前列腺癌细胞系、遗传标志及其用途

前列腺癌细胞系、遗传标志及其用途
【专利摘要】本公开内容涉及包含原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或一组的哺乳动物前列腺癌细胞系，所述细胞已感染携带癌基因的逆转录病毒载体，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述基因。前列腺细胞系包括前列腺癌的免疫感受态动物模型的应用、用于永生化原代哺乳动物上皮细胞的体外生产的方法、测定具有前列腺癌的人受试者是否患有转移或处于发展转移的危险中的方法、在处于发展癌症或癌症转移的危险中的受试者中预防癌症或抑制对治疗敏感的癌症转移的方法、和鉴定选择性干扰癌细胞的增殖或活力的候选化合物的方法，所述癌细胞具有升高水平的CCR5。
【专利说明】前列腺癌细胞系、遗传标志及其用途

【技术领域】
[0001]提供了用于诊断和治疗癌症包括前列腺癌的方法和组合物。本发明的具体方面涉及对于前列腺癌诊断、研究、治疗分层和治疗有用的方法和组合物。本发明中还提供的是可在这些方法中使用的细胞和转基因非人动物。
[0002]关于联邦赞助研究开发的声明
[0003]本发明在由美国国立卫生研究院(Nat1nal Institutes of Health,NIH)授予的授权号 R01CA70896、R01CA75503、R01CA86072、P30CA56036 和 R01CA132115-02 下由政府支持进行。政府在本发明中拥有一定权利。

【背景技术】
[0004]癌症是遍及全世界的重大健康问题。尽管在癌症检测和治疗中已取得进展，但目前无法获得用于预防和/或治疗的疫苗或其他普遍成功的方法。一般基于化学疗法或手术和放射的组合的目前疗法在许多患者中继续证明是不足够的。
[0005]例如，前列腺癌是对于在美国和遍及全世界的男性的重大健康问题。尽管在该疾病检测和治疗中已取得进展，但前列腺癌仍是男性中的癌症相关死亡的重要原因，每年影响美国超过221，000名男性。对于北美的男性，获得前列腺癌的寿命优势目前是19.6%，具有4.6%的死亡风险。前列腺癌是2009年全世界约250，000例死亡的原因。
[0006]目前无法获得用于预防或治疗前列腺癌的疫苗或其他普遍成功的方法。该疾病的管理目前依赖早期诊断(通过常规前列腺特异性抗原(“PSA”)测试)和侵入性治疗的组合，所述侵入性治疗可包括多种治疗例如手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法中的一种或多种。关于特定前列腺癌的治疗过程通常基于多种前列腺参数包括组织学分析和疾病传播加以选择。然而，目前作为筛选标准的PSA的使用导致较不优化的治疗决策，因为PSA测试具有高假阳性和假阴性率。2009年在美国进行约45，000, 000次PSA，具有约27%的特异性。基于升高的PSA，去年在美国采取约I百万次前列腺活组织检查，从其中鉴定250，000例肿瘤。在前列腺癌患者中观察到的高死亡率指出在该疾病的治疗、诊断和预防中需要改善。
[0007]关于PSA测试使用的另一复杂因素是医生关于PSA筛选的建议不同。一些人鼓励超过50岁的男性每年筛选，并且一些人建议处于前列腺癌的更高危险中的男性在40或45岁时开始筛选。另外其他人警告常规筛选。一般来讲，4.0ng/mL以下的PSA水平视为正常的。然而，考虑到两个报道，即Thompson IM等人的一个(“Prevalence of prostate canceramong men with a prostate-specific antigen level<or=4.0ng per milliliter,，，NewEngland Journal of Medicine2004, 350 (22)，2239-2246)和 Smith DS 等人的另一个(“The early detect1n of prostate carcinoma with prostate specific antigen:TheWashington University experience, ” Cancer 1997，80 (9), 1853-1856),参考的 PSA 水平看起来是任意且无用的。根据Thompson IM等人,在具有等于或小于4.0ng/mL的PSA水平的15.2百分比的男性中诊断出前列腺癌。那些男性中的百分之十五或总共约2.3百分比男性具有高分级的癌症。根据Smith DS等人，发现具有4.1-9.9ng/mL的PSA水平和经历前列腺活组织检查的25 - 35百分比的男性具有前列腺癌，而65-75百分比的剩余男性不具有前列腺癌。因此，不存在特定的正常或异常PSA水平。
[0008]此外，促成前列腺癌复发和治疗抗性的分子机制知之甚少。雄激素剥夺疗法导致60%-80%初始应答率(参见Scher, H.1.和Sawyers, C.L.，J Clin0ncol2005, 23，8253-8261)。然而，经历雄激素拮抗剂疗法的大多数患者随后复发。早期诊断可提供治愈手术的机会，然而，接受根治性前列腺切除术的~30%男性复发，促成微转移疾病。因此，存在可在该疾病的早期阶段时检测和/或阻止转移性恶性肿瘤的分子驱动物的医学干预的需要。


【发明内容】

[0009]在一个方面，本发明提供了哺乳动物前列腺癌细胞系，其包含一组原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或多种，所述细胞已感染携带癌基因的逆转录病毒载体。在某些实施例中，癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述癌基因或基因组合。哺乳动物前列腺癌细胞系可包括任何合适的哺乳动物细胞，包括原代鼠上皮细胞。原代哺乳动物上皮细胞可源自任何免疫感受态哺乳动物，包括免疫感受态啮齿类动物，包括大鼠和小鼠。
[0010]在另一方面，本发明提供了癌症动物模型，包括植入癌细胞系的免疫感受态哺乳动物，所述癌细胞系用选自C-Myc、Ha-Ras、NeuT、C-SrC及其组合的一组癌基因中的一种或多种转化。
[0011]在一个实施例中，基于选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一组癌基因中的一种或多种的表达水平，使用本发明的哺乳动物前列腺癌细胞系产生的免疫活性转基因小鼠发展能够产生可检测的分子遗传标志的前列腺肿瘤。
[0012]在又一方面，本发明提供了用于体外生产永生化原代哺乳动物上皮细胞的方法，该方法包括用逆转录病毒载体感染原代哺乳动物上皮细胞，所述逆转录病毒载体携带选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的癌基因，以提供受感染细胞，其中所述原代哺乳动物上皮细胞能够被所述逆转录病毒载体和在这样的条件下感染，由此在所述受感染细胞中表达 c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c~Src 及其组合。
[0013]在进一步方面，本发明提供了用于诊断前列腺癌的方法，该方法包括:(a)提供来自受试者的生物学测试样品，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中；(b)基于测试样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性，测定至少一种生物标记或分子遗传标志的水平，其中一组或多组基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c_Src及其组合；(c)比较所述测试样品中的所述至少一种生物标记或所述分子遗传标志的水平与对照样品中的生物标记的水平或分子遗传标志的水平，其中相对于所述对照样品中的生物标记或分子遗传标志的水平，所述测试样品中的生物标记或分子遗传标志的水平升高是所述受试者中的前列腺癌存在的诊断指示物。
[0014]在又一方面，本发明提供了分类癌症肿瘤包括前列腺肿瘤的方法，该方法包括:(a)提供癌症肿瘤或前列腺肿瘤样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和(c)基于检测步骤(b)的结果，将前列腺肿瘤分类为属于肿瘤亚类。
[0015]在进一步方面，本发明提供了将具有癌症肿瘤包括前列腺肿瘤的受试者分层用于临床试验的方法，该方法包括:(a)提供源自具有癌症肿瘤或前列腺肿瘤的受试者的样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src、ErbB2及其组合；和(c)基于检测步骤的结果，将受试者分层用于临床试验。
[0016]在另一方面，本发明提供了选择用于具有前列腺肿瘤的受试者的治疗的方法，该方法包括:(a)提供源自具有前列腺肿瘤的受试者的样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和(c)基于检测步骤的结果选择治疗。
[0017]在又一方面，本发明提供了通过用一种或多种外源癌基因转化细胞产生的非天然存在的细胞，允许所述细胞分裂至少一次，其中所述细胞是被含有一种或多种外源癌基因的载体转化的哺乳动物细胞，其中所述一种或多种外源癌基因选自c-Myc、Ha-Ras, NeuT,c-Src及其组合。
[0018]已发现前列腺上皮细胞的癌基因转化诱导与趋化因子受体5型(“CCR5”)及其配体(CCL5、CCL8、CCL7)的表达增加相关的转移细胞。CCR5受体在功能上与骨转移有关，如通过使用每日口服CCR5拮抗剂马拉维若减少转移证明的。

【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1示出癌基因转导的PEC系在软琼脂中形成集落；
[0020]图2示出通过阵列CGH评估的在四个癌基因细胞系中的拷贝数异常；
[0021]图3示出前列腺上皮细胞系在免疫感受态小鼠中生长；
[0022]图4示出癌基因转化的前列腺上皮细胞肿瘤转移至肺；
[0023]图5示出微阵列基因表达的层次聚类；
[0024]图6示出前列腺肿瘤中的c-Myc和Ha-Ras特异性癌基因标志在其他组织中是保守的；
[0025]图7示出癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联；和
[0026]图8示出癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联。
[0027]图9示出分化不良的前列腺腺癌的组织学特征；
[0028]图10示出同基因前列腺癌细胞系的3D基质胶侵入的Src增强，其中:
[0029]图1OA示出细胞迁移的划痕测定显示划痕，
[0030]图1OB示出关于N=3次分开实验的关闭定量，
[0031]图1OC示出在基质胶中使用前列腺癌细胞系的3-D侵入测定，和
[0032]图1OD示出来自对于PEC系(PEC-NeuT、PEC-Ras和PEC-Src)的3次独立实验的平均侵入距离土 SEM ；
[0033]图11示出同基因前列腺癌细胞系肿瘤是血管的，其中:
[0034]图1lA示出使用标准化的光子通量来定量肿瘤体积，对于3个系各自在IxlO5细胞的皮下接种后经过3周定量的，在NCR裸鼠中的皮下肿瘤生长，
[0035]图1lB示出关于血管性血友病因子(von Willebrand factor, WF)的免疫组织化学染色，显示具有Ras系的增强VWF染色的该系血管分布；
[0036]图12示出前列腺癌系发展转移。如下呈现来自实验的结果，其中将用表达Luc2-番茄红融合蛋白的载体转导的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且每周定量体内生物发光信号:
[0037]图12A示出在前列腺上皮细胞的心内注射后两周时的代表性全身生物发光图像，
[0038]图12B示出在同基因前列腺癌系的心内注射后，在小鼠中的脑转移的代表性图像，
[0039]图12C示出显示为具有肿瘤的小鼠比例的生物发光成像(BLI)的定量(平均值±SEM, n=6)，
[0040]图12D示出对于同基因系各自作为转移性脑肿瘤负荷的量度的平均总质子通量，
[0041]图12E示出在PEC-Src和PEC-NeuT心内注射与细胞角蛋白14( “CK14”)染色2周后形成的脑转移的苏木精伊红(“H&E”)染色，确证在脑内前列腺上皮细胞的存在；
[0042]图13示出前列腺肿瘤细胞系的肝转移。如下呈现来自实验的结果，其中将表达Luc2-番茄红融合蛋白的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且定量体内生物发光信号:
[0043]图13A示出具有肝肿瘤的小鼠百分比，
[0044]图13B示出通过光子通量测定的肿瘤大小，
[0045]图13C示出显示肝转移的代表性小鼠图像，
[0046]图13D示出具有肾肿瘤的小鼠百分比，
[0047]图13E示出通过光子通量的肾肿瘤大小，和
[0048]图13F示出肾转移的代表性图像；
[0049]图14示出同基因前列腺癌细胞系发展溶骨性骨转移:
[0050]图14A示出FVB小鼠的代表性体内图像，所述FVB小鼠经历表达Luc2_番茄红融合蛋白的PEC系的心内注射，并且定量体内生物发光信号，
[0051]图14B示出作为具有肿瘤的小鼠比例的生物发光成像(BLI)的定量(平均值±SEM, n=6)，和
[0052]图14C示出在光子通量上的肿瘤团块大小；
[0053]图15示出溶骨性前列腺癌骨转移的Src增强。如下呈现来自实验的结果，其中在PEC-Src心内注射后2周，FVB小鼠发展溶骨性骨病灶:
[0054]图15A示出与PEC-Ras和PEC-NeuT相比较，骨中的肿瘤面积在PEC-Src组中显著增加，
[0055]图15B示出在细胞的心内注射前(t0)和后14天(tl4)的代表性X射线，
[0056]图15C示出耐酒石酸盐酸性磷酸酶(“TRAP”)染色，确证骨-肿瘤界面中成骨细胞(箭头)的存在，
[0057]图15D示出骨转移形成后的H&E染色，
[0058]图15E示出CK14染色，和图15F示出CK8染色，并且两者均确证在骨内上皮细胞的存在；
[0059]图16示出溶骨性前列腺癌细胞系表达功能CCL5和骨桥蛋白(“0ΡΝ”)受体:
[0060]图16A — 16D示出在PEC系上的CCR5表达的荧光激活细胞分选器(“FACS”)分析，
[0061] 图16E和16F示出使用OPN作为CD44配体和CCL5作为CCR5配体进行的PEC-Src系的基质胶侵入测定，和
[0062]图16G示出定量为平均值+SEM的PEC-Src系的基质胶侵入，和
[0063]图16F示出在组织培养中的前列腺肿瘤细胞系的趋化因子受体和配体基因表达，和
[0064]图16G示出与组织培养中的表达相比较，在皮下植入后的细胞因子配体和受体的相对丰度；
[0065]图17示出CCR5拮抗剂阻断脊柱溶骨性前列腺癌转移。来自实验的结果显示于图16A-16D中，其中将用表达Luc2-番茄红融合蛋白的载体转导的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且在2周后定量体内生物发光信号:
[0066]图17A示出显示来自每组小鼠的代表性例子(用口服马拉维若(8mg/kg)或对照处理小鼠)，
[0067]图17B不出作为总肿瘤团块的体积分析的光子通量，
[0068]图17C示出小鼠中的下肢骨质量(数据是关于每个组中的N=S只分离小鼠的平均值+SEM, Ρ〈0.05);和
[0069]图17D显示小鼠中的下肢骨质量的代表性X射线图像。
[0070]图18Α-18Η示出与X射线分析关联的氟_18，氟化钠(“F_18_NaF”)成像证实脊柱转移的存在；
[0071]图19A和19B显示用马拉维若每日口服处理使脊柱转移减少>90% ;和
[0072]图20示出来自tPEC细胞系微阵列的数据。

【具体实施方式】
[0073]本发明主题目前将在下文参考附图和其中显示了代表性实施例的实例更全面地描述。然而，本发明主题可以不同形式体现，并且不应解释为限制于本文阐述的实施例。相反，这些实施例提供用于描述且赋予本领域技术人员方法。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与主题所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本文提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考文献全文以引用的方式并入。
[0074]1.动物模型和细胞系:
[0075]用于疾病例如癌症且特别是前列腺癌的新治疗需要在动物中的新测试方案。这些测试方案已受限于可植入免疫感受态(或“免疫活性”)动物中的前列腺癌细胞系的缺乏。这是重要的，因为免疫系统在人前列腺癌的发作和进展中起重要作用。为了筛选对于治疗具有前列腺癌的患者有用的新药，必须开发可在免疫感受态动物中研究的前列腺癌细胞系，所述免疫感受态动物通过组织学反映人疾病，并且在体内经历相同类型的行为，包括如在人疾病中发生的对肺和骨的转移。
[0076]相应地，本发明的方面提供了可植入免疫感受态或免疫活性动物中的癌细胞系，所述动物包括人和非人动物，包括哺乳动物。示例性非人哺乳动物包括例如啮齿类动物例如大鼠、豚鼠和小鼠，和农场动物例如猪、绵羊、山羊、马和牛。
[0077]因为在体内的任何类型的细胞均可以是癌症的来源，所以任何合适类型的癌细胞系均可在本发明中使用。合适的癌症类型包括癌(上皮细胞的癌症)、肉瘤(骨、肌肉或其他结缔组织的癌症)、淋巴瘤(淋巴系统的癌症)、白血病(血细胞或血前体细胞的癌症)和黑素瘤(色素提供细胞的癌症)。
[0078]在一个实施例中，提供了前列腺癌细胞系，其中所述前列腺细胞系包含一组原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或多种，其已感染携带癌基因的逆转录病毒载体，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述癌基因或基因组合。
[0079]在一个实施例中，提供了小鼠前列腺癌细胞系，其中鼠前列腺细胞用选自c-Myc、Ha-Ras,NeuT,c-Src及其组合的癌基因转导。合适的小鼠前列腺细胞系可通过用携带癌基因的逆转录病毒载体在这样的条件下感染原代鼠上皮细胞而获得，所述条件允许癌基因在原代鼠上皮细胞中表达。
[0080]例如，人癌症的转基因免疫活性小鼠模型具有比异种移植物模型更多反映人癌症的潜力，因为尤其是转基因小鼠形成原位肿瘤(即在更类似于人肿瘤的环境中和在正常免疫系统的设置中)。因此，在本发明的一些实施例中，将免疫活性非人哺乳动物改造为表达本文描述的癌基因中的一种或多种，包括c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src或其组合，且发展癌症。
[0081]存在在研究中使用人癌症的转基因小鼠模型的几个优点。例如，小动物X射线计算机体层摄影术(微型CT)可用于相对廉价地监控肿瘤的进展，并且作为用于临床前显现血管和血管生成的高度定量的三维方法。使用此类方法能够在活小鼠中在临床前治疗试验过程中实现血管分布的快速和准确评估。用微型CT的肿瘤评估允许数据的快速定量视觉绘制以及肿瘤血容量、血管密度、血管管径、支化度和使用分段分析的弯曲度的定量分析。
[0082]适合于在本发明中使用的免疫活性小鼠的例子包括(随机配种的⑶1，圣康斯坦的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories, St.Constant, PQ) > C57BI/6J (B6) >C57BI/6X129/J Fl (Fl，緬因州巴尔港的杰克逊实验室(Jackson Laboratories, BarHarbor, ME) )、FVB/N、C57BV6、BALB/c 和 ND4。
[0083]在优选实施例中，FVB/N小鼠依照本发明用于改造转基因小鼠模型。FVB/N小鼠适合于本文考虑和/或描述的大多数转基因实验和遗传分析。近交FVB/N品系的特征在于强生殖能力和一致的大窝，并且FVB/N受精卵含有大和突出的原核，其促进DNA的显微注射。
[0084]基于选自c-Myc、Ha-Ras> NeuT、c_Src及其组合的一组癌基因中的一种或多种的表达水平，使用本发明的哺乳动物前列腺癌细胞系产生的免疫活性转基因小鼠发展能够产生可检测的分子遗传标志的前列腺肿瘤。
[0085]转移是癌症患者中的死亡主因。目前的化学疗法抗癌治疗使用旨在减少患者体内癌细胞数目的细胞毒性、激素或免疫调节剂药物。然而，渐增的大量证据显示大多数转移细胞对抗癌药物有抵抗力，并且因此目前可用的药物无法有效停止癌细胞散布到其他组织或器官。目前，不存在用于治疗大多数转移性肿瘤的有效方法，尽管有癌症治疗领域中的众多和不同的治疗革新。
[0086]“载体”或“构建体”指包含在体外或体内递送给宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。待递送的多核苷酸可包含目的序列用于基因疗法。载体包括例如转座子和其他位点特异性可动元件，病毒载体例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、痘病毒、乳头状瘤病毒、慢病毒、疱疹病毒、泡沫病毒和逆转录病毒载体，并且包括假型病毒、脂质体和其他含脂质复合物，及其他能够介导多核苷酸递送至宿主细胞的大分子复合物，例如DNA包被的金颗粒、聚合物-DNA复合物、脂质体-DNA复合物、脂质体-聚合物-DNA复合物、病毒-聚合物-DNA复合物例如腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合物、和抗体-DNA复合物。载体还可包含其他组分或功能性，其还调苄基因递送和/或基因表达，或另外对载体将引入其内的细胞提供有利性质。此类其他组分包括例如影响与细胞的结合或对细胞的靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响载体核酸由细胞摄取的组分；影响多核苷酸在摄取后在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。此类组分还可包括标记，例如可检测和/或可选标记，其可用于检测或选择已吸收且表达由载体递送的核酸的细胞。此类组分可提供作为载体的天然特征(例如某些病毒载体的使用，所述病毒载体具有介导结合和摄取的组分或功能性)，或载体可进行修饰以提供此类功能性。大量多样的此类载体是本领域已知的，并且是一般可获得的。当载体维持在宿主细胞中时，载体可作为自主结构在有丝分裂过程中由细胞稳定地复制，掺入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的核或细胞质中。
[0087]人前列腺癌已嵌入反映癌基因信号传导的基因构成和标志内。本发明的细胞系有利地反映这些癌基因信号传导途径中的一种或多种， 从而有利于例如癌基因特异性化合物或基于核酸的疗法的测试。特别地，如本文提供的前列腺癌细胞系对于癌基因特异性化合物或基于核酸的疗法的测试和/或筛选是有用的。
[0088]合适的癌基因特异性抑制剂的例子包括对于c-Myc、Ha-Ras, c-Src和ErbB2癌基因的抑制剂。在临床使用或开发中的靶向ErbB的几种合适的抗癌剂，包括属于针对ErbB家族的嵌合或人源化单克隆抗体种类的那些和小分子ErbB酪氨酸激酶抑制剂。嵌合或人源化单克隆包括阻止配体结合和配体依赖性受体激活的抗体(例如靶向ErbBl的配体结合亚结构域III的西妥昔单抗)、干扰配体依赖性受体激活的抗体(例如靶向ErbB2的亚结构域IV的曲妥珠单抗)、和阻止受体异二聚化的抗体(例如靶向ErbB2的亚结构域II中的二聚环周围区域的抗ErbB2抗体帕妥珠单抗)。示例性小分子ErbB酪氨酸激酶抑制剂包括两种ErbBl特异性酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼/易瑞沙和厄洛替尼，其已批准用于治疗非小细胞肺癌，和双重ErbBl/ErbB2抑制剂拉帕替尼，其作为TYKERB?上市并且指出与卡培他滨组合用于治疗具有晚期或转移性乳腺癌的患者；并且与来曲唑组合用于治疗具有过表达HER2的激素受体阳性转移性乳腺癌的绝经后女性。
[0089]其他ErbB2受体抑制剂包括GW-282974 (葛兰素威康公司(Glaxo WellcomePLC)),以及单克隆抗体AR-209 (美国德克萨斯州林地市的Aronex制药有限公司(AronexPharmaceuticals Inc.0f The Woodlands, Tex., USA))和 2B-1 (Chiron)。不例性 ErbB2 抑制剂还包括在W01998/02434 (1998年I月22日公开)、TO1999/35146 (1999年7月15日公开)、W01999/35132 (1999 年 7 月 15 日公开)、W01998/02437 (1998 年 I 月 22 日公开)、W01997/13760 (1997 年 4 月 17 日公开)、W01995/19970 (1995 年 7 月 27 日公开)、美国专利号5，587，458 (1996年12月24日颁布)和美国专利号5，877，305 (1999年3月2日颁布)中描述的那些，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。在本发明中有用的ErbB2受体抑制剂也在1999年I月27日提交的美国临时申请号60/117，341和1999年I月27日提交的美国临时申请号60/117，346中描述，所述申请全文以引用的方式并入本文。
[0090]在本发明中有用的c-Src蛋白质酪氨酸激酶抑制剂的例子包括但不限于一般和具体公开于 W01996/10028、W01997/28161、W01997/32879 和 W01997/49706 中的化合物，包括属于下述结构种类的化合物:吡咯并嘧啶尤其是吡咯并[2，3-d]嘧啶、嘌呤、吡唑并嘧啶尤其是吡唑并[3，4-d]嘧啶、吡唑并嘧啶尤其是吡唑并[3，4-d]嘧啶和吡啶并嘧啶尤其是吡啶并[2，3-d]嘧啶。示例性化合物包括下式1-1V的化合物。
[0091]

【权利要求】
1.一种包含原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或一组的哺乳动物前列腺癌细胞系，所述细胞已感染携带癌基因的逆转录病毒载体，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras, NeuT,c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述基因。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物前列腺癌细胞系，其中所述原代哺乳动物上皮细胞包括原代鼠上皮细胞。
3.根据 权利要求1和2中任一项所述的哺乳动物前列腺癌细胞系，其中所述原代哺乳动物上皮细胞源自一个免疫感受态小鼠或多个免疫感受态小鼠。
4.一种人前列腺癌的动物模型，所述动物模型包括植入根据权利要求1-3中任一项所述的哺乳动物前列腺癌细胞系的免疫感受态非人哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物选自啮齿类动物例如大鼠、豚鼠和小鼠；和农场动物例如猪、绵羊、山羊、马和牛。
6.根据权利要求4所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物是啮齿类动物。
7.根据权利要求4和5中任一项所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物是小鼠。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物是FVB/N小鼠。
9.一种发展前列腺肿瘤的免疫感受态转基因小鼠，其中所述前列腺肿瘤产生一组癌基因中的一种或多种特有的分子遗传标志，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
10.一种用于体外生产根据权利要求1-3中任一项所述的永生化原代哺乳动物上皮细胞的方法，所述方法包括用逆转录病毒载体感染原代哺乳动物上皮细胞，所述逆转录病毒载体携带选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT> c_Src及其组合的癌基因，以提供受感染细胞，其中所述原代哺乳动物上皮细胞能够被所述逆转录病毒载体和在这样的条件下感染，由此在所述受感染细胞中表达c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c_Src及其组合。
11.一种用于诊断受试者中的前列腺癌的方法，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中，所述方法包括: (a)提供来自受试者的生物学测试样品，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中； (b)基于得自所述受试者的生物学测试样品中的基因表达模式，测定至少一种生物标记的水平，其中所述基因表达模式与选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一种或多种癌基因的组相关； (C)比较所述生物学测试样品中的所述至少一种生物标记的水平与对照样品中的所述生物标记的水平， 其中相对于所述对照样品中的所述生物标记的水平，所述测试样品中的所述生物标记的水平升高是所述受试者中的前列腺癌存在的诊断指示物。
12.根据权利要求11所述的用于诊断前列腺癌的方法，其中遗传材料源自所述前列腺癌或与前列腺有关的生物流体，包括前列腺、尿和血液。
13.一种将前列腺癌/肿瘤分类成不同前列腺癌亚类的方法，所述前列腺癌亚类具有选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一种或多种癌基因的组特有的基因表达模式，所述方法包括: (a)提供前列腺癌/肿瘤样品；(b)检测源自所述样品中的所述一种或多种癌基因的组的基因表达模式或活性的分子遗传标记；和 (C)基于所述检测步骤(b)的结果，将所述前列腺肿瘤分类为属于癌症/肿瘤亚类。
14.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述步骤(c)的分类步骤包括使所述样品中的分子遗传标记与所述前列腺癌的组织病理学分级关联。
15.根据权利要求 13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述c-Myc癌基因特有的基因表达模式。
16.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述Ha-Ras癌基因特有的基因表达模式。
17.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述NeuT癌基因特有的基因表达模式。
18.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述c-Src癌基因特有的基因表达模式。
19.一种将具有前列腺肿瘤的受试者分层用于临床试验的方法，所述方法包括: (a)提供源自具有前列腺肿瘤的受试者的样品； (b)检测源自所述样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和 (C)基于所述检测步骤(b)的结果，将所述受试者分层用于临床试验。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述(c)中的分层步骤在比较所述(b)中的检测步骤的结果与得自对照样品的结果后进行。
21.一种选择用于具有前列腺癌/肿瘤的受试者的治疗的方法，所述方法包括: (a)提供源自具有前列腺癌/肿瘤的受试者的样品； (b)检测源自所述样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和 (C)基于所述检测步骤(b)的结果选择治疗。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述(c)中的选择步骤在比较所述(b)中的检测步骤的结果与得自对照样品的结果后进行。
23.一种通过用一种或多种外源癌基因转化细胞产生的非天然存在的细胞，允许所述细胞分裂至少一次，其中所述细胞是被含有所述外源癌基因的载体转化的人细胞，其中所述一种或多种外源癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT> c_Src及其组合。
24.根据权利要求23所述的非天然存在的细胞，其中所述细胞是原代哺乳动物上皮细胞。
25.一种用于选择用于具有癌症的受试者的治疗的方法，所述方法包括: (a)在得自需要治疗癌症的受试者的样品中，测定编码本文描述的基因标志或其修饰物的核酸的表达水平；和 (b)基于所测定的基因标志选择用于所述受试者的治疗，其中所述基因标志源自选自c-Myc> Ras、ErbB2 和 Src 的癌基因。
26.一种测定具有前列腺癌的人受试者是否患有转移或处于发展转移的危险中的方法，所述方法包括:(a)从具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中的人受试者获得生物样品；和 (b)测定所述样品中CCR5的表达水平和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种的表达水平，其中所述样品中的CCR5和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种的表达水平如果高于对照表达水平，则指示所述人受试者可能患有转移或处于发展转移的危险中。
27.一种在处于发展癌症或癌症转移的危险中的受试者中预防癌症或抑制对治疗敏感的癌症转移的方法，所述方法包括给有此需要的所述受试者施用CCR5拮抗剂。
28.根据权利要求28所述的方法，其中所述CCR5拮抗剂是马拉维若或维立韦罗。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法，其中所述CCR5拮抗剂抑制选自下述的一种或多种器官中的肿瘤转移:肝、脑、膀胱、肺、肾上腺、肾、骨及其组合。
30.一种鉴定选择性干扰 癌细胞的增殖或活力的候选化合物的方法，所述癌细胞具有升高水平的CCR5和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种，所述方法包括: 使候选化合物与具有升高水平的CCR5和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种的癌细胞接触，和 如果与不具有升高水平的CCR5和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种的对照细胞相比较，具有升高水平的CCR5和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种的所述癌细胞的增殖或活力降低，则 将所述候选化合物鉴定为干扰具有升高水平的CCR5和/或其配体(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一种的所述癌细胞增殖或活力的化合物。
31.一种用于下调一种或多种前列腺癌细胞系的组中的CCR5表达的体内方法，所述前列腺癌细胞系源自在编码选自NeuT、Ha-Ras、c-Src及其组合的至少一种癌基因的逆转录病毒中的鼠上皮和前列腺上皮细胞转导，所述方法包括: (a)给根据权利要求4-8中任一项所述的动物模型施用候选化合物； (b)和测量所述动物模型中的CCR5RNA或蛋白质表达水平，其中所述动物模型中的所述CCR5表达水平低于未用所述候选化合物处理的对照动物模型中的所述CCR5表达水平。
【文档编号】C12N15/87GK104169425SQ201280020337
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2012年3月9日 优先权日:2011年3月9日
【发明者】理查德·G·佩斯泰尔 申请人:理查德·G·佩斯泰尔