囊泡及由其产生之制剂的制备方法

囊泡及由其产生之制剂的制备方法
【专利摘要】本公开内容提供了用于制备囊泡的方法。在一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的熔融混合物以及将所述形成囊泡之脂质的熔融混合物添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原的囊泡，其中在所述添加步骤中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于120℃的温度。在另一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的熔融混合物以及将包含抗原的水溶液添加至所述形成囊泡之脂质的熔融混合物中以形成含有抗原的囊泡，其中将所得混合物放置在低于60℃的控温条件下。在另一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的溶液以及通过注射将所述形成囊泡之脂质的溶液添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原的囊泡。
【专利说明】囊泡及由其产生之制剂的制备方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年I月13日提交的序列号为61/432，569的美国临时专利申请的优先权；其整体通过引用并入本文。
【背景技术】
[0003]囊泡作为细胞膜的模型首次描述于二十世纪六十年代(参见Bangham等，J.Mol.Biol.13 =238-252,1965) ο已发现囊泡在递送小分子药物、疫苗佐剂(vaccineadjuvancy)、基因转移和诊断成像方面具有许多应用(例如，参见Liposome Technology,第 3 版，Gregory Gregoriadis Informa HealthCare, 2006 以及 Liposomes:APracticalApproach (The Practical Approach Series, 264),第 2 版,Vladimir Torchilin和 VolkmarWeissig 编，Oxford University Press, USA, 2003)。
[0004]已描述了制备囊泡的多种方法(例如，参见上文引用的参考文献以及Walde和Ichikawa, Biomol.Eng., 18:143-177, 2001)。但是,本领域中仍需要可用于将物质包封在囊泡内的方法。
[0005]本领域已描 述的一种方法是所谓的熔化法。首先将形成囊泡的脂质在高温(例如，120°C )下熔化。第二步中，通过将水性缓冲剂(例如碳酸氢盐缓冲剂)添加至熔融脂质中以产生乳剂。最后，在降低的温度(例如，50°C)下使待包封的物质与乳剂组分均质化，继而冻干。或者，将来自乳剂的囊泡冻干，随后在待包封物质存在下使其重溶。
[0006]尽管例如该方法可非常适于包封可经受高温的物质和/或能够迅速扩散到空囊泡中的小分子，但是我们已发现其不适于包封疫苗中常常涉及的抗原类型(例如多肽、病毒等)。特别地，我们已发现这些方法产生低包封效率，并且可显著地降低相关抗原的活性(例如，如通过免疫应答测量的)。因此，本领域中需要能够包封抗原同时使对抗原活性之影响最小化的囊泡的制备方法。

【发明内容】

[0007]本公开内容提供了囊泡的制备方法。在一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的熔融混合物以及将所述形成囊泡之脂质的熔融混合物添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原的囊泡，其中在所述添加步骤中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于120°C的温度。在另一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的熔融混合物以及将包含抗原的水溶液添加至所述形成囊泡之脂质的熔融混合物中以形成含有抗原的囊泡，其中使所得混合物放置在低于60°C的控温条件下。在另一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的溶液以及通过注射将所述形成囊泡之脂质的溶液添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原的囊泡。本公开内容还提供了使用这些方法制备的含有抗原的囊泡制剂及其用途。
【专利附图】

【附图说明】[0008]图1示出了 DCP、MPG和CHO (胆固醇)的DSC热谱图。其熔化发生转变在单一扫描上重叠。还示出了这些脂质混合物的DSC热谱图。
[0009]图2示出了 NISV的冷冻断裂(freeze fracture)图像，其显示在未受影响囊泡上的大的切片囊泡。左下角的比例尺表示0.5 μ m。
[0010]图3示出了朗格缪尔(Langmuir)单层等温线，其表示作为代表单种表面活性剂与以比为5: 4:1之MPG: CHO: DCP的混合制剂的平均分子面积之函数的表面压力。
[0011]图4A和4B示出了胰蛋白酶消化对由四种不同方法配制之放射性标记HlNl抗原的NISV保留的作用。
[0012]图5示出了通过由四种不同方法配制之NISV的低温-TEM(cryo-TEM)的显微镜分析。⑷反向熔化法(inverted melt method) ； (B)熔化法；(C)熔化法_低温抗原添加(IOwer temperatureOf antigen addition);和(D)月旨质体氯仿法(liposomal chloroformmethod)。
[0013]定义
[0014]在整个本公开内容中，使用了以下段落中所定义的若干术语。
[0015]本文所使用的术语“抗原”是指含有能被抗体识别的一个或更多个表位(线性表位、构象表位、或二者皆有)的物质。在某些实施方案中，抗原可以是病毒、多肽、多核苷酸、多糖等。术语“抗原”既指亚单位抗原(即，与完整生物体分开和分离的抗原，其中所述抗原与所述生物体天然相关联)也指死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生物或其他微生物。在某些实施方案中，抗原可以是“免疫原”。
[0016]本文所使用的术语“包封(entrapping) ”是指物质和囊泡之间任何类型的物理缔合，所述缔合例如封装(encapsulation)、粘附(至囊泡的内壁或外壁)或包埋入壁，具有或不具有物质的挤出。该术语与术语“加载(loading)”和“含有”可互换使用。
[0017]本文所使用的术语“免疫应答”是指在动物中激发的应答。免疫应答可以指细胞免疫、体液免疫或者可包括这两者。免疫应答还可以限于免疫系统的一部分。例如，在某些实施方案中，免疫原性制剂可以诱导增强的IFNy应答。在某些实施方案中，免疫原性制剂可以诱导粘膜IgA应答(例如，如在鼻和/或直肠清洗物中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性制剂可以诱导全身性IgG应答(例如，如在血清中测量的)。
[0018]本文所使用的术语“免疫原性”意指能够在宿主动物中针对非宿主实体(例如,流感病毒)产生免疫应答。在某些实施方案中，该免疫应答形成由针对特定感染性生物(例如，流感病毒)的疫苗所激发之保护性免疫的基础。“免疫原”是免疫原性物质。
[0019]本文所使用的术语“治疗有效量”是指在接受治疗的患者中足以显示有意义之益处的量。免疫原性制剂的治疗有效量可根据如下因素变化，例如期望的生物学终点(biological endpoint)、制剂性质、施用途径、接受治疗的患者的健康情况、体型和/或年龄等。
[0020]本文所使用的术语“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸的聚合物。在一些实施方案中，多肽可包含除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白等)和/或可以进行另外的加工或修饰。本领域普通技术人员应领会，“蛋白质”可以是如细胞所产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其一部分。本领域普通技术人员应领会，蛋白质有时可包含多于一条多肽链，例如通过一个或更多个二硫键连接或者通过其他方式相缔合。多肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或者二者皆有，并且可以包含任何本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物。可用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。在某些实施方案中，多肽可包含至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少250个氨基酸或至少500个氨基酸。[0021]本文所使用的术语“多糖”是指糖的多聚物。所述多聚物可包括天然糖类(例如，阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔洛糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、辛酮糖(octolose)和神经氨酸(sialose))和/或经修饰的糖(例如，2’ -氟代核糖、2’ -脱氧核糖和己糖)。示例性多糖包括淀粉、糖原、葡聚糖、纤维素等。
[0022]本文所使用的术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物。所述聚合物可以包括天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟苷、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、二氢尿苷、甲基假尿苷、1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷和2-硫代胞苷)、经化学修饰的碱基、经生物学修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、经嵌入的碱基、经修饰的糖类(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、2’-O-甲基胞苷、阿拉伯糖和己糖)或者经修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5’ -N-亚磷酰胺连接)。
[0023]本文所使用的术语“小分子治疗物”是指非聚合的治疗性分子，其可以包含若干个碳-碳键，并且具有小于约1500Da (例如，小于约lOOODa、小于约500Da或者小于约200Da)的分子量。小分子治疗物可以在实验室中合成(例如，通过组合合成，使用工程化微生物等)或者可以天然存在(例如，天然产品)。一般来说，小分子治疗物可以改变、抑制、活化或以其他方式影响生物学事件。例如，小分子治疗物可以包括但不限于抗AIDS物质、抗癌物质、抗生素、抗糖尿病物质、免疫抑制剂、抗病毒物质、酶抑制剂、神经毒素、阿片样物质、催眠剂、抗组胺剂、润滑剂、镇定剂、抗惊厥剂、肌肉松弛剂以及抗帕金森物质、抗痉挛剂和肌肉收缩剂(包括通道阻断剂、缩瞳剂和抗胆碱能剂)、抗青光眼化合物、抗寄生物和/或抗原生动物化合物、细胞-细胞外基质相互作用的调节剂(包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子)、血管舒张剂、DNA、RNA或蛋白质合成抑制剂、抗高血压剂、镇痛剂、解热剂、留体和非甾体的抗炎剂、抗血管生成因子、抗分泌因子、抗凝血剂和/或抗血栓形成剂、局部麻醉剂、眼科制剂、前列腺素、抗抑郁剂、抗精神病物质、镇吐剂和成像剂。适用于本公开内容的方法中的示例性小分子的更完整列表可以见于在Pharmaceutical Substances:Syntheses,Patents,Applications,Axel Kleemann和Jurgen Engel 1?,Thieme Medical Publishing,1999 ；Merck Index:An Encyclopedia of Chemicals， Drugs， and Biologicals，Susan Budavari 等编，CRC Press,1996 以及 the United States Pharmacopeia-25/Nationalformulary-20，the United States Pharmacopeial Convention,Inc.出片反，2001。尽管不是必需的，但是优选所述小分子是有关政府部门或机构已认定的安全和有效使用的小分子。例如，FDA根据21C.F.R.§ § 330.5、331至361和440至460列出的人用药物以及FDA根据21C.F.R.§ § 500至589列出的兽用药物均被认为是根据本公开内容的方法可使用的。
[0024]本文所使用的术语“治疗”是指出于减轻、缓解、改变、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或者患病倾向而向患有疾病、具有疾病症状或患病倾向的患者施用制剂。在某些实施方案中，术语“治疗”是指对患者进行免疫接种。
[0025]某些实施方案的详细描述
[0026]1.囊泡的制备方法-反向熔化
[0027]本公开内容提供了囊泡的制备方法。囊泡一般具有由一个或更多个包含脂质(任选地，具有其他分子)的双分子层所包封的水性区室(aqueous compartment)。例如,如下文更详细讨论的，在一些实施方案中，本公开内容的囊泡包含有助于将脂质运送穿过粘膜的运送增强分子(例如胆汁酸或其盐)。
[0028]在一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的熔融混合物以及随后将包含抗原的水溶液添加至形成囊泡之脂质的熔融混合物中以形成含有抗原之囊泡的步骤。值得注意的，使所得混合物放置在低于60°C的控温条件下。在某些实施方案中，可使形成囊泡之脂质的熔融混合物放置在低于60°C的控温条件下(例如，使用水浴)，继而添加抗原溶液。或者，可将抗原溶液添加至形成囊泡之脂质的熔融混合物中，然后可使所得混合物放置在低于60°C的控温条件下。
[0029]在某些实施方案中，使通过将抗原溶液添加至熔融的形成囊泡之脂质中所产生的混合物放置在低于55°C例如低于50°C、低于45°C、低于40°C、低于35°C、低于30°C、低于25°C或甚至低于20°C的控温条件下。在某些实施方案中，使通过将抗原溶液添加至熔融的形成囊泡之脂质中所产生 的混合物放置在20~60°C例如20~50°C、20~40°C、20~30 °C、30 ~60 °C、30 ~50 °C、30 ~40 °C、40 ~60 °C、40 ~50 °C 或 50 ~60 V 的控温条件下。应理解，术语“控温条件”不要求将温度固定在特定温度，而是简单地将温度保持在一定范围(例如，一些值的±1°C、±2°C、±5°C、±10°C等)内或者将温度保持低于或高于特定温度。
[0030]在某些实施方案中，当被添加至熔融的形成囊泡之脂质的混合物时，包含抗原的水溶液处于低于50°C的温度，例如低于45°C、低于40°C、低于35°C、低于30°C、低于25V或甚至低于20°C的温度。在某些实施方案中，当被添加至熔融的形成囊泡之脂质的混合物时，包含抗原的水溶液处于20~60°C的温度，例如20~50°C、20~40°C、20~30°C、30~600C>30~50°C、30~40°C、40~60°C、40~50°C或50~60°C的温度。在某些实施方案中，使包含抗原的水溶液放置在温度受控下，继而添加至熔融的形成囊泡之脂质的混合物。
[0031]在某些实施方案中，当添加抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上50°C的温度。在某些实施方案中，当添加抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上45°C、40°C、35°C、30°C、25°C、20°C、10°C或5°C的温度。在某些实施方案中，当添加抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上5 ~5(TC，例如 5 ~4(TC、5 ~3(TC、5 ~2(TC、5 ~1(TC、10 ~5(TC、10 ~4(TC、10 ~3(TC或10~20°C的温度。例如，在某些实施方案中，当添加抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于110°c、低于100°C、低于90°C或低于80°C的温度。
[0032]在另一个方面中，本方法涉及提供形成囊泡之脂质的熔融混合物以及随后将熔融混合物添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原之囊泡的步骤。在这些方法中，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于120°C的温度。
[0033]在某些实施方案中，当添加至抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上50°C的温度。在某些实施方案中，当添加至抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上45°C、40°C、35 V、30°C、25 V、20°C、10°C或5 V的温度。在某些实施方案中，当添加至抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上 5 ~50°C，例如 5 ~40°C、5 ~30°C、5 ~20°C、5 ~10°C、10 ~50°C、10 ~40°C、10~30°C或10~20°C的温度。例如，在某些实施方案中，当添加至抗原溶液时，形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于110°c、低于100°C、低于90°C或低于80°C的温度。
[0034]在某些实施方案中，当添加熔融的形成囊泡之脂质的混合物时，包含抗原的水溶液处于低于50°C例如低于45°C、低于40°C、低于35°C、低于30°C、低于25°C或甚至低于20°C的温度。在某些实施方案中，当添加熔融的形成囊泡之脂质的混合物时，包含抗原的水溶液处于 20 ~6(TC例如 20 ~5(TC、20 ~4(TC、20 ~3(TC、30 ~6(TC、30 ~5(TC、30 ~400C >40~60°C、40~50°C或50~60°C的温度。在某些实施方案中，包含抗原的水溶液在温度受控下。[0035]本公开内容的方法避免了使抗原暴露于有机溶剂和高温。不希望受任何理论的束缚，这可以解释所得制剂中被包封抗原的高活性(即，抗原性和/或免疫原性)。
[0036]形成囊泡的脂质
[0037]脂质是有机分子，其一般不溶于水但是可溶于非极性有机溶剂(例如，乙醚、氯仿、丙酮、苯等)。脂肪酸是一类脂质，其包含与饱和或不饱和烃链连接的酸部分。具体实例包括月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等。脂肪酸的碱金属盐一般比酸本身更易溶于水。包含具有八个或更多个碳之烃链的脂肪酸及其盐常常表现出两亲性质，这是由于在同一分子中同时存在亲水性(头部)和疏水性(尾部)区域。包含极性头部基团的非离子型脂质也可表现出两亲性(即，表面活性剂)的性质。脂肪酸与甘油(1，2，3_三羟基丙烷)的三酯构成另一类脂质，称为甘油三酯，其常见于动物脂肪和植物油中。脂肪酸与长链单羟基醇的酯形成发现于蜡中的另一类脂质。磷脂是另一类脂质。其为甘油或神经鞘氨醇与脂肪酸和磷酸的酯或酰胺衍生物，这一点与甘油三酯类似。所得磷脂酸的磷酸基团可以与磷脂本身的乙醇胺、胆碱或丝氨酸进一步酯化。应理解，所述方法可以利用能够形成囊泡的任何脂质(包括现有技术中描述的任何脂质，例如在 Liposome Technology,第 3 版，Gregory Gregoriadis 编，Informa HealthCare, 2006以及 Liposomes:A Practical Approach (The Practical Approach Series, 264),第 2 版，Vladimir Torchilin 和 Volkmar Weissig 编，Oxford University Press, USA, 2003 中)。
[0038]在一些实施方案中，所述形成囊泡的脂质是磷脂。可以使用任何天然存在或合成的磷脂。不具限制地，具体磷脂的实例为L-α-(二硬脂酰基)卵磷脂、L-α-(二棕榈酰基)卵憐脂、L-α -憐脂酸、L-α -(二月桂酸基)-憐脂酸、L-α -(二肉?寇酸基)憐脂酸、L-C1-(二油酰基)磷脂酸、DL-α-(二棕榈酰基)磷脂酸、L-α-(二硬脂酰基)磷脂酸以及由脑、肝、卵黄、心脏、大豆等制备或合成制备的多种类型的L- α -磷脂酰胆碱及其盐。
[0039]在一些实施方案中，所述形成囊泡的脂质是非离子型表面活性剂。在本文中，非离子型表面活性剂囊泡称为“NISV”。不具限制地，合适的非离子型表面活性剂的实例包括基于甘油的酯连接型表面活性剂(ester-linked surfactant)。这样的甘油酯可以包含两种高级脂肪族酰基基团中的一种，例如每个酰基部分中含有至少十个碳原子。基于这样的甘油酯的表面活性剂可以包含多于一个甘油单位，例如多至5个甘油单位。可以使用甘油单酯，例如含有C12-C2tl烷酰基或烯酰基部分(例如己酰基、月桂酰基、肉豆寇酰基、棕榈酰基、油烯基(oleyl)或硬脂酰基)的那些。示例性的非离子型表面活性剂是1-单棕榈酰基甘油。
[0040] 在一些实施方案中，还可以使用醚连接型表面活性剂(ether-linkedsurfactant)作为非离子型表面活性剂。例如，基于甘油或具有多至4个碳原子的低级脂肪族二元醇的二元醇(如，乙二醇)的醚连接型表面活性剂是合适的。基于这样的二元醇的表面活性剂可以包含多于一个二元醇单位，例如多至5个二元醇单位(例如，二甘醇鲸蜡基醚和/或聚氧乙烯-3-月桂基醚)。可以使用二元醇或甘油的单醚，包括含有C12-C2tl烷基或烯基部分(例如己酰基、月桂酰基、肉豆寇酰基、鲸蜡基、油烯基或硬脂酰基)的那些。可使用的环氧乙烷缩合产物包括PCT公开N0.W088/06882中公开的那些(例如，聚氧乙烯高级脂肪族醚和胺表面活性剂)。示例性的醚连接型表面活性剂包括1-单鲸蜡基甘油醚和二甘醇鲸蜡基醚。
[0041]其他组分
[0042]在一些实施方案中，所述囊泡可以包含其他脂质和非脂质组分，只要其不妨碍囊泡形成即可。应理解，这些组分可以与形成囊泡的脂质共混合和/或可以与抗原共混合。在一些实施方案中，我们已发现将这些组分与形成囊泡的脂质共混合是有利的。
[0043]在一些实施方案中，所述囊泡可以包含有助于将脂质运送穿过粘膜的运送增强分子。如美国专利N0.5，876，721中所述，多种分子可以用作运送增强剂。例如，侧链C23碳原子携带羧酸的胆固醇衍生物和/或其衍生物可以用作运送增强剂。这样的衍生物包括，但不限于“胆汁酸”，胆酸和鹅脱氧胆酸、其与甘氨酸或牛磺酸的缀合产物(例如甘胆酸(glycocholic acid)和牛磺胆酸)、衍生物(包括脱氧胆酸和熊脱氧胆酸)以及这些酸各自的盐。还包含胆汁酸或盐的NISV在本文中称为“胆汁酸体(bilosome)”。在一些实施方案中，运送增强剂包括酰氧基化的氨基酸，例如酰基肉毒碱及其盐。例如，含有C6_2(l烷酰基或烯酰基部分的酰基肉毒碱(例如棕榈酰基肉毒碱)可以用作运送增强剂。本文所使用的术语“酰氧基化的氨基酸”旨在涵盖伯、仲和叔氨基酸以及α、β和Y氨基酸。酰基肉毒碱是酰氧基化的Y氨基酸的实例。应理解，囊泡可以包含多于一种类型的运送增强剂，例如一种或更多种不同的胆汁盐以及一种或更多种酰基肉毒碱。运送增强剂(如果存在的话)通常包含按重量计形成囊泡之脂质(例如，非离子型表面活性剂)的I至400%。在一些实施方案中，运送增强剂(如果存在的话)将包含按重量计形成囊泡之脂质的I至40% (例如，按重量计I至20%、按重量计I至25%、按重量计I至30%、按重量计I至35%、按重量计2至25%、按重量计2至30%或者按重量计2至35% )。
[0044]在某些实施方案中，所述囊泡可以不含运送增强分子。在一些实施方案中，所述囊泡可以不含“胆汁酸”例如胆酸和鹅脱氧胆酸、其与甘氨酸或牛磺酸的缀合产物(例如甘胆酸和牛磺胆酸)、衍生物(包括脱氧胆酸和熊脱氧胆酸)以及这些酸各自的盐。在一些实施方案中，所述囊泡可以不含酰氧基化的氨基酸，例如酰基肉毒碱及其盐以及棕榈酰基肉毒碱。
[0045]在一些实施方案中，所述囊泡可以包含离子型表面活性剂，例如用以使囊泡带负电荷。例如，这可以帮助使囊泡稳定以及提供有效的分散。不具限制地，酸性物质(例如高级烷酸和烯酸(例如，棕榈酸、油酸)或者含有酸性基团(包括磷酸酯)的其他化合物(例如，二烷基磷酸酯/盐(例如，二鲸蜡基磷酸酯/盐或磷脂酸或磷脂酰丝氨酸)))以及硫酸单酯/硫酸单酯盐(例如高级烷基硫酸酯/盐(例如，鲸蜡基硫酸酯/盐))均可用于该目的。离子型表面活性剂(如果存在的话)通常包含按重量计形成囊泡之脂质(例如，非离子型表面活性剂)的I至50%。例如，离子型表面活性剂(如果存在的话)可包含按重量计形成囊泡之脂质(例如，非离子型表面活性剂)的I~5%、1~10%、1~15%、1~20、1~25%、1 ~30%、1 ~35%、1 ~40%、1 ~45%、5 ~10%、5 ~15%、5 ~20%、5 ~25%、5 ~30%、5 ~35%、5 ~40%、5 ~45%、5 ~50%、10 ~15%、10 ~20%、10 ~25%、10 ~30%、10 ~35%、10 ~40%、10 ~45%、10 ~50%、15 ~20%、15 ~25%、15 ~30%、15 ~35%、15~40%、15~45%、15~50%、20~25%、20~30%、20~35%、20~40%、20~45%、20~50%、25~30%、25~35%、25~40%、25~45%、25~50%、30~35%、30~40%,30 ~45%、30 ~50%、35 ~40%、35 ~45%、35 ~50%、40 ~45%、40 ~50%或45 ~50%。
[0046]在一些实施方案中，所述囊泡可以包含分子量较高的、有助于形成双层的合适的疏水性物质(例如类固醇，如固醇(例如胆固醇))。在一些实施方案中，类固醇的存在可以辅助形成双层，所述囊泡的物理性质取决于所述双层。类固醇(如果存在的话)通常包含按重量计形成囊泡之脂质(例如，非离子型表面活性剂)的20至120% (例如，20~30%、20 ~40%、20 ~50%、20 ~60%、20 ~70%、20 ~80%、20 ~90%、20 ~100%、20 ~110%,30 ~40%、30 ~50%、30 ~60%、30 ~70%、30 ~80%、30 ~90%、30 ~100%、30 ~110%、30 ~120%、40 ~50%、40 ~60%、40 ~70%、40 ~80%、40 ~90%、40 ~100%、40 ~110%、40 ~120%、50~60%、50~70%、50~80%、50~90%、50~100%、50 ~110%、50 ~120%、60 ~70%、60 ~80%、60 ~90%、60 ~100%、60 ~110%、60 ~120%、70~80%、70~90%、70~100%、70~110%、70~120%、80~90%、80~100%、80 ~110%、80 ~120%、90 ~100%、90 ~110%、90 ~120%、100 ~110%、100 ~120%或 110 ~120% )。
[0047]在一些实施方案中，在冻干之前任何溶液或混合物中可包含冻干保护剂。示例性的冻干保护剂包括蔗糖、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、二甲基-琥珀酸盐缓冲剂(DMS)、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇和葡聚糖。
[0048]在一些实施方案中，本公开内容的囊泡是还包含离子型表面活性剂或类固醇的胆汁酸体。在一些实施方案中，所述胆汁酸体可以包含离子型表面活性剂和类固醇二者。
[0049]在一些实施方案中， 本公开内容的囊泡是不含运送增强分子并且还包含离子型表面活性剂或类固醇的非离子型表面活性剂囊泡(non-1onic surfactant vesicle, NISV)。在一些实施方案中，所述囊泡可以不含“胆汁酸”例如胆酸和鹅脱氧胆酸、其与甘氨酸或牛磺酸的缀合产物(例如甘胆酸和牛磺胆酸)、衍生物(包括脱氧胆酸和熊脱氧胆酸)以及这些酸各自的盐。在一些实施方案中，所述囊泡可以不含酰氧基化的氨基酸，例如酰基肉毒碱及其盐以及棕榈酰基肉毒碱。在一些实施方案中，NISV可以不含运送增强分子(例如，任何前述分子)并且包含离子型表面活性剂和类固醇二者。
[0050]冻干[0051]如本文中所讨论的，在一些实施方案中，本公开内容的方法包括冻干步骤。冻干包括将目标制备物冷冻，然后降低环境压力(以及任选地，对制备物进行加热)以使得经冷冻的溶剂直接从固相升华为气体(即，干燥阶段)。在某些实施方案中，所述干燥阶段分为初级和次级干燥阶段。[0052]可以通过将制备物置于容器(例如，烧瓶、印pendorf管等)中并任选地使容器在通过机械制冷(例如，利用干冰和甲醇、液氮等)冷却的浴中旋转来进行冷冻阶段。在一些实施方案中，所述冷冻步骤包括使制备物冷却至制备物的低共熔点以下的温度。由于低共熔点出现在制备物的固相和液相可共存的最低温度，因此使所述物质保持于该点以下的温度确保了在随后步骤中将发生升华而非蒸发。
[0053]干燥阶段(或当使用两个干燥阶段时的初级干燥阶段)包括降低压力以及任选地使制备物加热至溶剂能够升华的点。干燥阶段通常将大部分溶剂从制备物中除去。应领会，冷冻和干燥阶段不必是分开的阶段，而可以是以任何方式组合。例如，在某些实施方案中，冷冻和干燥阶段可以重叠。
[0054]次级干燥阶段可以任选地用于除去冷冻阶段期间吸收的残留溶剂。不希望受任何理论的束缚，该阶段涉及升高温度以破坏溶剂分子与经冷冻制备物之间形成的任何物理-化学相互作用。干燥阶段一经完成，在任选地将冻干产品密封之前可以用惰性气体(例如，氮气或氦气)打破真空状态。
[0055]再水化
[0056]如本文中所讨论的，在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使冻干的制备物再水化的步骤。这通常通过将冻干的制备物与水溶液混合来实现。在一些实施方案中，这涉及将水溶液添加至冻干的制备物中。
[0057]在一些实施方案中，所述水溶液包括缓冲剂。例如，不限于，可以使用PCB缓冲剂、Na2HP04/NaH2P04缓冲剂、PBS缓冲剂、N, N- 二羟乙基甘氨酸缓冲剂(bicine buffer)、Tris缓冲剂、HEPES缓冲剂、MOPS缓冲剂等。PCB缓冲剂通过将丙酸钠、二甲胂酸钠(sodiumcacodylate)和双Tris丙烷以2: I: 2的摩尔比混合而产生。改变所加入的HCl量可使pH在4~9的范围内缓冲。在一些实施方案中，可以使用碳酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，所述水溶液为无菌注射用水(water for injection, WFI)。
[0058]在一些实施方案中，可以使通过上述任意方法制备的含有抗原的囊泡制剂冻干备用，并随后在使用前进行再水化(例如，用无菌水或水性缓冲剂)。在一些实施方案中，可以在该再水化步骤期间添加佐剂(例如，通过掺入无菌水或水性缓冲剂中)。在一些实施方案中，含有抗原的囊泡制剂在冻干前可贮存于_80°C。在一些实施方案中，冻干制剂可贮存于-20°C至10°C (例如，-5°C至10°C、0°C至5°C或2°C至8°C)的温度范围。
[0059]囊泡大小和加工
[0060]应领会，囊泡制剂通常将包含具有一定大小的囊泡混合物。应理解，以下所列的直径数值对应于混合物内最常见的直径。在一些实施方案中，制剂中> 90%的囊泡将具有最常见数值的上下50%范围内的直径(例如，1000±500nm)。在一些实施方案中，该分布可以更窄，例如，制剂中〉90%的囊泡可以具有最常见数值的上下40%、30%、20%、10%或5%范围内的直径。在一些实施方案中，可以利用声处理或超声处理促进囊泡形成和/或改变囊泡粒径。在一些实施方案中，可以利用过滤、透析和/或离心来调整囊泡大小分布。[0061]在某些实施方案中，所述制剂可包含直径范围约IOnm至约10 μ m的囊泡。在某些实施方案中，囊泡具有约IOOnm至约5μπι的直径。在某些实施方案中，囊泡具有约500nm至约2μπι的直径。在某些实施方案中，囊泡具有约800nm至约1.5μπι的直径。在一些实施方案中，所述制剂可包含直径范围约150nm至约15 μ m的囊泡。在某些实施方案中,所述囊泡可具有大于ΙΟμπ?(例如，约15μπ?至约25μπ?)的直径。在某些实施方案中，所述囊泡可具有约0.1 μ m至约20 μ m、约0.1ym至约15 μ m、约0.1ym至约10 μ m、约0.5 μ m至约20 μ m、约 0.5 μ m 至约 15 μ m、约 0.5 μ m 至约 10 μ m、约 Iym 至约 20 μ m、约 Iym 至约 15 μ m或者约I μ m至约10 μ m的直径。在某些实施方案中，所述囊泡可具有约2 μ m至约10 μ m(例如，约Iym至约4μηι)的直径。在某些实施方案中，所述囊泡可具有小于150nm(例如,约50nm至约IOOnm)的直径。
[0062]抗原
[0063]一般地，应理解，可以利用本公开内容的方法包封任何抗原。如前文所讨论的，抗原可以以任何方式与囊泡缔合。在一些实施方案中，抗原可以存在于囊泡的水性核中。但是，根据其疏水性，抗原还可以部分地或完全地与双分子层相缔合。一般地，还应理解，在一些实施方案中，囊泡制剂可包含不与囊泡相缔合之一种或更多种抗原的量。
[0064]在一些实施方案中，可使用本公开内容的方法包封疫苗中包含的一种或更多种抗原。表1是合适疫苗的非 限制性列表。
[0065]表1
[0066]
【权利要求】
1.方法，其包括: 提供形成囊泡之脂质的熔融混合物；以及 将所述形成囊泡之脂质的熔融混合物添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原的囊泡，其中在所述添加步骤中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于120°c的温度。
2.方法，其包括: 提供形成囊泡之脂质的熔融混合物；以及 将包含抗原的水溶液添加至所述形成囊泡之脂质的熔融混合物中以形成含有抗原的囊泡，其中将所得混合物放置在低于60°C的控温条件下。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在添加步骤之前将所述形成囊泡之脂质的熔融混合物放置在低于60°C的控温条件下。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在所述添加步骤之前不将所述形成囊泡之脂质的熔融混合物放置在低于60°C的控温条件下。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤中所述包含抗原的水溶液处于低于约50°C的温度。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述包含抗原的水溶液处于低于约40°C的温度。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述包含抗原的水溶液处于低于约30°C的温度。`
8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述包含抗原的水溶液的温度是受控的。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上50°C的温度。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上40°C的温度。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上30°C的温度。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上20°C的温度。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上10°c的温度。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于不高于其熔点以上5°C的温度。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于约110°C的温度。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于约100°c的温度。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于约90°C的温度。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述形成囊泡之脂质的熔融混合物处于低于约80°C的温度。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡的脂质包含磷脂。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡的脂质包含非离子型表面活性剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为甘油酯。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为二醇或二醇醚。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为1-单棕榈酰基甘油。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为1-单鲸蜡基甘油醚或二甘醇鲸蜡基醚。
25.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物还包含有助于将脂质运送穿过粘膜的运送增强剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述运送增强剂为胆固醇衍生物，其中侧链的C23碳原子携带羧酸。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述运送增强剂为胆酸、鹅脱氧胆酸或其盐。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述运送增强剂为甘胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、熊脱氧胆酸或其盐。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述运送增强剂为酰氧基化的氨基酸或其盐。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述运送增强剂为含有C6_2(l烷酰基或烯酰基部分的酰基肉毒碱或其盐。
31.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物不包含有助于将脂质运送穿过粘膜的运送增强剂。
32.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物还包含离子型表面活性剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为烷酸或烯酸。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为磷酸酯/盐。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为二鲸蜡基磷酸酯/盐、磷脂酸或磷脂酰丝氨酸。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为硫酸单酯/硫酸单酯盐。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为鲸蜡基硫酸酯/盐。
38.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物还包含类固醇。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述类固醇为胆固醇。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述抗原水溶液还包含冻干保护剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、二甲基-琥珀酸盐缓冲剂(DMS)、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇和葡聚糖。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述冻干保护剂为蔗糖。
43.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗原为病毒。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述病毒为减毒病毒。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述病毒为灭活病毒。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述病毒为流感病毒。
47.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述病毒为麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘病毒或其组合。
48.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述病毒选自轮状病毒、带状疱疹病毒、牛痘病毒、黄热病病毒及其组合。
49.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗原为多肽。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述多肽为病毒多肽。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多肽为流感多肽。
52.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗原是不耐热的。
53.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述水溶液包含抗原混合物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述水溶液包含多肽混合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述多肽混合物包含来自同一病毒的多肽的混合物。`
56.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗原为多核苷酸。
57.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗原为多糖。
58.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括在形成所述含有抗原的囊泡之后添加佐剂的步骤。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述佐剂为TLR-3或TLR-4激动剂。
60.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的熔融混合物包含佐剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述佐剂为TLR-3或TLR-4激动剂。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其还包括将包含所述含有抗原之囊泡的制剂冻干的步骤。
63.根据权利要求62所述的方法，其还包括使所述含有抗原的囊泡在其被冻干之后再水化的步骤。
64.方法，其包括: 提供有机溶剂中的形成囊泡之脂质的溶液；以及 通过注射将所述形成囊泡之脂质的溶液添加至包含抗原的水溶液中以形成含有抗原的囊泡。
65.根据权利要求64所述的方法，其还包括通过使形成囊泡的脂质溶于所述有机溶剂来制备所述有机溶剂中的所述形成囊泡之脂质的溶液。
66.根据权利要求65所述的方法，其中使所述形成囊泡的脂质溶于不含任何共溶剂的有机溶剂中。
67.根据权利要求65所述的方法，其中使所述形成囊泡的脂质溶于含有一种或更多种共溶剂的有机溶剂中。
68.根据权利要求65所述的方法，其中使所述形成囊泡的脂质溶于无水溶剂系统中。
69.根据权利要求64至68中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂为水可混溶溶剂。
70. 权利要求书70缺失
71.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂为极性质子有机溶剂。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述极性质子有机溶剂为具有2至5个碳原子的脂肪醇。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述极性质子有机溶剂为具有4个碳原子的脂肪醇。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述极性质子有机溶剂为叔丁醇。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述极性质子有机溶剂为乙醇。
76.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂为乙醚。
77.根据权利要求64至76中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡的脂质包含磷脂。
78.根据权利要求64至77中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡的脂质包含非离子型表面活性剂。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为甘油酯。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为二元醇或二元醇醚。
81.根据权利要求78所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为1-单棕榈酰基甘油。
82.根据权利要求78所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂为1-单鲸蜡基甘油醚或二甘醇鲸蜡基醚。
83.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤中所述形成囊泡之脂质的溶液处于低于90°C的温度。
84.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤中所述形成囊泡之脂质的溶液处于低于70°C的温度。
85.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤中所述形成囊泡之脂质的溶液处于55°C至65 °C的温度。
86.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤中所述包含抗原的水溶液处于低于50°C的温度。
87.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述包含抗原的水溶液处于低于40°C的温度。
88.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述包含抗原的水溶液处于30°C至35°C的温度。
89.根据权利要求64所述的方法，其中在所述添加步骤期间所述包含抗原的水溶液的温度是受控的。
90.根据权利要求64至89中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的溶液还包含有助于将脂质运送穿过粘膜的运送增强剂。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述运送增强剂为胆固醇衍生物，其中侧链的C23碳原子携带羧酸。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述运送增强剂为胆酸、鹅脱氧胆酸或其盐。
93.根据权利要求90所述的方法，其中所述运送增强剂为甘胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、熊脱氧胆酸或其盐。
94.根据权利要求90所述的方法，其中所述运送增强剂为酰氧基化的氨基酸或其盐。
95.根据权利要求90所述的方法，其中所述运送增强剂为含有C6_2(l烷酰基或烯酰基部分的酰基肉毒碱或其盐。
96.根据权利要求64至95中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的溶液不包含有助于将脂质运送穿过粘膜的运送增强剂。
97.根据权利要求64至96中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的溶液还包含离子型表面活性剂。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为烷酸或烯酸。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为磷酸酯/盐。
100.根据权利要求97所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为二鲸蜡基磷酸酯/盐、磷脂酸或磷脂酰丝氨酸。
101.根据权利要求97所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为硫酸单酯/硫酸单酯盐。
102.根据权利要求97所述的方法，其中所述离子型表面活性剂为鲸蜡基硫酸酯/盐。
103.根据权利要求64至102中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的溶液还包含类固醇。`
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述类固醇为胆固醇。
105.根据权利要求64至104中任一项所述的方法，其中所述抗原水溶液还包含冻干保护剂。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、二甲基-琥珀酸盐缓冲剂(DMS)、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇和葡聚糖。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述冻干保护剂为蔗糖。
108.根据权利要求64至107中任一项所述的方法，其中所述抗原为病毒。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述病毒为减毒病毒。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述病毒为灭活病毒。
111.根据权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述病毒为流感病毒。
112.根据权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述病毒为麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘病毒或其组合。
113.根据权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述病毒选自轮状病毒、带状疱疹病毒、牛痘病毒、黄热病病毒及其组合。
114.根据权利要求64至107中任一项所述的方法，其中所述抗原为多肽。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述多肽为病毒多肽。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述多肽为流感多肽。
117.根据权利要求64至116中任一项所述的方法，其中所述抗原是不耐热的。
118.根据权利要求64至116中任一项所述的方法，其中所述水溶液包含抗原混合物。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述水溶液包含多肽混合物。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述多肽混合物包含来自同一病毒的多肽的混合物。
121.根据权利要求64至107中任一项所述的方法，其中所述抗原为多核苷酸。
122.根据权利要求64至107中任一项所述的方法，其中所述抗原为多糖。
123.根据权利要求64至122中任一项所述的方法，其还包括在形成所述含有抗原的囊泡之后添加佐剂的步骤。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述佐剂为TLR-3或TLR-4激动剂。
125.根据权利要求64至122中任一项所述的方法，其中所述形成囊泡之脂质的溶液包含佐剂。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述佐剂为TLR-3或TLR-4激动剂。
127.根据权利要求64至126中任一项所述的方法，其还包括将包含所述含有抗原之囊泡的制剂冻干的步骤。
128.根据权利要求127所述的方法，其还包括使所述含有抗原的囊泡在其被冻干之后再水化的步骤。
129.制剂，其包含根据权利要求1至128中任一项所述的方法制备的含有抗原的囊泡。
130.方法，包括将权利要求129所述的制剂施用于有此需要的患者。
131.药盒，其包含 第一容器，其包含根据权利要求62或权利要求127所述的方法制备的冻干的含有抗原的囊泡制剂；以及 第二容器，其包含水溶液，从而当所述第二容器的内含物与所述第一容器的内含物混合时，使所述含有抗原的囊泡再水化。
132.根据权利要求131所述的药盒，其还包含: 说明书，其用于使所述第一容器的内含物和所述第二容器的内含物混合从而使所述含有抗原的囊泡再水化。
【文档编号】C12N1/04GK103533923SQ201280008692
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年1月13日 优先权日:2011年1月13日
【发明者】大卫·E·安德森, 伊冯娜·佩里耶, 伊丁德尔·辛格·维尔胡, 马克·赫希迈尔 申请人:变异生物技术公司