细菌形成的小菌素s，一种有效抵抗致病微生物如肠出血性大肠杆菌(ehec)的新抗微生物肽的制作方法

细菌形成的小菌素s，一种有效抵抗致病微生物如肠出血性大肠杆菌(ehec)的新抗微生物肽的制作方法【专利摘要】本发明涉及被命名为小菌素S(microcin?S)的新的分离的多肽、编码所述小菌素S多肽的分离的核酸分子以及与所述核酸分子杂交的引物和探针。本发明还涉及包含所述核酸分子的质粒和细胞、与所述多肽结合的抗体、组合物以及用于产生和使用所述多肽的方法。本发明进一步涉及用于治疗或预防微生物感染、功能性胃肠疾病或治疗肿瘤的医疗用途。本发明进一步涉及用于保藏食物的方法和用于涂覆敷料材料的方法。【专利说明】细菌形成的小菌素S，一种有效抵抗致病微生物如肠出血性大肠杆菌(EHEC)的新抗微生物肽【
技术领域：
】[0001]本发明涉及分离的多肽、编码小菌素SOniCIOCinS)多肽的分离的核酸分子以及与所述核酸分子杂交的引物和探针。本发明还涉及包含所述核酸分子的质粒和细胞、与所述多肽结合的抗体、组合物以及用于产生和使用所述多肽的方法。本发明进一步涉及用于治疗或预防微生物感染、功能性胃肠疾病(functionalgastrointestinaldisorders)或治疗肿瘤的医疗用途。本发明进一步涉及用于保藏食物的方法和用于涂覆敷料材料的方法。【
背景技术：
】[0002]小菌素是核糖体合成的具有低分子量的抗微生物肽。由肠杆菌(enterobacteria)(主要是大肠杆菌(Escherichiacoli))产生的小菌素合成在应激条件(如营养物质的限制)下被急剧活化。小菌素针对近缘物种(closelyrelatedspecies)发挥强有力的抗微生物/抗菌活性，其提供在肠道菌群中的高度竞争优势(Baquero，F.，Bouanchaud,D.，Martinez-Perez,M.C.&Fernandez,C.(1978)JBacterioll35，342-347)。小菌素生产者对它们产生的小菌素具有抗性，其由位于一个基因簇内的至少一个抗性赋予基因介导。14种已知的小菌素中的大多数是质粒编码的，但是也已经描述了染色体编码的抗微生物/抗菌多月太。益生菌菌株大肠杆菌Nisslel917(EcN)产生小菌素M和H47(Patzer,S.1.，Baquero,M.R.，Bravo,D.，Moreno,F.&Hantke,K.(2003)Microbiology149,2557-2570.)。益生菌被定义为活微生物，其在以一定数量摄入时发挥超过本身基本营养的健康益处。对使菌株能够成为益生菌的机制了解很少。然而，小菌素的抗微生物活性可以积极影响肠道平衡。假设不存在致病因素以及充分证实是临床安全的，产生小菌素的菌株显然满足益生菌的定义。与肠细菌小菌素相比，食源性乳酸菌产生包含羊毛硫氨酸的肽抗生素。革兰氏阳性菌的所谓的羊毛硫抗生素(Iantibiotic)已经用于食物保藏(Kuipers,A,Rink,R.&Moll,GN.(2011)ProkaryoticAntimicrobialPeptides.:FromGenestoApplications(原核生物的抗微生物肽:从基因到应用)(SpringerScience+BusinessMedia,Berlin))。作为抗肿瘤剂(Hetz,C.，Bono,M.R.，Barros,LF.&Lagos,R.(2002)ProcNatlAcadSciUSA99,2696-2701)或作为在感染性疾病中传统抗生素的替代物(Dicks,LΜ.T.，Heunis,T.D.J.，vanStaden,D.A.,Brand,A.,SutyakNoll,K.&Chikindas,M.L(2011)ProkaryoticAntimicrobialPeptides.:FromGenestoApplications(原核生物的抗微生物肽:从基因到应用)(SpringerScience+BusinessMedia,Berlin),Gillor,0.,Kirkup,B.C.&Riley,M.A(2004)Adv.ApplMicrobiol54,129-146)的用途是细菌素的两种进一步讨论的应用。[0003]自从数十年前以来和在目前，细菌感染的治疗主要是基于传统抗生素的。然而，对这些传统抗生素有耐药性的病原体的出现构成了巨大的问题。因此，剩余的治疗选择甚至是更受限的。这种负面影响也见于其它经济上重要的行业，例如食品行业。【
发明内容】[0004]技术问题[0005]基于以上所描述的现有技术和基于在人类和兽医医学中新的抗菌剂和预防剂的不断增长的需求，完成了本发明。超广谱β_内酰胺酶(ESBL)菌株的治疗越来越具有挑战性。本发明的目的是提供新的抗微生物小菌素多肽，其能够被用作常规抗生素的替代物并且因此用作控制致病微生物(其是ESBL生产者)的替代物。就此而言，本发明的一个目的是提供能够在致病性革兰氏阴性菌的治疗中使用的新的抗微生物小菌素多肽，所述致病性革兰氏阴性菌包括产生ESBL的大肠杆菌，并且此外还包括高毒性肠出血性大肠杆菌(EHEC)菌株(最近在德国的大爆发的致病病原体)(Frank，C.等人(2011)NEnglJMedl0.1056/NEJMoal106483；Mellmann,A.等人(2011)PLoS0NE6(7):e22751.doi:10.1371)。利用某些抗生素治疗使HlEC细胞释放较高量的志贺毒素(Shigatoxin)。因此，病人的抗生素治疗经讨论是禁忌的。在EHEC和肠致病性大肠杆菌(EPEC)感染的治疗和预防中，新的小菌素多肽应该是有效的。本发明的另一个目的是提供在功能性胃肠疾病、尤其是成人和儿童中肠易激综合征(irritablebowelsyndrome)的治疗中使用的新的抗微生物小菌素多肽。本发明的另一个的目的是提供包含产生用于所述医疗用途的新的小菌素多肽的细胞的新的新的小菌素多肽。本发明的目的还提供能够在癌症的治疗中使用的、能够在食物的保藏中使用的以及能够在敷料材料的涂覆中使用的新的小菌素多肽。[0006]本发明的公开内容[0007]为了解决该问题，本发明在一方面特点为分离的多肽，其中所述多肽:[0008]a)包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少50%以上的同一性的氨基酸序列；[0009]b)由包含核苷酸序列的核酸分子编码,所述核苷酸序列与包含SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列具有至少50%以上的同一性；[0010]c)由与包含SEQIDN0:l、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交的核酸分子编码；或者[0011]d)包含含有SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因变体。[0012]具体而言，描述了分离的多肽，其中所述多肽:[0013]a)包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70%以上同一性的氨基酸序列，所述多肽包含具有抗微生物活性的所述氨基酸序列；[0014]b)由包含核苷酸序列的核酸分子编码,所述核苷酸序列与包含SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列具有至少70%以上同一性，所述核苷酸序列包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:1，所述核苷酸序列包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核苷酸序列包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5:[0015]c)由与包含SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交的核酸分子编码，所述核苷酸序列包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:1，所述核苷酸序列包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核苷酸序列包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5;或者[0016]d)包含含有SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因变体，所述多肽包含具有抗微生物活性的所述氨基酸序列。[0017]术语“抗微生物活性”应理解为由小菌素、特别是由小菌素S引起的抗微生物活性。[0018]在本发明的进一步的方面，编码小菌素S多肽的分离的核酸分子是可用的，其中所述核酸分子:[0019]a)包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中的任何一个具有至少50%以上的同一性，[0020]b)包含与包含SEQIDN0:l、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交的核酸分子；[0021]c)包含编码包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少50%以上的同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；或者[0022]d)包含编码包含SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因变体的核酸分子。[0023]更具体而言，描述了分离的核酸分子，其编码小菌素S多肽、具有小菌素S自身免疫活性的多肽或具有对小菌素S转运活性的多肽，其中所述核酸分子:[0024]a)包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中的任何一个具有至少70%以上同一性，所述核酸分子包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:1，所述核酸分子包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核酸分子包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5；[0025]b)包含与包含SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交的核酸分子，所述核酸分子包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:1，所述核酸分子包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核酸分子包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5；[0026]c)包含编码包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70%以上同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有抗微生物活性；或者[0027]d)包含编码包含SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因变体的核酸分子，所述多肽具有抗微生物活性。[0028]在多个方面，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的质粒并且涉及包含根据本发明的核酸分子和/或多肽和/或质粒的细胞。[0029]本发明还涉及选择性结合根据本发明的多肽的抗体。[0030]本发明的进一步的方面涉及包含以下各项的组合物[0031]a)根据本发明的多肽；和/或[0032]b)根据本发明的细胞。[0033]还公开了用于治疗或预防的本发明的多肽、细胞和组合物。[0034]一方面，本发明的多肽、细胞和组合物用于治疗或预防微生物感染，微生物感染优选包括肠致病性和/或肠出血性大肠杆菌(EPEC、EHEC)的感染或者微生物感染优选包括溶血性尿毒症综合征(hemolytic-uremicsyndrome,HUS),优选肠病性溶血性尿毒症综合征(enteropathichemolytic-uremicsyndrome)。[0035]另一方面，本发明的多肽、细胞和组合物用于治疗胃肠疾病，优选功能性胃肠疾病。[0036]在进一步的方面，本发明的多肽、细胞和组合物用于治疗肿瘤。[0037]本发明特点为用于产生本发明的多肽的方法，所述方法包括:[0038]使用根据本发明的核酸分子、核酸引物或探针、质粒或者细胞，或者，[0039]借助溶液相或固相肽合成技术合成本发明的多肽。[0040]能够通过所述用于产生多肽的方法来产生根据本发明的分离的多肽。[0041]在额外的方面，提供用于鉴定对小菌素S敏感的细菌的体外方法，其中所述方法包括使用根据本发明的多肽；核酸分子、核酸引物或探针、细胞、抗体或者组合物。[0042]本发明还涉及用于保藏食物的方法，所述方法包括:[0043]向食物中加入至少一种天然抗微生物剂，其中所述试剂是[0044]a)根据本发明的多肽；[0045]b)根据本发明的细胞；和/或[0046]c)根据本发明的组合物。[0047]在进一步的方面，本发明涉及用于涂覆敷料材料的方法，其中[0048]敷料材料用以下各项涂覆:[0049]a)根据本发明的多肽；和/或[0050]b)根据本发明的组合物。[0051]发明的有利效果[0052]也就是说，本发明人已经鉴定了多肽小菌素S(其为一种新的、而非之前描述的小菌素)，其核苷酸和氨基酸序列是独特的。已经鉴定了造成小菌素S的效果的基因并且已经在功能上表征了它们的效果。发明人已经令人吃惊地发现，与大多数传统β_内酰胺抗生素相比，小菌素S表现出EHEC的抑制效应，所述EHEC包括产生ESBL的0104:Η4爆发菌株以及0128:Η2和0157:H7EHEC分离株(图5)。因此，已经进一步发现，小菌素S在肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠致病性大肠杆菌(EPEC)感染的治疗中是有效的。因此，小菌素S可被用作常规抗生素并且因此用于控制致病微生物的替代物。此外，用于食物保藏的用途是可能的，并且由此完成本发明。已经进一步发现，由质粒PSYMl(图1)编码的大肠杆菌G3/10小菌素S(MccS)基因簇(SEQIDNO:1)由四种成簇基因(clusteredgene)组成:mcsS(SEQIDNO:2)、mcsl(SEQIDNO:3)、mcsA(SEQIDNO:4)和mcsB(SEQIDNO:5)。因为大肠杆菌G3/10是用于例如胃肠疾病的治疗的充分证实的益生菌，小菌素S不必从菌株中纯化。有利地MccS应当在体内有效。[0053]优点是，小菌素S是无毒的，不会引起过敏，并且致病微生物难以对其形成抗性。[0054]根据以下详细描述、以及根据权利要求，本发明的其它特点和优点将会是显而易见的。[0055]附图的简要描述[0056]图1是编码MccS操纵子的大质粒(megaplasmid)pSYMl的载体图。[0057]图2是编码小菌素S前体的基因mcsS的氨基酸序列的示意图(上面板)。可能的前导肽用下划线标出。星号表示可能涉及对II类小菌素来说典型的二硫键的形成的半胱氨酸(Cys)。在大质粒pSYMl上的小菌素S基因簇MccS(下面板)由四种成簇基因组成:mcsS、mcsl、mcsA和mcsB。[0058]图3描绘了在利用大肠杆菌菌株MDS42和G4/9(野生型)以及适当的质粒互补突变体预培养之后EPECE2348/69进入人类肠上皮细胞的附着效率。所使用的星号的含义:*p≤0.01ο[0059]图4描绘了在利用不同的小菌素表达和非表达菌株预培养之后EPECE2348/69野生型和质粒互补突变体对人类肠上皮细胞的附着效率。所使用的星号的含义:*p(0.01，林P^0.05。pAZ8[mcsA、mcsB、mcsl]，pAZ13[mcsl]，pAZ14[mcsl,截短的]。[0060]图5示出了在利用EcN或大肠杆菌G3/10预培养之后的EHEC菌株86-24血清型0157:H7(A)、在德累斯顿分离的EHEC0104:H4⑶和在法兰克福(奥得河)分离的EHEC0104:H4(C)和0128:H2(D)进入人类肠上皮细胞的附着效率。所使用的星号的含义:*P^0.01(与阴性对照相比)。[0061]图6说明了使用多重PCR和作为抑制对照的基因recA的mcsS筛选的结果。[0062]序列表的简要描述[0063]SEQIDNO:1是大肠杆菌G3/10的小菌素S操纵子的核苷酸序列。[0064]SEQIDNO:2是大肠杆菌G3/10的基因mcsS的核苷酸序列。[0065]SEQIDNO:3是大肠杆菌G3/10的基因mcsl的核苷酸序列。[0066]SEQIDNO:4是大肠杆菌G3/10的基因mcsA的核苷酸序列。[0067]SEQIDNO:5是大肠杆菌G3/10的基因mcsB基因的核苷酸序列。[0068]SEQIDNO:6是包括前导序列的大肠杆菌G3/10的小菌素S前体多肽的氨基酸序列。[0069]SEQIDNO:7是不含前导肽的大肠杆菌G3/10的小菌素S多肽的氨基酸序列。[0070]SEQIDNO:8-26是用来扩增包含在小菌素S操纵子(SEQIDNO:1)中的基因的寡核苷酸引物或者是用来筛选编码小菌素S多肽的mcsS基因(SEQIDNO:2)的探针。[0071]发明详述[0072]定义[0073]除非另外定义，在本文中所使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。在相抵触的情况下，将会以本说明书(包括定义)为准。[0074]在本文中不论何时使用时，冠词“一个”、“一种”或“所述”涉及“一个”或“若干个”，即其含义为“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。例如，术语“一个细胞”可以指单个细胞也可以指多个细胞。[0075]术语“包含”也包括在其中术语“包含”是指“由……组成”的实施方式。[0076]如在本文中所使用的，氨基酸或核酸分子“同一性(identity)”等价于氨基酸或核酸分子“/同源性(homology)”。[0077]短语“严格条件”是指在探针核酸分子将会与其靶核酸分子序列(通常在核酸分子的复杂混合物中)杂交但不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且将会在不同的环境中而不同。较长的序列在较高温度特异性杂交。核酸杂交参数可以发现于汇编此类方法的参考文献中，例如《分子克隆:实验室手册》，J.SambiOOk等人编，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989(MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrook,etal.,eds.,SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989)，或者《分子生物学的当前方案》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，F.M.Ausubel等人编，JohnWiley&Sons，Inc.，纽约。一般来说，选取严格条件为在限定的离子强度PH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10°C。Tm是(在限定的离子强度、pH、和核酸浓度下)50%的与靶互补的探针在平衡状态与靶序列杂交的温度(因为靶序列过量存在，在Tni,50%的探针在平衡状态被占据)。严格条件将会是这样的，其中盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约在pH7.0至8.3下0.01至1.0M钠离子离子浓度(或其它盐)并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)来说至少约30°C和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)来说至少约60°C。还可以利用加入去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。对于高严格杂交来说，正信号是至少两倍背景、优选10倍背景杂交。示例性的高严格或严格杂交条件包括:50%甲酰胺，5xSSC和1%SDS在42°C培养或5xSSC和1%SDS在65°C培养，在0.2xSSC和0.1%SDS中在65°C洗涤。[0078]如在本文中所使用的，术语多肽的“类似小菌素的活性”的意思是多肽发挥针对近缘物种的强效的抗微生物/抗菌活性。它进一步的意思是小菌素生产者对它们产生的小菌素具有抗性，其由位于一个基因簇内的至少一个抗性赋予基因介导。[0079]如在本文中所使用的，术语“质粒”是指能够在细胞内复制的核酸分子并且可将另一个核酸分子与其可操作连接以导致附加片段的复制。能够指导编码主题多肽的结构基因的表达的质粒在本文中被称为“表达质粒”。[0080]如在本文中所使用的，短语“可操作连接”的意思是将主题核酸分子附加至质粒上因此由核酸分子形成的结构基因的表达受质粒的控制。[0081]术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多聚腺苷化信号)。[0082]在本文中，术语“接合型质粒”是指在接合过程中能够从一个细胞向另一个细胞移动的质粒。[0083]如在本文中所使用的，术语“转化”和“转染”意图是指用于将外源核酸(例如，DNA)引入至宿主细胞中的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染(Iipofection)、或电穿孔。[0084]如在本文中所使用的，术语“益生菌”是指活微生物，其在以一定数量摄入时发挥超过本身基本营养的健康益处。[0085]如在本文中所使用的，“药物组合物”是指在本文中所描述的活性成分中的一种或多种的制剂，即根据本发明的多肽(或其药学上可接受的盐)或者根据本发明的细胞连同其它化学组分如生理学上和药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进将化合物给予生物体。[0086]在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指的是不引起对生物体的显著刺激并且不消除被给予化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。包含在药学上可接受的载体中的一种成分可以是例如聚乙二醇(PEG)，一种具有在有机介质和水性介质二者中的大范围溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等人(1979))。[0087]在本文中术语“赋形剂”是指加入至药物组合物中以进一步促进给予活性成分的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、多种类型的淀粉、纤维素衍生物、胶质、植物油和聚乙二醇。[0088]如在本文中所使用的，术语“治疗”是指预防、治愈、逆转、减弱、缓解、最小化、抑制或阻止疾病过程的有害影响。[0089]如在本文中所使用的，术语“受试者”是指可以从本发明受益的受试者，如动物或哺乳动物(犬、猫、羊、猪、马、牛、人类)，优选人类受试者。[0090]在本文中，术语“功能性胃肠疾病(functionalgastrointestinaldisorder)”包括多种单独的特发性病症(idiopathicdisorder),其影响胃肠道的不同的部位。[0091]多肽[0092]本发明的小菌素S多肽的特征在于其氨基酸残基序列和新的功能特性。能够使用在本领域内已知的方法分离的多肽。也就是说，能够通过使用标准蛋白质纯化技术的适当纯化方案从细胞或组织来源中分离自然存在的或通过重组产生的小菌素S多肽。然而，小菌素S多肽可以自然存在于细胞中或者可以通过重组DNA技术或重组表达替代物产生，能够使用标准肽合成技术化学合成小菌素S多肽。在本文中，小菌素S多肽被归类为大肠杆菌小菌素，在表现型上已经将其表征并命名为小菌素S。图2在上面板中示出了小菌素S前体的氨基酸序列。双甘氨酸前导肽用下划线标出。星号表示可能涉及对II类小菌素来说典型的二硫键的形成的半胱氨酸。氨基酸序列描绘了具有双甘氨酸切割位点的富含甘氨酸的肽。在本文中所描述的方法中可以使用具有SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽或者具有SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的生物学活性变体。[0093]因此，在优选的实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列或与SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的氨基酸序列或者由其组成。[0094]为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳的比较目的进行序列比对(例如，为了最佳的比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或二者中引入空位)。[0095]在优选的实施方式中，多肽由包含核苷酸序列或由其组成的核酸分子编码，所述核苷酸序列与包含SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性。[0096]然后比较在对应位点上的残基，并且当在一个序列中的位点被与在另一个序列中的对应位点相同的残基占据时，那么分子在所述位点上是相同的。因此，两个序列之间的百分比同一性是由两个序列共享的相同位点数量的函数(即，％同一性=相同位点数量/总位点数量X100)。两个序列之间的百分比同一性是由两个序列共享的相同位点数量的函数，将空位的数量、以及每个空位的长度计入，为了两个序列的最佳的比对将它们引入。[0097]可以利用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的测定。用于序列的比较的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873中修改的。将这种算法结合至Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中。可以利用NBLAST程序得分=100、词长=12进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以利用XBLAST程序、得分=50、词长=3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空位比对(gappedalignment),可以使用如在Altschul等人(1997)NucleicAcidsResearch25(17):3389中描述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://WWW.ncb1.nlm.nih.gov。用于序列的比较的算法的另一个优选的、非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法。将这种算法结合至ALIGN程序(版本2，O或2.0U)，其为GCG序列比对软件包的一部分。当使用用于比较氨基酸序列的ALIGN程序时，可以使用PAM120加权残基表、12的空位长度罚分、和4的空位罚分。用于序列分析的额外的算法在本领域内是已知的，并且包括在Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosc1.10:3中描述的ADVANCE和ADAM;和在Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444中描述的FASTA。[0098]在进一步的实施方式中，多肽具有类似小菌素的、抗微生物、抗菌或抗肿瘤活性。多肽是细菌多肽，优选细菌小菌素S。进一步来说，多肽抑制细菌附着至人类肠上皮细胞。也就是说，应理解的是多肽提供了针对近缘物种的抗微生物/抗菌活性而与此同时多肽不发挥针对其生产者(对它产生的小菌素具有抗性)的抗微生物/抗菌活性。因此，多肽抑制近缘细菌物种附着至人类肠上皮细胞。[0099]优选地，多肽可获得自大肠杆菌菌株，更优选地，可获得自大肠杆菌G3/10。在其它实施方式中，大肠杆菌G3/10是大肠杆菌G3/10DSM16443。[0100]进一步优选的是，多肽是可生物降解的。[0101]核酸分子[0102]使用“焦磷酸测序(pyrosequencing)”技术对益生菌大肠杆菌菌株G3/10的基因组进行完全测序，接着自动注释并进一步手动编辑。[0103]大肠杆菌G3/10具有4935403bp基因组和六个具有在1.3kb至50kb之间大小的质粒。被称为pSYMl的50kb质粒中的40kb与来自尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicE.coli)的pMAS2027几乎完全相同("%同源性)(Ong,C.L,Beatson,S.A.,McEwan,A.G&Schembri,M.A.(2009)ApplEnvironMicrobiol75，6783-6791)。其余IOkb包含不具有与存储在NCBI和ExPASy数据库中核苷酸和氨基酸序列的同源性或仅具有低同源性的阅读框。这些基因中的四个编码顽完全新的、而非之前描述的大肠杆菌小菌素IIa类，包括免疫和转运系统。已经分离出了这种由四种成簇基因(clusteredgene)mcsS(SEQIDNO:2),mcsl(SEQIDNO:3)、mcsA(SEQIDNO:4)和mcsB(SEQIDNO:5)组成的小菌素S基因簇(SEQIDNO:1)。在基因型上对这种小菌素表征并将其命名为小菌素S。MccS的两个输出基因是mcsA和mcs9(图2)。基因mcsA是大肠杆菌溶血素HlyD家族的成员并且显示出与大肠杆菌素分泌蛋白cvaA的低同源性。基因mcsB编码具有两个区域的跨膜结构域和一个肽酶结构域的ABC转运蛋白。MccS的两个输出基因(mcsA和mcsB)编码负责将小菌素S从细胞、尤其是细菌细胞质向细胞外空间转运的多肽。[0104]可以使用标准分子生物学技术和在本文中所提供的序列信息来分离本发明的核酸分子，例如，具有SEQIDNO:1至5的任何一个的或SEQIDN08至26中任何一个核苷酸序列或者它们的一部分的核酸分子。例如，使用全部或部分SEQIDNO:1至5的任何一个的或SEQIDN08至26中的任何一个的核酸序列作为杂交探针，可以使用标准杂交和克隆技术来分离小菌素S核酸分子(例如，如在Sambrook，J.等人《分子克隆:实验室手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中描述的)。[0105]可以使用cDNA、mRNA或可替代地基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸。在以下本文中描述了进一步可用的引物。可以将如此扩增的核酸克隆至适当的载体并通过DNA序列分析描述其特征。此外，可以通过标准合成的技术(例如，使用自动DNA合成仪)制备与小菌素S核苷酸序列相对应的寡核苷酸。[0106]在优选的实施方式中，核酸分子包含与SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的核苷酸序列或者由其组成。[0107]在另一个优选的实施方式中，核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列或与SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的氨基酸序列。[0108]在进一步的实施方式中，核酸分子编码细菌多肽，优选细菌小菌素S。[0109]优选地，核酸分子可获得自大肠杆菌菌株，更优选地，可获得自大肠杆菌G3/10。在具体的实施方式中，核酸分子可获得自大肠杆菌G3/10DSM16443。[0110]核酸引物或探针[0111]由小菌素S基因的克隆测定的核苷酸序列使得能够产生被设计用于扩增本发明的小菌素S基因和/或在其它物种中鉴定小菌素S基因的探针和引物。[0112]因此，本发明进一步提供了作为引物或探针的核酸分子，其包含在严格条件下与根据本发明的核酸分子杂交的序列。这种核酸引物或探针包含至少15个连续碱基的序列。[0113]核酸引物或探针通常包含基本上纯化的寡核苷酸。[0114]在优选的实施方式中，核酸引物或探针与SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中的任何一个或者SEQIDNO:1、2、3、4或5中的任何一个自然存在的等位基因变体或突变体的正义序列至少约12或15个、优选约20或25个、更优选约30、35、40、45、50、55、60、65、75、或100个连续核苷酸杂交。在一个实施方式中，核酸引物或探针在严格条件下与SEQIDNO:1、2、3、4或5或其互补序列中的任何一个核苷酸序列杂交。[0115]在更优选的实施方式中，核酸引物或探针包含SEQIDNO:8至SEQIDN0:26中的至少一个。在表1中示出了典型的核酸引物或探针的序列。[0116]表1:寡核苷酸(由德国Biomers合成)[0117]【权利要求】1.分离的多肽，其中所述多肽:a)包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列至少70%以上同一性的氨基酸序列，所述多肽包含具有抗微生物活性的所述氨基酸序列；b)由包含核苷酸序列的核酸分子编码，所述核苷酸序列与包含SEQIDΝΟ:1、2、3、4或5或者其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列具有至少70%以上同一性，所述核苷酸序列包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:1，所述核苷酸序列包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核苷酸序列包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5；c)由与包含SEQIDNO:1、2、3、4或5或者其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交的核酸分子编码，所述核苷酸序列包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:1，所述核苷酸序列包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核苷酸序列包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核苷酸序列包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5;或者d)包含含有SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因变体，所述多肽包含具有抗微生物活性的所述氨基酸序列。2.分离的核酸分子，所述核酸分子编码小菌素S多肽、具有小菌素S自身免疫活性的多肽或具有对小菌素S转运活性的多肽，其中所述核酸分子:a)包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDΝΟ:1、2、3、4或5或者其互补序列中的任何一个具有至少70%以上同一性，所述核酸分子包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活`性的多肽的SEQIDNO:1，所述核酸分子包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核酸分子包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5；b)包含与包含SEQIDΝΟ:1、2、3、4或5或者其互补序列中任何一个核苷酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交的核酸分子，所述核酸分子包含编码具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S转运活性的多肽的SEQIDΝΟ:1，所述核酸分子包含编码具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO:2，所述核酸分子包含编码具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO:3，所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:4，以及所述核酸分子包含编码具有对小菌素S转运活性的多肽的SEQIDNO:5；c)包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列至少70%以上同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有抗微生物活性；或者d)包含核酸分子，所述核酸分子编码包含SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因变体，所述多肽具有抗微生物活性。3.质粒，所述质粒包含根据权利要求2所述的核酸分子或编码根据权利要求1所述的多肽。4.细胞，所述细胞包含根据权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求1所述的多肽和/或权利要求3所述的质粒，其中包含自然存在的权利要求2的核酸分子或自然存在的权利要求1的多肽或自然存在的权利要求3的质粒的非分离的细胞被排除。5.抗体，所述抗体选择性结合根据权利要求1所述的多肽。6.组合物,所述组合物包含a)根据权利要求1所述的多肽；和/或b)根据权利要求4所述的细胞。7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物是用于表面的消毒剂。9.根据权利要求1所述的多肽、或根据权利要求4所述的细胞或根据权利要求6所述的组合物，其用于治疗或预防。10.根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求4所述的细胞或根据权利要求6所述的组合物，其用于治疗或预防微生物感染。11.根据权利要求10所述的多肽，所述微生物感染包括肠致病性和/或肠出血性大肠杆菌(EPEC、EHEC)的感染，·或者用于治疗或预防与溶血性尿毒症综合征(HUS)相关的微生物感染。12.根据权利要求1所述的多肽、或根据权利要求4所述的细胞或根据权利要求6所述的组合物，其用于治疗或预防胃肠疾病或功能性胃肠疾病。13.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求4所述的细胞或根据权利要求6所述的组合物，其用于治疗肿瘤。14.用于产生根据权利要求1所述的多肽的方法，所述方法包括使用根据权利要求2所述的核酸分子、根据权利要求3所述的质粒或根据权利要求4所述的细胞或者借助溶液相或固相肽合成技术合成根据权利要求1所述的多肽。15.用于鉴定对小菌素S敏感的细菌的体外方法，所述方法包括使根据权利要求1所述的多肽或由根据权利要求2所述的核酸分子编码的多肽或根据权利要求4所述的细胞或根据权利要求6所述的组合物与细胞接触，其中降低所述细胞对肠上皮细胞的附着效率指示所述细胞对小菌素S的敏感性。16.用于保藏食物的方法，所述方法包括:向食物中加入至少一种天然抗微生物剂，其中所述抗微生物剂是a)根据权利要求1所述的多肽；b)根据权利要求4所述的细胞；和/或c)根据权利要求6所述的组合物。17.用于涂覆敷料材料的方法，其中敷料材料涂用以下各项涂覆:a)根据权利要求1所述的多肽；和/或b)根据权利要求6所述的组合物。【文档编号】C12N15/74GK103717744SQ201280039385【公开日】2014年4月9日申请日期:2012年8月13日优先权日:2011年8月12日【发明者】弗洛里安·贡策,安克·琼蒂格,屈特·齐默尔曼申请人:西比奥格鲁普公司