自动化循环肿瘤细胞检测的制作方法

自动化循环肿瘤细胞检测的制作方法
【专利摘要】本发明属于体外诊断的领域，并且涉及检测体液(例如血液、尿)中的循环的或扩散的活细胞，或混有液体的组织样本(例如骨髓)的方法和装置，其包括以下步骤：a)通过适用于拦截待测细胞的多孔膜来过滤液体样本，使得待测细胞停留在所述膜的至少部分的表面上，并且使得所述样本液体经过该膜，b)涂覆第一处理液，其包含第一试剂用于以第一标记物标记所述待测细胞，c)以预定的时间段在所述膜上温育所述处理液，其中所述待测细胞经标记，d)检测在所述膜的表面上的经标记的待测细胞。
【专利说明】自动化循环肿瘤细胞检测
【技术领域】
[0001]本发明属于体外诊断的领域，并且涉及检测体液(例如血液、尿)中的循环的或扩散的活细胞，或混有液体的组织样本(例如骨髓)的方法和装置。本发明的方法特别用于循环肿瘤细胞的自动提取和分析，并优选应用于肿瘤的诊断。
[0002]本发明实现了在将血液或骨髓通过特殊的过滤方法过滤之后，通过功能测试自动化检测来自外周血或骨髓的细胞或细胞成份。所述细胞特别为来自外周血或其他体液的循环肿瘤细胞(英文circulating tumor cells, CTC或(复数)CTCs)、间充质干细胞或细菌，以及来自骨髓的扩散肿瘤细胞(英文:disseminated tumor cells, DTC)。
【背景技术】
[0003]外周血中CTC的存在表明处于非常早期的实体肿瘤细胞的可能的分散(Streuung)，而用常规的影像检查方法可能还未检测到转移。因此，检测或表征外周血中的CTC使得识别早期的全身性肿瘤细胞的扩散以及使用CTC作为预后标记物成为可能。由此可以支持和实施全身性疗法的预测和连续监测。此外，可以利用CTC的表征和评估作为为实体肿瘤选择适当治疗的诊断工具。
[0004]对于早期发现、诊断和治疗控制癌症来说，血液中循环肿瘤细胞(CTC)的检测变得越来越重要。此外，由于CTC的数量较低(每毫升血液中仅有3~5个)以及由于白细胞的背景较高出~IOX 106/ml)，要选择一种方法来尽可能有选择地富集CTC或能够在其他血细胞大量过剩前将其表现出来。因而采用例如过滤的物理方法，其中通过相应的孔径可以对细胞的大小进行选择，或者其他例如通过选择性地抗体结合来富集血液样本中CTC的方法。
[0005]迄今为止，没有一种基于尺寸选择的方法是完全自动化的。在CTC的富集步骤和实际的选择性免疫化学检测反应之间手动操作是必须的。
[0006]除了流式细胞计数的方法(例如FACS法，荧光激活细胞分类法)和过滤的方法之外，迄今为止只有Veridex公司的商业化的批准用于常规体外诊断的系统(CellSearch)。当CTCs的待测数量等于或大于3/ml时，所使用的方法允许以几个毫升的血液的输出体积检测CTCs。所使用的用于富集的方法利用的是与磁珠相连接的抗体和CTC的特异性结合。经富集的CTC的特异性检测在经荧光标记的抗体的帮助下能可视化地进行。
[0007]也已知有通过尺寸的选择来富集CTC的或贫化血液中的白细胞并且将其轻微“固定”的物理方法。于此使用具有经限定的孔径的过滤器，其允许白细胞和其他血液成份透过，但应防止CTC穿过。对于包括一系列清洗步骤和可选的染色步骤的后续处理来说，在染色台(FSrbestation).上手动传输过滤器是通常的做法。
[0008]与此相反，本发明使得用于检测样本中的(活)细胞、特别是血液样本中的肿瘤细胞的可靠的且高性价比的自动化方法成为可能。

【发明内容】
[0009]本发明涉及权利要求1所述的方法以及权利要求10所述的装置。
[0010]根据本发明的过滤过程中，悬浮液由过滤器(例如滤膜)过滤。在这种情况下，挤压渗透物通过过滤器并且使滞留物留在过滤器的表面上(或在过滤器的空隙和腔体中)。因此在过滤过程中，通过过滤器形成了渗透物主要的流动方向，从而可将一个区域称为过滤器的上游，在该区域内(包含细胞作为主要成份的)滞留物受到阻拦；以及一个区域称为过滤器的下游，在该区域中所述渗透物受到挤压并且例如于此处可将其收集。独立于该主要流动方向，可以在特殊情况下例如在反向冲洗过滤器时，也可将流动方向反转。
[0011]为了挤压渗透物通过过滤器，可以使过滤器的上游存在高于下游的压力从而产生压力差。这可以通过对过滤器的上游施加正压、对下游施加负压或结合两者来实现。为使渗透物停止流过过滤器(降低为O)，可以将压力差设定为O。这与过滤器在空间方位无关。对于特殊情况，流动方向垂直于过滤器或者于过滤器有垂直分量分布(即沿重力方向或与重力相反的方向)，还要考虑到，在过滤器上的水柱为压力差所作的贡献。
[0012]对于本发明方法的一些应用，优选过滤的流动方向在过滤器中沿重力方向运行。从而，经阻拦的滞留物停留在过滤器的表面上，这使得例如对滞留物(细胞)的进一步处理成为可能。
[0013]对于特定的应用，可以优选不沿重力的方向，而是沿与重力相反的方向来进行过滤，例如当滞留物漂浮时，或是要在过滤后将细胞从过滤器底部收集进收集容器中。
[0014]本发明涉及液体样本中的细胞的检测方法，其包括以下步骤: [0015]a)通过适用于拦截待测细胞的多孔膜来过滤液体样本，使得待测细胞停留在所述膜的至少部分的表面上，并且使得至少部分的样本液体经过所述膜，
[0016]b)涂覆第一处理液，其包含用于以第一标记物标记所述待测细胞的第一试剂，
[0017]c)以预定的时间段在所述膜上温育所述处理液，其中所述待测细胞经标记，
[0018]d)检测在所述膜的表面上的经标记的待测细胞。
[0019]液体样本可例如为血液样本、尿液样本或血浆样本。
[0020]根据本发明的一项实施方式,通过将该处理液直接加入液体样本来实现步骤b)。
[0021]根据本发明的一项实施方式，在检测经标记的待测细胞前，例如以挤压通过该膜的方式去除所述第一处理液。
[0022]适合用于标记的试剂包括可将细胞非特异性地或特异性地染色的标记物。非特异性标记物例如染料可以将蛋白质、核酸或其他细胞成份染色。特异性标记物可以例如是抗体、寡聚核苷酸探针、肽或其他分子，它们可以特异性地结合蛋白质、核酸序列或其他细胞特异性结构。标记物可以用可检测的标签例如显色染料、荧光染料、同位素标记或类似物来直接标记。备选的是，可通过二级检测试剂(例如二级抗体或酶-底物-系统)来检测标记物。
[0023]此外，例如在步骤b)之前或在步骤d)之后可任选地涂覆至少一种另外的处理液。
[0024]该至少一种另外的处理液优选包含选自以下的试剂:
[0025]-用于清洗的试剂，
[0026]-用于固定生物结构的试剂，
[0027]-用于防止非特异性标记活动(Markierungsereignissen)的试剂，或
[0028]-具有以另一种标记物标记待测细胞的试剂，其中所述另一种标记物不同于用于所述用于标记的第一试剂。
[0029]作为用于清洗的试剂已知有相应的清洗缓冲液。它们可以进一步包含用于使细胞膜渗透化的试剂，例如表面活性剂、皂苷和类似物。作为用于固定生物结构的试剂已知有相应的固定液，其含有固定剂，例如甲醛、戊二醛和类似物。
[0030]作为用于防止非特异性标记活动的试剂已知有相应的封闭缓冲液(Blockierpuffer)。当使用例如抗体作为标记物时，已知通过封闭缓冲液使含有同一物种的非特异性免疫球蛋白的抗体的非特异性结合达到饱和，且该标记物抗体源自于该抗体。
[0031]所述另一处理液优选包含适用于清洗或固定细胞或适用于防止非特异性标记活动的试剂。 [0032]根据本发明优选的方面，在该方法中在过滤后通过以合适处理液进行温育用染料对在膜上的细胞进行染色。为此，可以选择能将细胞或细胞成份染色的并且在细胞学和组织学中已知的染料。这可以是的活或死的染料。所述染料将细胞核或其他细胞器特异性染色，或将某些细胞成份，例如核酸或蛋白质特异性的染色。已知的细胞染料例如为台盼蓝(Trypanblau)、DAPI 以及类似物。
[0033]也可以用显微镜分析在膜上的未经染色的或经染色的待测细胞。
[0034]根据本发明一项优选的实施方式，在步骤c)期间，在膜的背离所述待测细胞于步
骤a)中停留的侧的一侧上施加正压(iiberdruck)，其中选择使得处理液经过所述膜的穿流
得到阻止的正压，其中所述正压< 50mbar、i^ 20mbar>^ IOmbar或< 5mbar。优选正压为3~IOmbar。通过较低的正压来阻止处理液渗透过膜。
[0035]优选如此选择所述正压，使其在向下的流动方向上(即重力的方向)等于或大于在过滤器上方的水柱的压力。此处成立的是:1cm水柱对应于约Imbar。在过滤器处于大致水平的布置的情况下，所述水柱对应于在过滤器上方的悬浮液的液面高度，其中从上至下地过滤该悬浮液。
[0036]根据本发明优选的一项实施方式，在步骤d)期间，在膜的背离所述待测细胞于步骤a)中停留的侧的一侧上施加负压(Unterdruck),其中选择使得所述处理液抽吸经过所述膜的负压。
[0037]根据本发明优选的一项实施方式，所述待测细胞为肿瘤细胞。本发明的方法特别适用于检测CTC。
[0038]根据本发明优选的一项实施方式，这样来选择步骤c)的处理液以及温育条件，使得待测细胞可以在预定的时间段内存活。因此，才有可能对该细胞实施进一步的功能性测试。可选择具有生理盐水浓度的缓冲液作为处理液。可在相应的温度和湿度条件下进行温育。
[0039]进一步地可检测由待测细胞释放的物质。
[0040]本发明进一步地涉及了用于实施本发明方法的步骤a)至d)的装置，其包括:
[0041]a)适用于拦截待测细胞的多孔膜，
[0042]b)用于将液体涂覆于所述膜上的手段，
[0043]c)用于将液体挤压经过膜的手段，
[0044]d)用于调节膜前后的压力差的手段，
[0045]e)用于控制时间进程的手段，其可以对在膜上涂覆所述液体、所述液体以预定时间段停留在所述膜上以及所述液体受挤压经过所述膜进行控制，
[0046]其中，用于调节压力差的手段能在所述膜的背面产生正压，从而实现所述液体以预定时间段停留在所述膜上。
[0047]用于将液体涂覆于膜上的手段例如可作以输入管线(Zuleitung)或移液设备来实施。
[0048]用于将液体挤压经过膜的手段可以包括用来产生压力差的手段，其中过滤器上游的压力大于下游。
[0049]可将用于控制时间进程的手段可设置成程控控制装置，在其中可调节预定的时间段。
[0050]根据本发明优选的一项实施方式，在膜的背离所述待测细胞受阻拦于膜上的侧的一侧上施加正压，其中选择使得处理液经过所述膜的穿流得到阻止的正压，其中所述正压^ 50mbar>^ 20mbar>^ IOmbar或< 5mbar。优选正压为3~lOmbar。通过较低的正压来阻止处理液渗透膜。
[0051]优选如此选择所述正压，使其在向下的流动方向上(即重力的方向)等于或大于在过滤器上方的水柱的压力。此处成立的是:1cm水柱对应于约Imbar。在过滤器处于大致水平的布置的情况下，所述水柱对应于在过滤器上方的悬浮液的液面高度，其中从上至下地过滤该悬浮液。
[0052]可以在相应 的夹持装置中将所述膜夹紧，以便于可以施加相应的负压和正压。
[0053]优选将膜布置在载玻片上，以便于在实施本发明方法的步骤a)至d)之后例如可通过显微镜进行观察来鉴定带有膜的载玻片用于细胞检测。
[0054]显微镜载玻片是约为26X76mm(IS08255-2)的透明板，其厚度约0.1~1.5mm。
[0055]所述载玻片优选具有开口，以便于可以轻松地抽吸液体。其可以是多个小开口，例如孔隙或钻孔。或者它也可以是由膜覆盖的一个或多个较大的缝隙。
[0056]该膜具有例如为0.1~200 μ m的孔径。从而在样本中的细胞碎片、血小板和较小的固体成份穿过过滤器(膜)时，细胞可受到阻拦。
[0057]根据本发明优选的一项实施方式，所述膜的孔径为2~50 μ m，进一步优选为5~20 μ m,更进一步优选为5~10 μ m。在2~50 μ m、5~20 μ m或特别在5~10 μ m的大小范围内的孔径提供的优势在于:受到阻拦的细胞部分地附着在孔隙中并且因此特别良好地附着在膜上，并且可用于进一步的分析。
[0058]根据本发明的一个方面，通过第一标记物检测到下文中列表1和2列出的抗原。
[0059]根据本发明优选的方面，在使用血液样本的情况中，在过滤前会实施红细胞裂解(例如，通过低渗裂解)，以去除造成干扰的红细胞。
[0060]此外，在过滤后也可将所述细胞放回到细胞培养介质中，并且为进一步的研究作培养。因此，例如可培养并进一步研究经检测的肿瘤细胞，以检查其对某些药物(例如细胞抑制剂)的反应。
[0061]列表1:优选的细胞特异性抗原
[0062]-用于肝细胞癌和生殖腺及生殖腺外的生殖细胞瘤的α-1-甲胎蛋白(AFP)
[0063]-用于多发性骨髓瘤的本琼蛋白(Bence-Jones-Protein)
[0064]-用于卵巢的生殖细胞肿瘤和睾丸的非精原细胞瘤的β-HCG(人绒膜促性腺激素的β-亚基)
[0065]-用于乳腺癌(Mammakarzinom)或卵巢癌(Ovarialkarzinom)的CA 15-3
[0066]-用于膜腺癌(Pankreaskarzinom)的CA19-9 和 CA50
[0067]-用于卵巢癌(Ovarialkarzinom)的CA-125
[0068]-用于甲状腺髓样癌的降钙素(humanesCalcitonin, hCT)
[0069]-用于大肠癌、胰腺癌以及肺的类腺癌(Adenokarzinomder Lunge)的癌胚抗原(CEA)
[0070]-用于肺癌(支气管癌)的所有变体的细胞角蛋白21片段(CYFRA21-1)和丝氨酸蛋白酶抑制剂B4 (SCC)
[0071 ]-HER_2/neu
[0072]-HPV抗体或HPV抗原
[0073]-用于神经母细胞瘤的人高香草酸(HomovaniMinsdure)
[0074]-用于类癌的5-羟吲哚乙酸
[0075]-用于嗜铬细胞瘤的儿茶酚胺、香草扁桃酸
[0076]-用于生殖细胞瘤的 乳酸脱氢酶(LDH)
[0077]-用于生殖细胞瘤的乳酸脱氢酶同工酶I(LDH-1);在目前的指南中还不建议使用常规测定
[0078]-MAGE 抗原
[0079]-用于嗜铬细胞瘤的肾上腺素
[0080]-用于非小细胞肺癌(NSCLC)或乳腺癌的MUCl
[0081]-用于小细胞支气管癌(SCLC)、神经母细胞瘤以及精原细胞性生殖细胞肿瘤的NSE
[0082]-用于精原细胞性生殖细胞肿瘤的胎盘碱性磷酸酶(PLAP)
[0083]-用于前列腺癌(Prostatakarzinom)的PSA
[0084]-用于乳头状或滤泡状甲状腺癌的任意浓度的甲状腺球蛋白(Tg)
[0085]-胸苷激酶
[0086]-细胞角蛋白，例如细胞角蛋白8，18，19
[0087]列表2:附加的细胞特异性抗原
[0088]2 微球蛋白(β2_Μ)
[0089]-CA54-9
[0090]-CA72-4
[0091]-CA195
[0092]-癌相关血清抗原(CASA)
[0093]-C 肽
[0094]-细胞角蛋白
[0095]-胃泌素
[0096]-胰高血糖素
[0097]-葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)
[0098]-胰岛素[0099]-新蝶呤
[0100]-核基质蛋白22 (NMP22)
[0101]-骨特异性碱性磷酸酶(Ostase)
[0102]-P53自体抗体
[0103]-副蛋白
[0104]-催乳素(PRL)
[0105]-S-100 蛋白
[0106]-丝氨酸蛋白酶抑制剂B4(SCC)
[0107]-妊娠特异性βI糖蛋白(SP-1)
[0108]-肿瘤相关的糖蛋白12(TAG12)
[0109]-胸苷激酶(TK)
[0110]-组织多肽抗原(TPA) [0111]-组织多肽特异性抗原(TPS)
[0112]-肿瘤M2-PK
[0113]-血管活性肠多肽(VIP)
[0114]-转酮酶样蛋白I(TKTLl)
[0115]列表1和2所列出的抗体是特异性标记物的示例性靶向物(Targets)(例如抗体)。由其可根据本发明方法来检测细胞，特别是肿瘤细胞。
【专利附图】

【附图说明】
[0116]下文将对本发明的方法加以示例性的说明。图1示出了本发明方法的步骤a)至d)。
[0117]步骤A示出了通过多孔膜来进行液体样本的过滤，以这种方式将待测细胞拦截或使其停留在膜表面上，
[0118]步骤B示出了含有用于标记待测细胞的第一试剂的第一处理液的涂覆，
[0119]步骤C示出了以预定的时间段在膜上温育处理液，其中待测细胞受到标记(通过阴影来表示待测细胞)，以及
[0120]步骤D示出了例如通过抽吸来去除处理液。
【具体实施方式】
[0121]通过以下方式将需要从周围介质(样本液体)中分离出的固体(细胞、颗粒、组织)与介质分离:所述固体保留在过滤膜的表面，该过滤膜对于待分离的固体来说是不可渗透的，而对于周围介质以及污染待分离固体的固体来说是可渗透的。为此提供可以确定和改变气体或液体通过于其可渗透的表面的流速的方法。在医学诊断中固体优选为细胞成份，周围的介质优选为全血/血清/血浆，其也可包含颗粒，而且因其属性可以渗透所述表面(例如白细胞)。
[0122]通过自动化过程，例如通过移液机械臂特别将除样本之外的所有隔离/富集以及检测必需的试剂涂覆在膜的表面上。可以将所述样本以及试剂可控地保留在表面上以用于温育和/或通过其可渗透的表面将它们去除。这可以通过使用各种传感器和执行装置来实现，其使得物质按照要求受调整地穿过膜的渗透层(可渗透的表面)。此时例如可以根据流速，或者对于特别敏感的细胞成份通过施加给系统的压力差(相对于环境压力)来进行调
難
iF.0
[0123]从向半渗透的表面上涂覆介质到选择性标记的所有步骤优选在液体处理机械臂中自动化地实施和监控。此外，可实现同时且并行地处理多个待检样本。
[0124]通过连续的隔离/富集的实验方案的实施以及在单元设备中的选择性检测反应，不需要迄今为止常规的手动进行的中间步骤和样品传输，就能实现出错更少的分析以及更快的运行时间。因为在这里提出的方法中，借助于在半渗透的表面上的针对性涂覆和穿过该表面的受控流动来调节所有检测所需的处理液或试剂的温育，使得所用试剂量得以显著减少，这在免疫化学试剂的价格通常很高的情况下意味着可观的成本优势。无论是在手动的免疫化学染色，还是在已知的“自动染色”的情况下，温育用量(Inkubationsvolumen)要大得多，因为不仅要润湿待处理的表面，还要淹没更大的区域或必须以足够的量填充整个温育容器。
[0125]为了实施富集/清洗和染色步骤，以下是必需的:
[0126](a)液体量或液面高于半渗透性表面，
[0127](b)液体穿过半渗透性表面的渗透速度，
[0128](C)知道渗透 所需的环境和设备之间的压力差，并且利用来控制渗透速度和确定当前所分析的样本的量。
[0129]为此所需的传感器和执行装置(Aktorik)既可以是渗透设备的组成部分，也可以是移液机械臂的组成部分，或者分布存在，这使得所述组件之间的通讯是必须的。
[0130]对于各个样本/通道的单独控制来说，至少需要一个压力传感器和一个阀，用它们能调节施加给环境的压力差(即正压或负压)。例如可通过连接一个存储容器(VorratsgefM〗)来产生各个压力差，由此既能相对于周围环境产生负压又能产生正压。
[0131]通过液体处理机械臂可以有利地对液体流动进行监控，为此采用以下步骤:
[0132](a)由通道特异性液位测量(例如电容)来确定在半渗透性膜上的液体量，从而进行溢位检查和控制移液后的时间点，
[0133](b)转换所获得的测量数据，其由外部软件读取并且可以将其导向进一步的处理，
[0134](C)根据各个液面来对其他的液体等份进行移液。
[0135]通过流速或渗透所需的压力差来有利地控制介质穿过半渗透性表面进行渗透的速度。为此对敏感的待隔离的组件施加尽可能低的例如低至7mbar的压力差，但该压力差也可增至50mbar。然而，压力差的连续测量也可用来确立，是否在半渗透型膜上还存在样本材料，并且因此可作为渗透完成的信号，或者如果在测定进程中出现半渗透性表面的堵塞，可将其用作分析断开的信号(Analyse-Abschaltsignal)。
[0136]通过分份添加样本(例如通过液体处理机械臂)和偶尔的混合(Aufmischen)样本，可以在很大程度上避免细胞的沉降以及由此相伴的细胞损失。
[0137]下文以举例的方式描述了用于富集和以免疫化学的方式检测或以分子生物学的方式表征样本中的CTC的自动化步骤。
[0138](i)手动步骤:
[0139]?将待测样本装入设备中[0140].装入所需的准备好的试剂
[0141].装入其他耗材(例如移液器吸头)
[0142].在分析完之后清理废液
[0143](ii)自动化富集CTC和以免疫化学的方式检测CTC的过程:
[0144].混合血液样本
[0145].血液样本取样并且添加到稀释/裂解/固定缓冲剂中
[0146].温育血液样本和缓冲剂
[0147].通过一系列的清洗和温育步骤来有选择地调节膜
[0148].将经处理的血液样本移液至装置中，使膜得到覆盖
[0149].通过液面差和压力差来调节CTC在膜上的富集(例如通过移液器吸头中的液面传感器，压力测量以及由低/高压存储容器上的阀来调节压力差)
[0150]?在膜持续堵塞时结束渗透过程
[0151].温和地固定和清洗 在半渗透性膜上的细胞
[0152].通过用必要的处理液/试剂温育膜上的细胞来进行免疫化学的染色
[0153].通过液面差和压力 差来调节测定过程(移液器吸头中的液面传感器，压力测量以及由低/高压补充容器上的阀来调节压力差)
[0154].在膜受到持续堵塞时结束渗透过程
[0155]接着，可选择地:(c)通过FISH(荧光原位交杂)来“以分子生物学的方式表征”
[0156].通过使用必要的试剂在膜上加热(temperiert)温育来进行分子生物学的染色
[0157]?在长时间的温育过程中通过放置盖玻片来防止蒸发，在温育后会将其再次去除
[0158](iv)最后的步骤
[0159].将适合的固定介质移液到半渗透性膜上，该介质也可以是固化的
[0160]?放置盖玻片
[0161]可选择再次手动进行步骤(iv)。
[0162]在所谓免疫染色的情况下，例如用抗体溶液、标记试剂、清洗缓冲液以及许多处理液(大多连续地)来温育人体细胞或细胞切片(组织切片)。通常以显微镜分析在显微镜载玻片上的染色对象。
[0163]染色所需的流体处理步骤是非常多样化且复杂的。所使用的试剂部分非常昂贵。在载玻片上的自动化处理能实现仅有很少用量的节约成本的处理。通常情况下会将载玻片上方的试剂洗去，这除了消耗大量的试剂外还可能伴有对象的部分损失。
[0164]根据本发明，试剂不是在表面上被冲洗掉(hinwegspiilen),而是通过膜被冲洗流过(hindurchspiilen),这样就能节省试剂,避免对象的损失以及通常让过程控制变得更好。
【权利要求】
1.液体样本中细胞的检测方法，包括以下步骤: a)通过适用于拦截待测细胞的多孔膜来过滤液体样本，使得待测细胞停留在所述膜的至少部分的表面上，并且使得至少部分的样本液体经过所述膜， b)涂覆第一处理液，其包含用于以第一标记物标记所述待测细胞的第一试剂， c)以预定的时间段在所述膜上温育所述处理液，其中所述待测细胞经标记， d)检测在所述膜的表面上的经标记的待测细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中在步骤b)之前或在步骤c)之后涂覆至少一种另外的处理液。
3.权利要求1或2所述的方法，其中至少一种另外的处理液包含选自以下的试剂:用于清洗的试剂、用于固定生物结构的试剂，用于防止非特异性标记活动的试剂，或用于以另一种标记物标记待测细胞的试剂，其中所述另一种标记物不同于所述第一标记物。
4.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二处理液包含适用于清洗或固定细胞或防止非特异性标记活动的试剂。
5.上述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)期间，在膜的背离所述待测细胞于步骤a)中停留侧的一侧上施加正压，其中选择正压使得处理液经过所述膜的穿流得到阻止。
6.上述权利要求中 任一项所述的方法，其中在步骤d)期间，在膜的背离所述待测细胞于步骤a)中停留侧的一侧上施加负压，其中选择负压使得所述处理液抽吸经过所述膜。
7.上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述待测细胞为肿瘤细胞。
8.上述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中选择能使待测细胞在所述预定时间段内存活的处理液以及温育条件。
9.上述权利要求中任一项所述的方法，其中检测由所述待测细胞释放的物质。
10.用于实施权利要求1~9中任一项所述的方法的装置，其包括: a)适用于拦截待测细胞的多孔膜， b)用于将液体涂覆于所述膜上的手段， c)用于将液体挤压经过膜的手段， d)用于调节膜前后的压力差的手段， e)用于控制时间进程的手段，其可以对在膜上涂覆所述液体、所述液体以预定时间段停留在所述膜上以及所述液体受挤压经过所述膜进行控制。 其中，用于调节压力差的手段能在所述膜的背面产生< 50mbar的正压，从而实现所述液体以预定时间段停留在所述膜上。
11.权利要求10所述的装置，其中所述膜布置在载玻片上。
12.权利要求10或11所述的装置，进一步包括用于收集受挤压经过所述膜的液体的废液容器。
【文档编号】C12Q1/68GK103620058SQ201280030928
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年5月20日
【发明者】K.弗雷德里克, J.班戈特, W.古姆布雷科特, K.希尔陶斯基, P.波利卡, M.斯坦泽尔 申请人:西门子公司