I和引物2，在以下反应条件下实施:94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸I分钟，进行30个循环；从而扩增约1200bp的基因片段。
[0056]表1
【权利要求】
1.一种L-氨基酸生产力增强的埃希氏菌属(Escherichia)微生物,其中所述微生物经转化具有增强的NAD激酶活性且tehB基因编码的具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列的酶失活。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述NAD激酶为具有SEQID N0.4的氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中通过下述一种或多种方法增强所述NAD激酶的活性:通过染色体插入或载体导入增加拷贝数，取代或修饰表达调控区，以及基因突变。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述失活通过下述方法中的一种或多种进行:通过同源重组缺失部分或全部基因，通过在相应基因中插入转座子抑制酶表达，以及通过插入抗生素抗性基因抑制酶表达。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物为大肠杆菌(E.coli)。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述L-氨基酸为L-苏氨酸或L-色氨酸。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物提供有蔗糖同化能力。
8.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物是产L-苏氨酸的大肠杆菌，保藏编号为KCCM11167P的CA03-448，或保藏编号为KCCM11168P的CA03-449。
9.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物是保藏编号为KCCMl 1166P的产L-色氨酸大肠杆菌CA04-2001。
10.产生L-氨基酸的方法，包括以下步骤:将权利要求1-9中任一项所述的埃希氏菌属微生物接种并培养于全部或部分含有蔗糖或葡萄糖作为碳源的培养基中；和从所述培养基中分离所述L-氨基酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述L-氨基酸为L-苏氨酸或L-色氨酸。
【文档编号】C12N15/69GK103443267SQ201280009090
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年1月18日 优先权日:2011年1月18日
【发明者】李光镐, 李根喆, 李锡明, 黄荣彬 申请人:Cj第一制糖株式会社