用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法

用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法
【专利摘要】本发明提供受试者中阿尔茨海默病(AD)的诊断和预后的方法，所述方法包括检测在来自所述受试者的样品中存在或不存在一种或多种遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。还提供了预测受试者对用于治疗AD的治疗剂的应答的方法。
【专利说明】用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法
发明领域
[0001]提供鉴定、诊断和预测阿尔茨海默病(AD)(包括AD的特定亚型)的方法，以及治疗AD (包括特定的患者亚群)的方法。还提供用于鉴定有效的AD治疗剂并且预测对AD治疗剂的应答性的方法。
[0002]背景
[0003]阿尔茨海默病(Alzheimer' s Disease, AD)是一种与认知和记忆功能进行性丧失和最终痴呆症(dementia)相关的中枢神经系统神经变性疾病。AD是发达国家中最显著的和常见的痴呆症病因，占所有痴呆症病例的60%以上。在尸体解剖中在AD患者中观察到两种病理性特征:在海马、大脑皮质和脑部对认知功能重要的其他区域中的细胞外斑块和细胞内缠结。斑块主要由淀粉状蛋白β (Αβ)的沉积形成，所述淀粉状蛋白β是一种来源于淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的肽。
[0004]AD的频率随成年期的每个十年增加，在85岁以上人群中达到20-40%。由于越来越多的人将活到八十多岁和九十多岁，预计在接下来的20年内患者数目将增至三倍。在美国有超过五百万人患有AD，其中每年有800，000例死亡与AD相关。在2011年，护理AD患者的费用估计为总共1830亿美元。AD还对家庭成员和护理者产生沉重的感情代价:在美国约有1490万人护理AD患者。AD患者在诊断后平均生活7至10年，并且平均5年的时间在家庭或在疗养院的看护下。
[0005]早发型阿尔茨海默病(Early-onsetAlzheimer' s disease, EOAD)是一种罕见形式的阿尔茨海默病，其中个体在65岁之前诊断患有该病。所有阿尔茨海默病患者中不到10%的患者具有E0AD。大约一半的EOAD病例是家族性的，其中疾病遗传性按照常染色体显性模式遗传。没有发现明显的遗传性模式的AD病例称为“偶发性的”。迄今为止，已经在具有家族性EOAD的家族中鉴定了三种基因中的突变，包括在21号染色体上的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)，在14号染色体上的早老蛋白I(PSENl)和在I号染色体上的早老蛋白
2(PSEN2) 0在APP和早老蛋白基因中的大部分致病性突变与APP的异常加工相关，这导致淀粉状蛋白斑块中主要成分Αβ 42的产生增加。
[0006]晚发型阿尔茨海默病(Late-onset Alzheimer' s disease,LOAD)是最常见形式的阿尔茨海默病，占约90%的病例并且通常在65岁之后发生。LOAD几乎占85岁以上的所有个体中的一半，并且典型地是偶发性的。基于成对研究(twin studies)，该疾病的遗传可能性估计为79%，在男性和女性之间的流行性或遗传可能性没有差异(控制年龄后)(Gatz，等，Arch.Gen.Psychiatry, 63:168-74 (2006))。目前鉴定为与早发型阿尔茨海默病相关的单基因突变似乎不参与晚发型阿尔茨海默病。
[0007]尽管还没有发现引起晚发型形式的AD的特定的基因，但是增加人们发生该疾病的危险的一个遗传风险因素与在19号染色体上发现的载脂蛋白E(APOE)基因相关。早期的AD遗传研究证明与19号染色体上含有APOE基因的这一区域的相关性和连锁性(Schellenberg,等，J.Neurogenet.(神经遗传学杂志)，4:97-108 (1987) ；Pericak-Vance,等，Am.J.Hum.Gen.(美国人类遗传学杂志)，48:1034-1050 (1991))。APOE基因具有三个常见的等位基因，称为ε 2、ε3和ε 4。与常见的ε 3等位基因相比，ε 4等位基因增加AD的危险性，而ε 2等位基因减少AD的危险性。(Corder，等(1993) Science (科学)，281 =921-923 ；Corder等(1994) Nat.Genet.(自然遗传学)7:180-184)。尽管对于一般群体到85岁的AD的终生危险(lifetime risk,LTR)为11-14%，但是对于AP0E3/4携带者LTR升高至23-35%，并且对于 AP0E4/4 携带者升高至 51-68% (Genin 等(2011)Molecular Psychiatry (分子精神病学)16 =903-907)。对于AP0E2/4携带者的AD危险性与具有中性基因型AP0E3/3的受试者的相同，而AP0E2/3携带者具有减少的危险性。尽管40-65%的AD患者具有至少一个拷贝的APOE- ε 4等位基因,但是APOE- ε 4不是该疾病的必需的决定因素，原因在于至少二分之一的AD患者是APOE- ε 4阴性的，并且一些APOE- ε 4纯合子从来不发生该疾病。因此，该等位基因本身对于AD诊断是不充分的(Ertekin-Taner (2007)Neurol.Clin.25:811)。
[0008]目前，诊断AD的主要方法包括考虑详细的患者病史、实施记忆和心理学测试并且排除其他关于记忆丧失的解释，包括暂时性(例如，抑郁或维生素B12缺乏)或永久性(例如中风)病况。以这种方法，直至死亡后AD才能被最终诊断，在死亡后，尸体解剖揭示在患者脑中的疾病特有的淀粉状蛋白斑块和神经原纤维缠结。另外，临床诊断步骤仅在患者已经开始表现出显著的、异常的记忆丧失或个性变化后有帮助。到那时，患者可能已经患有AD数年了。例如，能够允许医师在疾病进程的早期鉴定AD或鉴定处于发生该疾病的高危险性中的个体的诊断测试将提供在该疾病进程的早期阶段进行干预的选择。与晚期干预相比，在疾病进程的早期干预通过延迟疾病发病或进展的确通常导致更好的治疗结果。因此，需要诊断和辅助AD诊断的其他方法。[0009]概述
[0010]本发明提供诊断和预后受试者中的阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括检测在来自所述受试者的样品中存在或不存在一种或多种遗传变异，其中所述遗传变异的存在表示所述受试者患有或有危险发生AD，如本文公开的。
[0011]在一个实施方案中，本发明提供一种筛选在具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中对AD的发生具有有害或有益作用的遗传变异的方法，所述方法包括，与年龄在75岁以上、无AD并且具有至少一种APOE- ε 4等位基因的对照受试者相比，鉴定在年龄在65岁以下、患有AD并且具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中以增加或减小的频率存在的遗传变异，其中，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中增加的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有害作用相关，并且，与对照受试者相比,在患有AD的受试者中减小的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有益作用相关。在一些实施方案中，所述遗传变异使用全基因组关联扫描(genome-wide association scan)鉴定。
[0012]本发明还提供一种筛选在具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中对AD的发生具有有害或有益作用的遗传变异的方法，所述方法包括:(a)确定在多名年龄在65岁以下、患有AD并且具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者的一个或多个基因座的基因型；
(b)确定在多名年龄在75岁以上、无AD并且具有至少一种APOE- ε 4等位基因的对照受试者的一个或多个基因座的基因型；并且(c)与对照受试者相比，鉴定在患有AD的受试者中以增加的或减小的频率存在的遗传变异，其中，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中增加的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有害作用相关，并且，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中减小的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有益作用相关。
[0013]在这些筛选方法的一些实施方案中，所述有害作用是增加的发生AD的危险。在一些实施方案中，所述有害作用是AD在较低年龄发病。在一些实施方案中，所述有益作用是减少的发生AD的危险。在一些实施方案中，所述有益作用是AD在较晚年龄发病。
[0014]在一个实施方案中，本发明提供一种用于检测受试者中存在或不存在指示阿尔茨海默病(AD)的遗传变异的方法，所述方法包括:(a)使来自所述受试者的样品与能够检测基因或其基因产物中存在或不存在遗传变异的试剂接触，所述基因选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因；并且(b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0015]在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。[0016]在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的氨基酸置换T835M。
[0017]在所述方法的一些实施方案中，所述试剂选自寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核酶。在其他实施方案中，所述试剂是与包含所述遗传变异的蛋白特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述试剂是被标记的。
[0018]在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0019]在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤(b)的结果治疗所述患者的AD。在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE- ε 4等位基因的存在。在一个实施方案中，与具有至少一种APOE- ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传变异的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0020]本发明还提供用于检测指示受试者中的阿尔茨海默病(AD)的遗传变异的方法，所述方法包括确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0021]在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
[0022]在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的氨基酸置换T835M。
[0023]在所述方法的不同实施方案中，所述一种或多种遗传变异的存在的检测通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定(molecular beacon assay)、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。[0024]在所述方法的其他实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异在蛋白中的存在通过选自下述的方法进行:电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们的组合。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前，来自所述样品的蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
[0025]在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0026]在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤(b)的结果治疗所述受试者的AD。在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE- ε 4等位基因的存在。在一个实施方案中，与具有至少一种APOE- ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE-ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0027]本发明还提供一种用于诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括:(a)使来自所述受试者的样品与能够检测基因或其基因产物中存在或不存在遗传变异的试剂接触，所述基因选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因；并且(b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0028]在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C (SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
[0029]在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的氨基酸置换T835M。
[0030]在所述方法的一些实施方案中，所述试剂选自寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核酶。在其他实施方案中，所述试剂是与包含所述遗传变异的蛋白特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述试剂是被标记的。
[0031]在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。[0032]在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤(b)的结果治疗所述受试者的AD。在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE- ε 4等位基因的存在。在一个实施方案中，与具有至少一种APOE- ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE-ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0033]在一些实施方案中，所述方法还包括使所述受试者进行选自由下述组成的组的一种或多种另外的AD诊断测试:筛查一种或多种另外的遗传标记、实施精神状态检查或使所述受试者进行成像步骤。
[0034]在一些实施方案中，所述方法还包括分析所述样品以检测作为APOE修饰物(modifier)的至少一种另外的遗传标记的存在,其中所述至少一种另外的遗传标记处于选自下述的基因中:编码IL6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的基因。在不同的实施方案中，所述至少一种另外的遗传标记是在IL6R的氨基酸序列(SEQID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP、在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835W的SNP或表3中列出的SNP。
[0035]本发明还提供一种诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括:确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0036]在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
[0037]在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的氨基酸置换T835M。
[0038]在所述方法的不同实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异的存在通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。
[0039]在所述方法的其他实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异在蛋白中的存在通过选自下述的方法进行:电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们的组合。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前，来自所述样品的蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
[0040]在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0041]在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤(b)的结果治疗所述受试者的AD。在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE- ε 4等位基因的存在。在一个实施方案中，与具有至少一种APOE- ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0042]在一些实施方案中，所述方法还包括分析所述样品以检测作为APOE修饰物的至少一种另外的遗传标记的存在，其中所述至少一种另外的遗传标记处于选自下述的基因中:编码IL6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的基因。在不同的实施方案中，所述至少一种另外的遗传标记是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP、在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835W的SNP或表3中列出的SNP。
[0043]本发明还提供一种鉴定具有增加的在较早的年龄发生AD的危险的受试者的方法，所述方法包括:(a)确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异；并且(b)确定存在或不存在至少一种APOE- ε 4等位基因，其中与不存在所述遗传变异和至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者相比，所述遗传变异和至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示所述受试者具有在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0044]在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
[0045]在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的氨基酸置换T835M。
[0046]在所述方法的不同实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异的存在通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。[0047]在所述方法的其他实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异在蛋白中的存在通过选自下述的方法进行:电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们的组合。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前，来自所述样品的蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
[0048]在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0049]本发明还提供一种辅助预测受试者中AD的亚型的预后的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的生物样品中在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP的存在，其中所述AD的亚型至少部分特征在于，在来自所述受试者的生物样品中与一个或多个对照受试者相比增加的可溶性IL6R水平。
[0050]本发明还提供一种预测受试者对靶向IL6R的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向IL6R的治疗剂的应答。在一个实施方案中，所述治疗剂是抗-1L6R抗体。
[0051]本发明还提供一种辅助预测受试者中AD的亚型的预后的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP的存在，其中所述AD的亚型至少部分特征在于，在来自所述受试者的生物样品中与一个或多个对照受试者相比减少的TrkB活化。
[0052]本发明还提供一种预测受试者对靶向TrkB的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向TrkB的治疗剂的应答。在一个实施方案中，所述治疗剂是TrkB激动剂。
[0053]本发明还提供一种辅助预测受试者中AD的亚型的预后的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP的存在，其中所述AD的亚型至少部分特征在于，与一个或多个对照受试者相比，在来自所述受试者的生物样品中UNC5C增加的细胞凋亡活性。
[0054]本发明还提供一种预测受试者对靶向UNC5C的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向UNC5C的治疗剂的应答。在一个实施方案中，所述治疗剂祀向UNC5C死亡结构域(death domain)。
[0055]本发明还提供一种诊断或预测受试者中的阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括:(a)使来自所述受试者的样品与能够检测存在或不存在一种或多种SNPs的试剂接触，所述SNPs选自由下述组成的组:在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列中导致氨基酸置换R206W的SNP和在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，并且(b)分析所述样品以检测所述一种或多种SNPs的存在，其中在所述样品中存在所述一种或多种SNPs指示所述受试者患有或有危险发生AD。在一个实施方案中，所述方法还包括检测选自表3中列出的SNPs的一种或多种SNPs。[0056]本发明还提供用于实施所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种寡核苷酸检测试剂，其中所述寡核苷酸检测试剂区分所述一种或多种SNP处至少两种不同的等位基因的每一种。在不同的实施方案中，所述检测通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、测序、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。
[0057]在一个实施方案中，所述寡核苷酸检测试剂固定在基底上。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸检测试剂排列在阵列上。
[0058]本发明还提供一种诊断或预测受试者中的阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括:(a)使来自所述受试者的样品与能够检测存在或不存在一种或多种氨基酸置换的试剂接触，所述氨基酸置换选自由下述组成的组:IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO: I)中的氨基酸置换D358A、NTF4的氨基酸序列中的氨基酸置换R206W和UNC5C的氨基酸序列(SEQ IDNO:3)中的氨基酸置换T835M，并且(b)分析所述样品以检测所述一种或多种氨基酸置换的存在，其中在所述样品中存在所述一种或多种氨基酸置换指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0059]本发明还提供用于实施所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种抗体检测试剂，其中所述抗体检测试剂区分所述一种或多种氨基酸置换处至少两种不同的氨基酸的每一种。本发明还提供用于实施所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种肽检测试剂，其中所述肽检测剂区分所述一种或多种氨基酸置换处至少两种不同的氨基酸的每一种。
[0060]本发明还提供用于治疗AD的治疗剂，其中所述治疗剂是选自IL6R、NTF4和UNC5C的基因编码的蛋白之一或组合。
[0061]本发明还提供用于诊断或预测AD的分子探针组合，所述组合包含至少两种能够直接或间接检测至少两种标记的探针，所述至少两种标记选自包括下述的组:在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列中导致氨基酸置换R206W的SNP和在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，其中所述分子探针不与多于1000个元件的微阵列缔合。在一个实施方案中，所述分子探针组合还包含一种或多种能够直接或间接检测选自表3中列出的SNPs的至少两种标记的探针。
[0062]附图简述
[0063]图1示例用于APOE修饰物筛选的策略。
[0064]图2是显示跨越人I号染色体一部分的区域的Manhattan图,其中在AD病例样品相对于超级对照(supercontrols)的遗传变异之间有统计学显著差异。P值越低，关联越强。
[0065]图3显示在来自NIA/L0AD研究的未选择的阿尔茨海默病病例(N = 932名个体)和对照(N = 832名个体)中rs4129267的T等位基因，rs2228145的C等位基因替代者，的频率。次要等位基因的频率通过在AD病例中发病的年龄和对照中的年龄而进行分层。
[0066]图4显不来自TGEN计划(Webster等(2009) Am.J.Hum.Genet.(美国人类遗传学杂志)84:445-458)的数据的分析。膜结合的与可溶性IL6R在患有AD的受试者的脑中的表达水平与对照(CN)使用仅检测膜结合形式的IL6R(NM_000565)的探针或捕获膜结合的和sIL6R(NM_181359) 二者的探针进行比较。
[0067]图5显示在LOl家谱中的非参数连锁分析的结果。
[0068]图6提供的UNC5家族成员的氨基酸序列比对，显示氨基酸残基T853的保守性。
[0069]图7是显示跨越人I号染色体一部分的区域的Manhattan图,其中在遗传变异与脑脊液中可溶性IL6R水平之间有统计学显著的关联性。P值越低，关联越强。
[0070]图8显示在转染了 IL6R的D358或A358构建体并用IOOnM佛波醇肉豆蘧酸乙酸酯(phorbol myristate acetate, PMA)处理 O, 30,60 或 120 分钟的 293T 细胞中相对膜结合的IL6R的百分数。处理后收集细胞，并且用IL6R-PE抗体染色，并且通过FACS分析膜结合的IL6R。
[0071]图9显示在用IOOnM PMA处理60分钟之前或之后在⑶4+T细胞中膜结合的IL6R的百分数，所述CD4+T细胞来自对D358或A358是纯合的年龄、性别和种族匹配的供体。处理后立刻收集细胞，用IL6R-PE抗体染色，并且通过FACS分析膜结合的IL6R。
[0072]图10显示人CD4+T细胞的可溶性IL6R，所述人CD4+T细胞来自对D358或A358是纯合的年龄、性别和种族匹配的供体。⑶4+T细胞涂布在抗-⑶3/抗-⑶28上，24，48和72小时后收集用于总RNA提取，并且收集上清来通过ELISA确定sIL6R水平。该图显示了在每个时间点A358相对于D358的可溶性IL6R的倍数增加。
[0073]发明实施方案详述
[0074]定义
[0075]术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，是指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或是可以通过DNA或RNA聚合酶掺入到聚合物中的任意底物(substrate)。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进行进一步的修饰，诸如通过与标记组分缀合而修饰。其它类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，中间核苷酸修饰，诸如例如具有不带电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)的那些和具有带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂结构部分的那些，所述悬垂结构部分诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化的金属等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，在糖中通常存在的任一羟基可以被取代，例如，被磷酸酯基(phosphonate groups)、磷酸盐基(phosphate groups)取代，由标准的保护基团保护，或被活化以制备与另外的核苷酸的另外的键，或可以缀合到固体支持物上。5'和3'末端OH可以被磷酸化或者用具有I至20个碳原子的胺或有机加帽基团结构部分取代。其它羟基也可以被衍生成标准的保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括，例如，2' -O-甲基-2' -O-烯丙基,2'-氟-或2' _叠氮基_核糖，碳环糖类似物，ct -异头糖,差向异构糖,诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物及无碱基核苷类似物，诸如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团所取代。这些备选连接基团包括，但不限于这样的实施方案:其中磷酸酯被P(O)S( “硫代酯”)、P(S)S( “二硫代酯”)、"(O)NR2( “酰胺化物”)、？^)!?、？^)。!^、⑶或CH2( “甲酰化物(formacetal) ”)取代，其中每个R或V独立地为H或取代的或未取代的烷基(1-20个C)，所述烷基任选含有醚(一0—)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核昔酸中的所有键不必都是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
[0076]“寡核苷酸”用在本文中是指长度至少约7个核苷酸并且长度小于约250个核苷酸的短的单链多核苷酸。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上述关于多核苷酸的描述同等且完全适用于寡核苷酸。[0077]术语“引物”是指能够与核酸杂交并且允许互补核酸的聚合(通常通过提供一个游离的3' -OH基团)的单链多核苷酸核酸。
[0078]用于本文时，术语“基因”是指一种DNA序列，其通过其模板或信使RNA编码特定的肽、多肽或蛋白质特有的氨基酸序列。术语“基因”还指编码RNA产物的DNA序列。如本文中参照基因组DNA所用，术语基因包括插入区、非编码区以及调控区，并且可以包括5'和3'末端。
[0079]术语“遗传变异”或“核苷酸变异”是指相对于参比序列(例如，通常存在的和/或野生型序列，和/或主要等位基因的序列)，核苷酸序列中的改变(例如，一个或多个核苷酸的插入、缺失、倒位或置换，如单核苷酸多态性(SNP))。除非另有说明，该术语还包括在所述核苷酸序列的互补序列中的相应变化。在一个实施方案中，遗传变异是体细胞多态性。在一个实施方案中，遗传变异是种系多态性。
[0080]“单核苷酸多态性”或“SNP”是指DNA中的单个碱基位置，在该单个碱基位置上存在一个群体的不同的等位基因或替代的核苷酸。该SNP位置通常前接和后接所述等位基因的高度保守序列(例如，在种群中小于1/100或1/1000的成员中不同的序列)。对于在每个SNP位置的等位基因，个体可以是纯合的或杂合的。
[0081]术语“氨基酸变异”是指相对于参比序列，在氨基酸序列中的变化(例如，一个或多个氨基酸的插入、置换或缺失，如内部缺失或N-或C-末端截短)。
[0082]术语“变异”是指核苷酸变异或氨基酸变异。[0083]术语“在对应于SNP的核苷酸位置上的遗传变异”、“在对应于SNP的核苷酸位置上的核苷酸变异”及其语法变体是指多核苷酸序列中在基因组中被所述SNP占据的相对的对应DNA位置处的核苷酸变异。除非另有说明，该术语还包括了在该核苷酸序列的互补序列中的相对应的变异。[0084]用于本文时，术语“等位基因”是指在染色体的给定基因座存在的一对或一系列形式的基因或非基因区。在正常的二倍体细胞中，存在任一种基因的两个等位基因(每个亲本一个)，其占据同源染色体上相同的相对位置(基因座)。在一个群体中，一种基因可能存在多于两个的等位基因。SNPs也具有等位基因，即，表征所述SNP的两个(或更多个)核苷酸。
[0085]用于本文时，术语“连锁不平衡”或“LD”是指这样的情形，其中，在由群体取样的个体中，关于两个以上基因座的等位基因不以由其单个等位基因频率的产物预测的频率一起发生。LD中的标记不遵守孟德尔第二独立随机分离定律(Mendel' s second law ofindependent random segregation)。LD可能由一些人口统计学或群体人为物中的任一种引起以及由于存在各标记之间的遗传连锁而引起。然而，当控制这些人为物并且消除作为LD的来源时，那么LD直接由这样的事实导致:所涉及的基因座位于同一染色体上彼此接近，从而使得对于不同标记的等位基因的特定组合(单元型)一起遗传。可以假设在高LD中的标记位置彼此接近，并且可以假设在高LD中的具有遗传性状的标记或单元型位于影响该性状的基因附近。
[0086]用于本文时，术语“基因座”是指沿着染色体或DNA序列的特定位置。取决于上下文，基因座可以是基因、标记、染色体带或一个或多个核苷酸的特定序列。
[0087]术语“阵列”或“微阵列”是指可杂交的阵列元件，优选多核苷酸探针(例如，寡核苷酸)在基底上的有序排列。基底可以是固体基底，如玻璃载玻片，或半固体基底，如硝化纤维素膜。
[0088]术语“扩增”是指产生一个或多个拷贝的参比核酸序列或其互补序列的过程。扩增可以是线性的或指数的(例如，聚合酶链式反应(PCR))。“拷贝”不必意味着相对于模板序列的完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，如脱氧肌苷，在扩增过程中发生的故意的序列改变(诸如，通过包含可与模板杂交但是不与模板完全互补的序列的引物而引入的序列改变)和/或序列错误。
[0089]术语“等位基因特异性寡核苷酸”是指与靶核酸的包含核苷酸变异(通常是置换)的区域杂交的寡核苷酸。“等位基因特异性杂交”是指，当等位基因特异性寡核苷酸与其靶核酸杂交时，所述等位基因特异性寡核苷酸中的核苷酸与所述核苷酸变异特异性碱基配对。能够针对特定的核苷酸变异进行等位基因特异性杂交的等位基因特异性寡核苷酸被认为是“特异性针对”所述变异。
[0090]术语“等位基因特异性引物”是指作为引物的等位基因特异性的寡核苷酸。
[0091]术语“引物延伸测定”是指这样的测定:其中核苷酸被添加到核酸中，产生直接或间接检测的较长的核酸或“延伸产物”。可以添加核苷酸以延伸核酸的5'或3'末端。
[0092]术语“等位基因特异性核苷酸掺入测定”是指一种引物延伸测定，其中一个引物:(a)杂交到靶核酸的作为核苷酸变异的3'或5'的区域，并且(b)通过聚合酶延伸，由此将与所述核苷酸变异互补的核苷酸掺入到延伸产物中。[0093]术语“等位基因特异性引物延伸测定”指的是其中等位基因特异性引物与靶核酸杂交并且延伸的引物延伸测定。
[0094]术语“等位基因特异性寡核苷酸杂交测定”是指这样的测定:其中(a)等位基因特异性寡核苷酸与靶核酸杂交，并且(b)杂交被直接或间接地检测。
[0095]术语“5'核酸酶测定”是指这样的测定:其中等位基因特异性寡核苷酸与靶核酸的杂交允许杂交的探针的核酸水解切割，从而产生可检测的信号。
[0096]术语“利用分子信标的测定”是指这样的测定:其中等位基因特异性寡核苷酸与靶核酸的杂交产生的可检测信号水平高于由游离的寡核苷酸发射的可检测信号水平。
[0097]术语“寡核苷酸连接测定”是指这样的测定:其中等位基因特异性寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交彼此相邻地杂交到靶核酸上并且连接在一起(直接地或通过插入的核苷酸间接地连接)，并且所述连接产物被直接或间接地检测。
[0098]术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶核酸序列”通常是指怀疑或已知具有核苷酸变异的目的多核苷酸序列，包括通过扩增产生这样的靶核酸的拷贝。
[0099]术语“检测”包括任意方式的检测，包括直接和间接的检测。
[0100]术语“IL6R”用来指的是白介素6受体，其也被称为IL-6R1，IL-6RA，IL_6Ra，白介素6受体亚基a和⑶126。该术语包括“全长的”未加工的IL6R，以及由在细胞中加工产生的任何形式的IL6R。该术语还包括天然存在的IL6R变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人IL6R的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:1:
[0101]MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLP⑶SVTLTCPGVEPEDNATVHW VLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLS CFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAV PE⑶SSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRffLSVTffQD PHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQ GEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSS SVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRP TPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR(SEQ ID NO:1)
[0102](Genbank 登记号 NP_000566)。
[0103]术语“NTF4”用来指神经营养素4 (neutrotrophin4)，其也被称为神经营养素5(neutrotrophin5)，神经营养因子 4，神经营养因子 5，NT4, NT5, NT-4，NT-5，NTF5, GLClO和NT-4/5。该术语包括“全长的”未加工的NTF4，以及由在细胞中加工产生的任何形式的NTF4。该术语还包括天然存在的NTF4变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人NTF4的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:2:
[0104]MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLF LLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEV LGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRAL TADAQGRVGffRffIRIDTACVCTLLSRTGRA(SEQ IDNO: 2)
[0105](Genbank 登记号 NP_006170)。`[0106]术语“UNC5C”用于指对于神经生长因子受体UNC5C，其也被称为UNC-5同源物3，UNC-5同源物C和UNC5H3。该术语包括“全长的”未加工的UNC5C，以及由在细胞中加工产生的任何形式的UNC5C。该术语还包括天然存在的UNC5C变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人UNC5C的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:3:
[0107]MRKGLRATAARCGLGLGYLLQMLVLPALALLSASGTGSAAQDDDFFHELPETFPSDPPEP LPHFLIEPEEAYIVKNKPVNLYCKASPATQIYFKCNSEWVHQKDHIVDERVDETSGLIVR EVSIEISRQQVEELFGPEDYffCQCVAWSSAGTTKSRKAYVRIAYLRKTFEQEPLGKEVSL EQEVLLQCRPPEGIPVAEVEffLKNEDIIDPVEDRNFYITIDHNLIIKQARLSDTANYTCV AKNIVAKRKSTTATVIVYVNGGWSTWTEWSVCNSRCGRGYQKRTRTCTNPAPLNGGAFCE GQSVQKIACTTLCPVDGRWTPWSKWSTCGTECTHWRRRECTAPAPKNGGKDCDGLVLQSK NCTDGLCMQTAPDSDDVALYVGIVIAVIVCLAISVVVALFVYRKNHRDFESDIIDSSALN GGFQPVNIKAARQDLLAVPPDLTSAAAMYRGPVYALHDVSDKIPMTNSPILDPLPNLKIK VYNTSGAVTPQDDLSEFTSKLSPQMTQSLLENEALSLKNQSLARQTDPSCTAFGSFNSLG GHLIVPNSGVSLLIPAGAIPQGRVYEMYVTVHRKETMRPPMDDSQTLLTPVVSCGPPGAL LTRPVVLTMHHCADPNTEDWKILLKNQAAQGQWEDVVVVGEENFTTPCYIQLDAEACHIL TENLSTYALVGHSTTKAAAKRLKLAIFGPLCCSSLEYSIRVYCLDDTQDALKEILHLERQ MGGQLLEEPKALHFKGSTHNLRLSIHDIAHSLffKSKLLAKYQEIPFYHVffSGSQRNLHCT FTLERFSLNTVELVCKLCVRQVEGEGQIFQLNCTVSEEPTGIDLPLLDPANTITTVTGPS AFSIPLPIRQKLCSSLDAPQTRGHDWRMLAHKLNLDRYLNYFATKSSPTGVILDLWEAQN FPDGNLSMLAAVLEEMGRHETVVSLAAEGQY(SEQ ID NO:3)
[0108](Genbank 登记号 NP_003719)。
[0109]用于本文时，术语“阿尔茨海默病”(AD)是指早发型AD和迟发型AD 二者，以及家族形式和偶发形式的AD 二者。
[0110]用于本文时，“有危险”患有阿尔茨海默病的受试者可能具有或可能不具有可检测的疾病或疾病症状，并且在本文所述的治疗方法之前可能已经表现出或可能没有表现出可检测的疾病或疾病症状。“有危险`”表示受试者具有一种或多种危险因素，其是与阿尔茨海默病的发生相关的可测量的参数，如本文所述并且如本领域所知的。与不具有这些危险因素中的一种或多种的受试者相比，具有这些危险因素中的一种或多种的受试者具有更高的发生阿尔茨海默病的可能性。
[0111]术语“诊断”用在本文中是指分子或病理学状态、疾病或病况(例如，AD)的鉴定或分类。“诊断”还可以是指特定AD的亚型的分类，例如，通过分子特征(例如，由特定基因或核酸区域中的遗传变异所表征的患者亚群)分类。
[0112]术语“辅助诊断”用在本文中是指辅助作出关于AD的特定类型的症状或病况的存在、或性质的临床判断的方法。例如，一种AD辅助诊断方法可以包括测量来自个体的生物样品中存在或不存在一种或多种指示AD或增加的发生AD的危险的遗传标记。
[0113]术语“预后”用在本文中是指预测发生AD症状的可能性，所述AD症状包括，例如，记忆丧失和痴呆。术语“预测”用在本文中是指患者有利地或不利地应答药物或药物组合的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些应答的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗后是否存活或改善和/或患者在治疗后存活或改善的可能性，例如，用特定的治疗剂的治疗，以及持续特定的时间期间没有疾病复发。本发明的预测方法可以在临床上用于通过选择对任意特定的患者最合适的治疗形式而作出治疗决定。在预测患者是否可能有利地应答治疗方案(诸如给定的治疗方案，包括，例如，给药给定的治疗剂或组合，手术干预，类固醇治疗等)或在治疗方案后是否可能有患者的长期存活方面，本发明的预测方法是有价值的工具。
[0114]用于本文时，“治疗”指在尝试改变被治疗的个体或细胞的天然进程中的临床干预，并且可以在临床病理学的进程之前或过程中进行。治疗的理想效果包括防止疾病或病况或其症状的发生或复发，缓和疾病的病况或症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和获得好转或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于尝试延缓疾病或病症的进展。
[0115]用于本文时，“AD治疗剂”、“有效治疗AD的治疗剂”及其语法变化是指这样的试剂:当以有效量提供时，已知其、临床上显示或临床医生预测其在患有AD的受试者中提供治疗益处。在一个实施方案中，该短语包括制造商市售的或另外由执业临床医生使用的作为预测以有效量提供时将在患有AD的受试者中提供治疗益处的临床上可接受的试剂的任意试剂。在各种非限制性实施方案中，AD治疗剂包括胆碱酯酶抑制剂(cholinesteraseinhibitor),美金刚(memantine)，抗激动药(ant1-agitation medication),抗抑郁药(ant1-depressive),抗焦虑药(anxiolytic)或革巴向淀粉状蛋白前体蛋白、β淀粉状蛋白、淀粉状蛋白斑或切割淀粉状蛋白前体蛋白的任一种酶(包括但不限于α-分泌酶、β-分泌酶和Y-分泌酶)的化合物。
[0116]术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0117]术语“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0118]“治疗效果”是指好于没有患有病症的个体中的平均或正常状况的状况的产生(即，与在未患病或无症状的受试者中的正常或平均状况相比，在至少部分归因于CNS功能的受试者中的超常作用，诸如改善的认知、记忆、情绪或其他特征)。
[0119]“有效量”是指在剂量和需要的时间期间有效实现需要的治疗或预防结果的量。治疗剂的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状况、年龄、性别和体重以及抗体在所述个体中引发需要的反应的能力的因素而变化。有效量还是治疗有益作用超过治疗剂的任意毒性或有害作用的量。“预防有`效量”是指在剂量和需要的时间期间有效实现需要的预防结果的量。典型地但是不是必需地，由于是在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，因此预防有效量低于治疗有效量。
[0120]“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，灵长类动物(包括人和非人灵长类动物)和啮齿动物(如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
[0121]用在本文中时，“患者亚群”及其语法变化是指患者子集，其特征为具有一个或多个使该患者子集与其所属的更宽泛的疾病种类中的其他子集区分的明显不同的可测量和/或可鉴别的特征。这些特征包括疾病亚类、性别、生活方式、健康史、涉及的器官/组织、治疗史等。在一个实施方案中，患者亚群的特征在于遗传特征(genetic signatures),包括在特定核苷酸位置和/或区域的遗传变异(如SNPs)。
[0122]“对照受试者”是指没有被诊断为患有AD并且不患有任何与AD相关的迹象或症状的健康的受试者。
[0123]用于本文时，术语“样品”是指从目的受试者是获得的或来源于其的组合物，其包含要被表征和/或鉴定(例如，基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征)的细胞实体和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变化是指从目的受试者获得的任意样品，预测或已知该样品包含待表征的细胞实体和/或分子实体。
[0124]“组织或细胞样品”意指从受试者或患者的组织获得的类似的细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或组织活检或抽出物；血液或任意血液成分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液；来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代的或培养的细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品由疾病组织/器官获得。组织样品可以包含不与天然组织自然混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。“参比样品”、“参比细胞”、“参比组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”用在本文中是指从已知或相信不患有要用本发明的方法或组合物来鉴定的疾病或病况的来源获得的样品、细胞或组织。在一个实施方案中，参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是从用本发明的组合物或方法鉴定疾病或病况的同一受试者或患者的身体的健康部分获得的。在一个实施方案中，参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是从不是用本发明的组合物或方法鉴定疾病或病况的受试者或患者的个体的身体的健康部分获得的。
[0125]为了本文的目的，组织样品的“一部分”意指单个部分或份的组织样品，例如，来自组织样品的薄组织或细胞切片。应该理解，按照本发明可以取多部分组织样品并且进行分析，条件是应该理解，本发明包括在形态和分子水平上分析，或者针对蛋白和核酸二者分析相同部分的组织样品。
[0126]“相关”或“相关的”意指以任何方式比较第一分析或流程的表现和/或结果与第二分析或流程的表现和/或结果。例如，人们可以在进行第二流程时使用第一分析或流程的结果，和/或人们可以使用第一分析或流程的结构来确定是否应该进行第二分析或流程。关于基因表达分析或流程的实施方案，人们可以使用所述基因表达分析或流程的结果来确定是否应该进行特定的治疗方案。
[0127]术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛意义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如全长或完整的单克隆抗体)，多克隆抗体，单价抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们展现`出需要的生物学活性)，并且还可以包括某些抗体片段(如本文更详细地描述)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0128]“小分子”或“有机小分子”在本文中定义为具有低于约500道尔顿的分子量的有机分子。
[0129]在本文中使用时，词语“标记”指可检测的化合物或组合物。所述标记可以自身检测(例如，放射性标记或荧光标记)，或者在酶标记的情形中，可以催化底物化合物或组合物的化学变化，这产生可检测的产物。可作为可检测的标记物的放射性核素包括,例如，1-131，1-123，1-125，Y-90，Re-188, Re-186, At-211，Cu-67, B1-212 和 Pd-109。
[0130]提及“约”,本文中的数值或参数包括(并且描述)涉及所述数值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
[0131]术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应证、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的敬生
目口 O
[0132]本发明的组合物和方法
[0133]遗传夺异
[0134]在一个方面中，本发明提供检测来自受试者的样品中存在或不存在与阿尔茨海默病(AD)相关的遗传变异的方法，以及通过检测来自受试者的样品中存在或不存在这些遗传变异的一种或多种而诊断和预测AD的方法，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。与AD危险相关的遗传变异使用包括全基因组关联研究、修饰物筛选和基于家族的筛选进行鉴定。
[0135]用于本发明的方法的遗传变异包括在白介素-6受体(IL6R)、神经营养因子4(NTF4)和UNC5C或编码这些蛋白的基因中以及表3中列出的任一种基因或其编码的蛋白中的遗传变异。在一些实施方案中，所述遗传变异是在编码基因(或其调节区)的基因组DNA中，其中所述基因选自编码白介素-6受体(IL6R)、神经营养因子4(NTF4)和UNC5C的基因，以及表3中列出的任一种基因。在不同的实施方案中，所述遗传变异是在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因以及表3中列出的任一种基因的一种或多种基因中的SNP、等位基因、单元型、插入或缺失。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在实施方案中，所述遗传变异是在选自表3中列出的那些的基因中的SNP。在实施方案中，所述遗传变异是选自rsl2733578、rs4658945、rsl478`161、rsl024591、rs7799010、rsl0969475 和 rsl2961250 的 SNP。在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是在IL6R、NTF4或UNC5C中的氨基酸置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO: I)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传变异是UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的氨基酸置换T835M。
[0136]遗传变异的检测
[0137]用在本文所述的任一种检测方法中的核酸可以是基因组DNA ;由基因DNA转录的RNA ;或由RNA产生的cDNA。核酸可以来源于脊椎动物，例如，哺乳动物。如果核酸直接从特定的来源获得或者如果其是在所述来源中存在的核酸的拷贝，则认为所述核酸“来源于”所述特定的来源。
[0138]核酸包括核酸的拷贝，例如，由扩增产生的拷贝。在某些情形中，扩增可以是理想的，例如，为了获得需要量的材料来检测变异。然后，扩增子可以进行变异检测方法，诸如下文所述的那些，以确定在所述扩增子中是否存在变异。
[0139]遗传变异可以通过本领域技术人员已知的特定方法进行检测。所述方法包括，但不限于，DNA测序；引物延伸测定，包括等位基因特异性核苷酸掺入测定和等位基因特异性引物延伸测定(例如，等位基因特异性PCR，等位基因特异性连接链反应(LCR)，和缺口-LCR);等位基因特异性寡核苷酸杂交测定(例如，寡核苷酸连接测定)；切割保护测定，其中针对切割剂的保护用于检测核酸双链体中的错配碱基；MutS蛋白结合的分析；比较变体和野生型核酸分子的迁移率的电泳分析；变性-梯度凝胶电泳(DGGE，如在，例如，Myers等(1985)Nature(自然)313:495中)；错配碱基对的RNA酶切割的分析；异源双链体DNA的化学或酶促切割的分析；质谱(如MALD1-TOF);遗传位分析(genetic bit analysis,GBA)；5'核酸酶测定(例如，TaqMan?);和利用分子信标的测定。这些方法中的某一些在下文中进一步详细讨论。
[0140]检测靶核酸中的变异可以通过使用本领域公知的技术的靶核酸的分子克隆和测序实现。备选地，可以使用扩增技术，诸如聚合酶链式反应(PCR)直接从来自肿瘤组织的基因组DNA制备物扩增靶核酸序列。然后可以确定所扩增的序列的核酸序列并且鉴定其中的变异。扩增技术是本领域中公知的，例如，在Saiki等，Science (科学)239 =487,1988 ;美国专利号4，683，203和4，683，195中所述的聚合酶链式反应。
[0141]本领域已知的连接酶链式反应也可以用来扩增靶核酸序列。例如，参见Wu等，Genomics (基因组学)4:560-569 (1989)。另外，已知为等位基因特异性PCR的技术也可以用来检测变异(例如，置换)。例如，参见Ruano和Kidd (1989) Nucleic Acids Research (核酸研究)17:8392 ；McClay 等(2002) Analytical Biochem.(分析生物化学)301:200_206。在该技术的特定实施方案中，使用等位基因特异性引物，其中所述引物的3,末端核苷酸与靶核酸中的特定变异互补(即，能够与其特异性碱基配对)。如果不存在所述特定的变异，则不会观察到扩增产物。扩增受阻突变系统(ARMS)也可以用来检测变异(例如，置换)。ARMS记述在,例如，欧洲专利申请公布号0332435中，和在Newton等,Nucleic AcidsResearch (核酸研究)，17:7,1989 中。
[0142]可用于检测变异(例如，置换)的其他方法包括，但不限于，(I)等位基因特异性核苷酸掺入测定，诸如单碱基延伸测定(例如，参见Chen等(2000)Genome Res.(基因组研究)10:549-557 ；Fan 等(2000)Genome Res.(基因组研究)10:853-860 ；Pastinen 等(1997) Genome Res.(基因组研究)7:606-614 ;和 Ye 等(2001) Hum.Mut.17:305-316) ； (2)等位基因特异性引物延伸`测定(例如，参见Ye等(2001) Hum.Mut.17 =305-316 ;和Shen等，Genetic Engineering News (基因工程新闻)，vol.23, 2003年3月15日)，包括等位基因特异性PCR;(3)5'核酸酶测定(例如，参见De La Vega等(2002) BioTechniques (生物技术)32:S48_S54(描述 TaqMan.RTM.测定)；Ranade 等(2001) Genome Res.(基因组研究)11:1262-1268 ;和 Shi (2001)Clin.Chem.(临床化学)47:164-172) ； (4)使用分子信标的测定(例如，参见Tyagi等(1998)Nature Biotech.(自然生物技术)16:49-53 ；和Mhlanga等(2001)MethodS (方法)25:463-71);以及(5)寡核苷酸连接测定(例如，参见Grossman等(1994)Nuc.Acids Res.(核酸研究)22:4527-4534 ;专利申请公布号US2003/0119004A1 ；PCT 国际公布号 W001/92579A2 ;和美国专利号 6，027，889)。
[0143]变异也可以通过错配检测方法进行检测。错配是互补性不是100%的杂交的核酸双链体。缺少全部的互补性可能是由于缺失、插入、倒位或置换导致。错配检测方法的一个实例是错配修饰检测(MRD)测定,例如,记述在Faham等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)102:14717-14722(2005)和Faham等，Hum.Mol.Genet.(人类分子遗传学)10:1657-1664(2001)中。错配切割技术的另一个实例是RNA酶保护法，其详细记述在Winter 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美国国家科学院学报)，82:7575,1985 和 Myers 等，Science (科学)230:1242,1985中。例如，本发明的方法可以包括使用标记的与人野生型靶核酸互补的RNA探针(riboprobe)。所述RNA探针与来源于组织样品的靶核酸退火(杂交)在一起，然后用RNA酶A消化，所述RNA酶A能够检测双链体RNA结构中的一些错配。如果RNA酶A检测到错配，则其在错配位点切割。因此，当退火的RNA制备物在电泳凝胶基质上分离时，如果错配已经被RNA酶A检测到并且切割，则将观察到比关于该RNA探针和mRNA或DNA的全长双链体小的RNA产物。RNA探针不需要是靶核酸的全长，而是可以是靶核酸的一部分，条件是其包含怀疑具有变异的位置。
[0144]以类似的方式，可以使用DNA探针来检测错配，例如，通过酶或化学切割进行。例如，参见 Cotton 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美国国家科学院学报),85:4397,1988 ;和Shenk等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)，72:989，1975。备选地，错配可以通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移性的改变而检测。例如，参见Car i e I 1，Human Genetics (人类遗传学)，42:726，1988。使用RNA探针或DNA探针，可以在杂交之前扩增怀疑包含变异的靶核酸。靶核酸中的变化也可以使用Southern杂交进行检测，尤其是变化是整体重排(gross rearrangements),诸如缺失和插入时。
[0145]针对靶核酸或周围标记基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针可以用来检测变异，例如，插入或缺失。插入和缺失也可以通过靶核酸的克隆、测序和扩增进行检测。单链构象多态性(SSCP)分析也可以用来检测等位基因的碱基变化变体。例如，参见Orita等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)86:2766-2770,1989，和 Genomics (基因组学)，5:874-879，1989。SSCP通过单链PCR产物的电泳迁移改变而鉴定碱基差异。单链PCR产物可以通过加热或另外使双链PCR产物变性而产生。单链核酸可以重折叠或形成部分依赖于碱基序列的二级结构。单链扩增产物的不同的电泳迁移性与SNP位置的碱基序列差异相关。变性梯度凝胶电泳(DGGE)基于不同的序列依赖性稳定性和多态性DNA固有的解链特性(melting properties)以及在变性梯度凝胶中的电泳迁移模式的相应的差异来区分SNP等位基因。
[0146]还可以使用微阵列检测遗传变异。微阵列是一种多路技术，其典型的使用成阵列系列的数以千计的核酸探针在高严格性条件下与例如cDNA或cRNA样品杂交。探针-靶标杂交典型的通过检测荧光`团_、银-或化学发光-标记的靶标来检测并且定量，从而确定靶标中核酸序列的相对丰度。在典型的微阵列中，探针通过与化学基质(通过环氧-甲硅烷、氨基-甲硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺或其他)的共价键连接到固体表面上。例如，所述固体表面为玻璃、二氧化娃芯片或微型珠。多种微阵列可商购获得，包括例如由Affymetrix, Inc.和Illumina, Inc.制造的那些。
[0147]另一种SNP基因分型的方法是基于质谱。质谱利用DNA的四种核苷酸的每一种特有的重量。SNPs可以通过质谱进行明确的基因分型，通过测量具有备用SNP等位基因的核酸质量的差别进行。MALD1-T0F(基质辅助的激光解析电离-飞行时间)质谱技术可用于分子量(诸如SNPs)的极精确的确定。基于质谱已经开放了多种SNP分析的方法。示例性的基于质谱的SNP基因分型方法包括引物延伸测定，其也可以与其他方法组合使用，所述其他方法如传统的基于凝胶的形式和微阵列。
[0148]序列特异性核酶(美国专利号5，498，531)也可以用来基于核酶切割位点的形成或丢失而对SNPs进行评分。通过核酸酶理解消化测定或通过解链温度的差异可以区分完美匹配的序列与错配序列。如果SNP影响限制性酶切位点，则可以通过限制酶消化模式的改变和通过凝胶电泳确定的核酸片段长度的相应改变而鉴定SNP。
[0149]在本发明的其他实施方案中，基于蛋白的检测技术用来检测由具有本文公开的遗传变异的基因编码的变体蛋白。确定蛋白变体形式的存在可以使用本领域已知的任何适当的技术进行，例如，电泳(例如，变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，2维凝胶电泳，毛细管电泳和等电聚焦)、色谱(例如，大小色谱，高效液相色谱(HPLC)和阳离子交换HPLC)和质谱(例如，MALD1-T0F质谱，电喷射离子化(ESI)质谱和串联质谱)。例如，参见Ahrer和 Jungabauer (2006) J.Chromatog.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sc1.841:110-122;和Wada(2002) J.Chromatog.B.781:291_301。适合的技术可以部分基于带检测的变异的性质而选择。例如，导致置换的氨基酸与原始氨基酸具有不同的电荷的氨基酸置换的变异可以通过等电聚焦进行检测。通过在高电压下具有PH梯度的凝胶进行的多肽等电聚焦通过其Pl分离蛋白。PH梯度凝胶可以与同时运行包含野生型蛋白的凝胶进行比较。在变异导致新的蛋白水解位点产生或消除已有的蛋白水解位点的情形中，样品可以进行蛋白水解消化，然后使用适当的电泳、色谱或质谱技术进行肽图谱绘图。变异的存在也可以使用蛋白测序技术诸如Edman降解或特定形式的质谱进行检测。
[0150]也可以使用本领域已知的使用这些技术的组合的方法。例如，在HPLC-显微镜检串联质谱技术中，对蛋白进行蛋白水解消化，并且通过反相色谱分离来分离产生的肽混合物。然后进行串联质谱，并且分析由此收集的数据(Gatlin等(2000)Anal.Chem.，72:757-763)。在另一个实例中，非变性凝胶电泳与MALDI质谱组合(Mathew等(2011)Anal.Biochem.416:135-137)。
[0151]在一些实施方案中，蛋白可以使用诸如与所述蛋白特异性结合的抗体或肽的试剂从样品中分离，然后进一步分析，从而使用上文公开的任一种技术来确定存在或不存在遗传变异。
[0152]备选地，变体蛋白在样品中的存在可以通过基于对具有本发明所述的遗传变异特异性的抗体的免疫亲和测定进行检测，即，所述抗体特异性结合具有所述变异的蛋白，但不结合缺少所述变异的蛋白`形式。所述抗体可以通过本领域已知的的任意技术产生。抗体可以用来从溶液样品中免疫沉淀特定的蛋白，或者免疫印迹通过例如聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白。免疫细胞化学方法也可以用于检测组织或细胞中特定的蛋白变体。也可以使用其他公知的基于抗体的技术，包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括使用单克隆或多克隆抗体的夹心测定。例如，参见美国专利号4，376，110和4，486，530。
[0153]鉴定另外的遗传标记
[0154]公开的遗传标记可用于鉴定与AD的发生相关的另外的遗传标记。例如，本文公开的SNPs可以用来鉴定连锁不平衡中的另外的SNPs。实际上，与AD相关的第一 SNP处于连锁不平衡中的任意SNP应该与AD相关。一旦证明了给定的SNP与AD之间的相关性，为了增加在该特定区域内的SNPs的密度，发现与AD相关的另外的SNPs是非常令人感兴趣的。
[0155]用于鉴定另外的SNPs并且进行连锁不平衡分析的方法在本领域中是公知的。例如，鉴定与本文公开的SNPs处于连锁不平衡中的另外的SNPs可以包括下述步骤:(a)由来自多个个体的包含第一 SNP或在第一 SNP周围的基因组区域扩增片段；(b)在携带所述第一SNP或在所述第一 SNP周围的基因组区域中鉴定第二 SNPs ； (c)进行所述第一 SNP与第
二SNPs之间的连锁不平衡分析；并且(d)选择所述第二 SNPs作为处于与所述第一标记的连锁不平衡中。
[0156]用于组合使用的另外的诊断方法
[0157]公开的遗传标记的检测可以与用于鉴定受试者患有AD或由增加的发生AD的危险的受试者的一种或多种另外的诊断方法组合使用。例如，除了本文公开的遗传标记之外，可以针对另外的遗传标记对受试者进行筛选。可以分析来自受试者的脑脊液的AD特有的增加水平的β淀粉状蛋白或tau蛋白。受试者还可以进行精神状态检查，诸如小型精神状态检查(Mini Mental State Exam,MMSE),以评估记忆、集中以及其他认证能力。受试者还可以进行成像程序，诸如CT扫描、MR1、SPECT扫描或PET扫描，以鉴定指示阿尔茨海默病的脑结构或大小的变化。
[0158]阿尔茨海默病的诊断、预后和治疗
[0159]本发明提供通过检测来自受试者的样品中存在一种或多种本发明公开的与AD相关的遗传变异而用于诊断或预后受试者中的AD的方法。在本发明的实施方案中，所述一种或多种遗传变异是在选自编码白介素-6受体(IL6R)、神经营养因子4(NTF4)和UNC5C的基因以及表3中列出的任一种基因的基因中。在一些实施方案中，所述遗传变异是在编码基因(或其调节区)的基因组DNA中，其中所述基因选自编码白介素-6受体(IL6R)、神经营养因子4(NTF4)和UNC5C的基因，以及表3中列出的任一种基因。在不同的实施方案中，所述遗传变异是在选自编码白介素-6受体(IL6R)、神经营养因子4(NTF4)和UNC5C的基因以及表3中列出的任一种基因的一种或多种基因中的SNP、等位基因、单元型、插入或缺失。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的‘C，等位基因。在一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在一个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。在一个实施方案中，所述`遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在实施方案中，所述遗传变异是在选自表3中列出的那些的基因中的SNP。在实施方案中，所述遗传变异是选自 rsl2733578、rs4658945、rsl478161、rsl024591、rs7799010、rsl0969475和rsl2961250的SNP。这些遗传变异中的任一种或多种可以用在下文所述的任一种检测、诊断和预后方法中。
[0160]在一个实施方案中，本发明提供用于检测受试者中存在或不存在指示阿尔茨海默病(AD)的遗传变异的方法，所述方法包括:(a)使来自所述受试者的样品与能够检测选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因中存在或不存在遗传变异的试剂接触；并且(b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0161]用于所述方法的试剂可以是寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核酶。在一些实施方案中，所述试剂被标记。标记可以包括，例如，放射性同位素标记、荧光标记、生物发光标记或酶标记。可以作为可检测标记的放射性核素包括，例如，1-131，1-123，1-125，Y-90，Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, B1-212 和 Pd-109。
[0162]本发明还提供用于检测受试者中指示阿尔茨海默病(AD)的遗传变异的方法，所述方法包括:确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。在所述方法的不同的实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异的存在通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。
[0163]本发明还提供用于诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括:(a)使来自所述受试者的样品与能够检测选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因中存在或不存在遗传变异的试剂接触；并且(b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0164]本发明还提供诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括:确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0165]本发明还提供诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括:(a)从所述受试者获得包含核酸的样品，并且(b)分析所述样品以检测存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因中的至少一种遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0166]在一些实施方案中，所述诊断或预测方法还包括使所述受试者进行一种或多种另外的AD诊断测试，例如，筛选一个或多个另外的遗传标记，实施精准状态检查或使所述受试者进行成像程序。在一些实施方案中，所述方法还包括分析所述样品以检测作为APOE修饰物的至少一种另外的遗传标记的存在，其中所述至少一种另外的遗传标记是在选自编码IL6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的基因的基因中。
[0167]还考虑上述任`一种方法可以进一步包括基于所述方法的结果治疗所述受试者的AD。在一些实施方案中，上述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE- ε 4等位基因的存在。在一个实施方案中，与具有至少一种APOE- ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0168]还提供鉴定具有在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险的受试者的方法，所述方法包括:(a)确定来自所述受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因中的遗传变异；并且(b)确定至少一种APOE- ε 4等位基因的存在或不存在，其中与不存在所述遗传变异和至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者相比，所述遗传变异和至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示所述受试者具有在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0169]还提供一种辅助预测受试者中AD的亚型的预后的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的生物样品中存在编码IL6R、NTF4或UNC5C的基因中的遗传变异。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP，并且所述AD的亚型至少部分特征在于，在来自所述受试者的生物样品中与一个或多个对照受试者相比增加的可溶性IL6R水平。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP，并且所述AD的亚型至少部分特征在于，在来自所述受试者的生物样品中与一个或多个对照受试者相比减少的TrkB活化。在另一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，并且所述AD的亚型至少部分特征在于，与一个或多个对照受试者相比，在来自所述受试者的生物样品中增加的UNC5C细胞凋亡活性。
[0170]本发明还提供一种预测受试者对靶向IL6R的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向IL6R的治疗剂的应答。在一个实施方案中，所述治疗剂是IL6R拮抗剂或结合剂，例如，抗-1L6R抗体。
[0171]本发明还提供一种预测受试者对靶向TrkB的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向TrkB的治疗剂的应答。在一个实施方案中，所述治疗剂是TrkB激动剂，例如，TrkB激动性抗体。
[0172]本发明还提供一种预测受试者对靶向UNC5C的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向UNC5C的治疗剂的应答。在一个实施方案中，所述治疗剂靶向UNC5C死亡结构域。
[0173]用于上文所述的任一种方法中的生物样品可以使用本领域技术人员已知的特定方法获得。生物样品可以从脊椎动物获得，并且特别地，从哺乳动物获得。在特定的实施方案中，生物样品包括细胞或组织，诸如脑脊液、神经细胞或脑组织。靶核酸(或编码的多肽)中的变异可以从组织样品或从其他机体样品(诸如脑脊液、血液、血清、尿液、痰、唾液、黏膜刮片、泪分泌物或汗水)中检测。通过筛查所述机体样品，可以对于诸如AD的疾病获得简单的早期诊断。另外，通过检测所述机体样品在靶核酸(或编码的多肽)中的变异可以更容易地监测治疗的进展。在一些实施方案中，所述生物样品从怀疑患有AD的个体获得。`[0174]在确定受试者或从所述受试者获得的生物样品包含本文公开的遗传变异后，考虑可以对所述受试者给药有效量的适当的AD治疗剂以治疗所述受试者中的AD。
[0175]还提供辅助诊断哺乳动物中的AD的方法，所述方法通过按照上述方法检测核酸中的一种或多种变异而进行，所述变异包括在如本文公开的编码IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的遗传变异。
[0176]在另一个实施方案中，提供预测患有AD的受试者是否应答治疗剂的方法，所述方法通过按照上述方法确定所述受试者是否包含在编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的一种或多种中的变异而进行。
[0177]还提供评估受试者发生AD的素质(predisposition)的方法,所述方法通过检测在所述受试者中存在或不存在在编码如公开公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的一种或多种中的变异而进行。
[0178]还提供进一步分类(sub-classifying)哺乳动物中的AD的方法,所述方法包括检测在编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的遗传变异的存在。
[0179]还提供鉴定有效治疗患者亚群中的AD的治疗试剂的方法，所述方法包括使所述试剂的功效与在对应于编码如本文公开的IL6R，NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的SNP的核苷酸位置处的遗传变异的存在相关。
[0180]另外的方法提供可用于确定适当的临床干预步骤的信息(如果并且适当的)。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于本文公开的与AD相关的基因中存在或不存在变异的评估结果的临床干预步骤。例如，适当的干预可以包括预防和治疗步骤，或基于通过本发明的方法获得的遗传信息调整任意当前(then-current)的预防或治疗步骤。
[0181]本领域技术人员应该明白，在本文所述的任意方法中，尽管检测变异的存在将明确指示疾病的特征(例如，疾病的存在或亚型)，但是未检测到变异也将通过提供疾病的相互特征(reciprocal characterization)而提供有用的信息。
[0182]其他方法还包括治疗哺乳动物中的AD的方法，所述方法包括下述步骤:从所述哺乳动物获得生物样品，检查所述生物样品存在或不存在本文公开的变异，并且当确定在所述组织或细胞样品中存在或不存在所述变异时，对所述哺乳动物给药有效量的适当的治疗剂。任选地，所述方法包括给所述哺乳动物给药有效量的祀向的AD治疗剂。
[0183]还提供治疗受试者中的AD的方法，已知在所述受试者中在对应于编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的SNP的核苷酸位置处存在遗传变异，所述方法包括给所述受试者给药有效治疗所述病况的治疗剂。
[0184]还提供治疗患有AD的受试者的方法,所述方法包括给所述受试者给药已知有效治疗在对应于编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的SNP的核苷酸位置处具有遗传变异的受试者中的病况的治疗剂。
[0185]还提供治疗患有AD的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者给药之前在至少一个临床研究中表现为对治疗所述病况有效的治疗试剂，在所述研究中，所述试剂施用给至少五名人受试者`，所述人受试者每一名在对应于编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的SNP的核苷酸位置处具有遗传变异。在一个实施方案中，所述至少五名受试者对于至少五名受试者的组总共具有两种以上不同的SNPs。在一个实施方案中，所述至少五名受试者对于所述至少五名受试者的全组具有相同的SNP。
[0186]还提供治疗属于特定AD患者亚群的AD受试者的方法，所述方法包括给所述受试者给药有效量的核准作为用于所述亚群的治疗剂的治疗剂，其中所述亚群至少部分特征在于与在对应于编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的SNP的核苷酸位置处的遗传变异的关联性。
[0187]在一个实施方案中，所述亚群是欧洲血统。在一个实施方案中，本发明提供一种方法，所述方法包括制备AD治疗试剂，并且包装所述试剂与对受试者给药所述试剂的使用说明，所述受试者患有或相信患有AD并且在对应于编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种或多种中的SNP的位置处具有遗传变异。
[0188]还提供选择患有AD的患者使用AD治疗剂治疗的方法,所述方法包括检测在对应于编码如本文公开的IL6R、NTF4或UNC5C的基因或表3中列出的基因中的任一种中的SNP的核苷酸位置处遗传变异的存在。
[0189]用于治疗AD的治疗剂可以掺加到组合物中，在一些实施方案中，所述组合物适于药用。所述组合物典型地包含肽或多肽和可接受的载体，例如，药用的载体。“药用载体”包括任意的和所有与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(Gennaro,Remington:The science and practiceOf pharmacy (雷明顿:制药科学和实践).Lippincott, Wi 11 iams&ffi lkins, Philadelphia, Pa.(2000))。此类载体或稀释剂的实例包括，但不限于，水、盐水、Finger' s溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性赋形剂，如不挥发性油。除了当常规的介质或试剂与活性化合物不相容时，考虑使用这些组合物。补充的活性化合物也可以掺入到所述组合物中。
[0190]本发明的治疗剂(和任意另外的治疗剂用于治疗AD的治疗剂)可以通过任何合适的途径给药，包括肠胃外、肺内、鞘内和鼻内给药，并且，如果需要局部治疗，进行病灶内给药。肠胃外输注包括，例如，肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。部分根据用药是短期还是长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
[0191]本发明的某些实施方案提供穿过血脑屏障的AD治疗剂。存在数种已知方法用于穿过血脑屏障运输分子，所述方法包括但不限于，物理方法，基于脂质的方法，以及基于受体和通道的方法。
[0192]运输AD治疗剂穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于，完全绕开血脑屏障，或通过在血脑屏障中生成开口。绕行法包括但不限于，向脑中直接注射(见例如，Papanastassiou 等，Gene Therapy (基因治疗)9:398-406 (2002))和将递送装置植入脑中(见例如，Gill 等，Nature Med.(自然医学)9:589-595(2003);和 Gliadel Wafers?,Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于,超声(见例如，美国专利公布号2002/0038086)，渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt，Ε.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation(血脑屏障及其操作的意义)，卷 1&2, Plenum Press, N.Y.(1989))),通过例如缓激肽或渗透剂(permeabiIizer)A-7的渗透化(见例如，美国专利号5，112，596，5，268，164，5，506，206和5，686，416)，以及`用包含编码抗体或其片段的基因的载体转染横跨血脑屏障的神经元(见例如，美国专利公布号 2003/0083299)。
[0193]基于脂质的运输AD治疗剂穿过血脑屏障的方法包括但不限于，将AD治疗剂包封在脂质体中，所述脂质体与抗体结合片段结合，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(见例如，美国专利申请公布号20020025313)，以及将AD治疗剂包被在低密度脂蛋白颗粒(见例如，美国专利申请公布号20040204354)或载脂蛋白E (见例如，美国专利申请公布号20040131692)中。
[0194]基于受体的运输AD治疗剂穿过血脑屏障的方法包括但不限于，将所述AD治疗剂与识别在血脑屏障上表达的受体的配体缀合，导致在受体-介导的胞转作用后其被携带穿过血脑屏障(Gabathuler (2010) Neurobiology of Disease (疾病的神经生物学)37 ;48-57)。这些配体包括但不限于,针对脑毛细管内皮受体的配体,如针对转铁蛋白受体或针对胰岛素受体的单克隆抗体，组蛋白，生物素，叶酸，尼克酸，泛酸或糖肽。
[0195]给药AD治疗剂的有效剂量和时间方案可以凭经验确定，并且做出这样的决定是在本领域技术人员技能之内的。可以使用单次剂量或多次剂量。当使用体内给药AD治疗剂时，取决于给药途径，正常的剂量的量可以为每天约10ng/kg至多至100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约lg/kg/天至10mg/kg/天。文献中提供了关于特定的剂量和递送方法的指导;例如，参见美国专利号4，657，760 ;5，206，344 ;或5，225，212。
[0196]考虑另外的治疗法可以用在所述方法中。一种或多种其他治疗法可以包括但不限于，给药另外的AD治疗剂，诸如胆碱酯酶抑制剂、美金刚、抗激动药、抗抑郁药、抗焦虑药或靶向淀粉状蛋白前体蛋白、β淀粉状蛋白、淀粉状蛋白斑或切割淀粉状蛋白前体蛋白的任一种酶(包括但不限于α-分泌酶、β-分泌酶和Y-分泌酶等)的化合物。
[0197]试剂盒
[0198]为了用于本文所述或提示的应用，还提供试剂盒或制品。所述试剂盒可以包含载体工具(carrier means),所述载体工具被分区以严密容纳一个或多个容器工具,诸如小瓶、管等，每一个容器工具包含要用于方法中的一种独立的成分。例如，一个容器工具可以包含被可检测标记的或能够被可检测标记的探针。所述探针可以是对包含如本文公开的与AD相关的遗传变异的多核苷酸特异性的多核苷酸。当试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，所述试剂和还可以具有包含用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或包含报道子工具的容器，所述报道子工具诸如生物素结合蛋白，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，其与报道子分子(如酶、荧光或放射性同位素标记)结合。
[0199]在其他实施方案中，所述试剂盒包含能够检测包含如本文公开的与AD相关的遗传变异的多肽的标记的试剂。所述试剂可以是与所述多肽结合的抗体。所述试剂可以是与所述多肽结合的肽。所述试剂盒可以包含，例如，第一抗体(例如，连接在固体支持物上)，其与包含如本文公开的遗传变异的多肽结合；和，任选地，第二不同的抗体，其结合所述多肽或第一抗体并且与可检测的标记缀合。
[0200]试剂盒典型地包含上述容器以及包含在商业和使用者立场上合乎需要的材料的一个或多个其他容器，所述材料包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和具有使用说明的包装说明书。在所述容器上可`以存在标签，以指示所述组合物用于特定的治疗或非治疗应用，并且还可以指示关于体内或体外应用的指导，诸如上文所述的那些。试剂盒中其他可选的成分包括一种或多种缓冲剂(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂如被酶标记化学改变的底物(例如，生色团)、表位恢复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。
[0201]销售方法
[0202]本发明此处还包括用于销售所公开的AD诊断或预后方法的方法，所述方法包括向目标观众广告宣传、教授和/或详细说明所公开的方法的应用。
[0203]销售通常通过非人媒介进行交流，其中主办者是确定的并且信息是控制的。为了本文目的的销售包括公开、公众关系、植入式广告、赞助、承销等。该术语还包括在任一种印刷媒体上出现的赞助信息公告。
[0204]本文的诊断方法的销售可以通过任意方式实现。用于传递这些信息的销售媒介的实例包括电视、无线广播、电影、杂志、报纸、网络和广告牌，包括商业广告，其实在广播媒体中出现的信息。
[0205]所用的销售类型将取决于多种因素，例如，要到达的目标观众的性质，例如，医院、保险公司、临床医生、医生、护士和患者，以及成本考虑和管控药物和诊断剂销售的相关管辖法律和管理条例。销售可以基于由服务交互和/或诸如使用者人口统计和地理位置的其他数据限定的使用者特征进行个人化或定制。
[0206]以下是本发明的方法和组合物的实例。应该理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例
[0207]实施例1:ΑΡ0Ε修饰物筛诜
[0208]设计研究来鉴定改变APOE对阿尔茨海默病(AD)发生的作用的变体。研究设计显示在图1中。将从年龄在65岁以下并且患有AD的受试者(“病例”)分离的DNA(因此可能富含危险的等位基因)与从年龄为75岁或80岁以上不患有AD并且通过神经性检验具有正常认知的受试者(“超级对照”)分离的DNA(因此可能富含保护性等位基因)进行比较。所有的受试者对于APOE E4等位基因是纯合的(E4/E4)或杂合的(E3/E4)，欧洲血统的美国居民，并且获自国家阿尔茨海默病细胞资源库(National Cell Repository of Alzheimer’sDisease, NCRAD)。如表1所示，对于团体I的病例包括总共31例不相关的E4/E4纯合子和50例在年龄大于55岁且小于65岁发生痴呆的E3/E4阿尔茨海默病例。对于大约三分之一的病例，通过尸体解剖证实AD的诊断。团体I的超级对照包括19例年龄在80岁以上的E3/E4杂合子和50例年龄在75岁以上的E4/E4纯合子。对照都具有等于O的临床痴呆评定(CDR)等级，这表明在最后的随访没有认知损伤迹象。通过全基因组测序(对于杂合子)或通过外显子组测序(对于纯合子)验证样品的APOE等位基因。
[0209]表1
[0210]
【权利要求】
1.用于检测受试者中存在或不存在指示阿尔茨海默病(AD)的遗传变异的方法，所述方法包括: (a)使来自所述受试者的样品与能够检测基因或其基因产物中存在或不存在遗传变异的试剂接触，所述基因选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因；并且 (b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。
3.权利要求2的方法，其中所述遗传变异是SNP。
4.权利要求3的方法，其中所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。
5.权利要求4的方法，其中所述遗 传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。
6.权利要求3的方法，其中所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。
7.权利要求6的方法，其中所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。
8.权利要求3的方法，其中所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。
9.权利要求8的方法，其中所述遗传变异是在UNC5C(SEQID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
10.权利要求1的方法，其中所述试剂选自寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核酶。
11.权利要求10的方法，其中所述试剂是被标记的。
12.权利要求1的方法，其中所述至少一种遗传变异是在选自IL6R、NTF4和UNC5C的蛋白中的氨基酸置换、插入或缺失。
13.权利要求12的方法，其中所述至少一种遗传变异是选自下述的氨基酸置换:IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的D358A、NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的R206W和UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的T835M。
14.权利要求12的方法，其中所述试剂是与包含所述遗传变异的蛋白特异性结合的抗体。
15.权利要求1的方法，其中所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
16.权利要求1的方法，所述方法还包括基于步骤(b)的结果治疗所述受试者的AD。
17.权利要求1的方法，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE-ε 4等位基因的存在。
18.权利要求17的方法，其中与具有至少一种APOE-ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
19.用于检测指示受试者中的阿尔茨海默病(AD)的遗传变异的方法，所述方法包括: 确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
20.权利要求19的方法，其中所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。
21.权利要求20的方法，其中所述遗传变异是SNP。
22.权利要求21的方法，其中所述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列(SEQID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。
23.权利要求22的方法，其中所述遗传变异是在rs2228145的‘C’等位基因。
24.权利要求21的方法，其中所述遗传变异是在NTF4的氨基酸序列(SEQID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。
25.权利要求24的方法，其中所述遗传变异是在rsl21918427的‘T’等位基因。
26.权利要求21的方法，其中所述遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列(SEQID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。
27.权利要求26的方法，其中所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
28.权利要求19的方法，其中所述一种或多种遗传变异的存在通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。
29.权利要求25的方法，其中在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。
30.权利要求19的方法，其中所述至少一种遗传变异是在选自IL6R、NTF4和UNC5C的蛋白中的氨基酸置换、插入或缺失。
31.权利要求30的方法，其中所述至少一种遗传变异是选自下述的氨基酸置换:IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的D358A、NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的R206W和UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的T835M。
32.权利要求19的方法，其中所述一种或多种遗传变异的存在通过选自下述的方法进行:电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们的组合。
33.权利要求25的方法,其中在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前,来自所述样品的蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
34.权利要求19的方法，其中所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
35.权利要求19的方法，所述方法还包括基于所述一种或多种遗传变异的存在治疗所述受试者的AD。
36.权利要求19的方法，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE-ε 4等位基因的存在。
37.权利要求36的方法，其中与具有至少一种APOE-ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
38.用于诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括:(a)使来 自所述受试者的样品与能够检测基因或其基因产物中存在或不存在遗传变异的试剂接触，所述基因选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因；并且 (b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
39.权利要求38的方法，其中所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。
40.权利要求39的方法，其中所述遗传变异是SNP。
41.权利要求40的方法，其中所述遗传变异选自由下述组成的组:在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP和在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换 T835M 的 SNP。
42.权利要求34的方法，其中所述遗传变异选自在rs2228145的‘C’等位基因、在rsl21918427的‘T’等位基因和在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
43.权利要求38的方法，其中所述试剂选自寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核酶。
44.权利要求43的方法，其中所述试剂是被标记的。
45.权利要求38的方法，其中所述至少一种遗传变异是在选自IL6R、NTF4和UNC5C的蛋白中的氨基酸置换、插入或缺失。
46.权利要求45的方法,其中所述至少一种遗传变异是选自下述的氨基酸置换:IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的D358A、NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的R206W和UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的T835M。
47.权利要求45的方法，其中所述试剂是与包含所述遗传变异的蛋白特异性结合的抗体。
48.权利要求38的方法，其中所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
49.权利要求38的方法，所述方法还包括基于步骤(b)的结果治疗所述受试者的AD。
50.权利要求38的方法，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE-ε 4等位基因的存在。
51.权利要求50的方法，其中与具有至少一种APOE-ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
52.权利要求38的方法，所述方法还包括使所述受试者进行选自由下述组成的组的一种或多种另外的AD诊断测试:筛查一种或多种另外的遗传标记、实施精神状态检查或使所述受试者进行成像步骤。
53.权利要求38的方法，所述方法还包括分析所述样品以检测作为APOE修饰物的至少一种另外的遗传标记的存在，其中所述至少一种另外的遗传标记处于选自下述的基因中:编码IL6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的基因。
54.权利要求53的方法，其中所述至少一种另外的遗传标记是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP、在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835W的SNP或表3中列出的SNP。
55.诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括: 确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
56.权利要求55的方法，其中所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)、等位基因、单元型、插入或缺失。
57.权利要求56的方法，其中所述遗传变异是SNP。
58.权利要求57的方法，其中所述遗传变异选自在IL6R的氨基酸序列(SEQID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP和在UNC5C的氨基 酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。
59.权利要求57的方法，其中所述遗传变异选自在rs2228145的‘C’等位基因、在rsl21918427的‘T’等位基因和在UNC5C(SEQ ID NO:3)中编码位置835的氨基酸的密码子中用G置换A的SNP。
60.权利要求55的方法，其中所述一种或多种遗传变异的存在通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。
61.权利要求60的方法，其中在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。
62.权利要求55的方法，其中所述至少一种遗传变异是在选自IL6R、NTF4和UNC5C的蛋白中的氨基酸置换、插入或缺失。
63.权利要求62的方法,其中所述至少一种遗传变异是选自下述的氨基酸置换:IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的D358A、NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的R206W和UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中的T835M。
64.权利要求55的方法，其中所述一种或多种遗传变异的存在通过选自下述的方法进行:电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们的组合。
65.权利要求64的方法,其中在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前,来自所述样品的蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
66.权利要求55的方法，其中所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
67.权利要求55的方法,所述方法还包括基于所述一种或多种遗传变异的存在治疗所述受试者的AD。
68.权利要求55的方法，所述方法还包括检测所述样品中至少一种APOE-ε 4等位基因的存在。
69.权利要求68的方法，其中与具有至少一种APOE-ε 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
70.权利要求55的方法，所述方法还包括使所述受试者进行选自由下述组成的组的一种或多种另外的AD诊断测试:筛查一种或多种另外的遗传标记、实施精神状态检查或使所述受试者进行成像步骤。
71.权利要求55的方法，所述方法还包括分析所述样品以检测作为APOE修饰物的至少一种另外的遗传标记的存在，其中所述至少一种另外的遗传标记处于选自下述的基因中:编码IL6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的基因。
72.权利要求71的方法，其中所述至少一种另外的遗传标记是在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP、在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835W的SNP或表3中列出的SNP。
73.鉴定具有在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险的受试者的方法，所述方法包括: 确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异， 确定存在或不存在至少一种APOE- ε 4等位基因， 其中与不存在所述遗传变异和至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者相比，所述遗传变异和至少一种APOE- ε 4等位基因的存在指示所述受试者具有在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
74.辅助预测受试者中AD的亚型的预后的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的生物样品中在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO: I)中导致氨基酸置换D358A的SNP的存在，其中所述AD的亚型至少部分特征在于，在来自所述受试者的生物样品中与一个或多个对照受试者相比增加的可溶性IL6R水平。
75.预测受试者对靶向IL6R的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向IL6R的治疗剂的应答。
76.权利要求75的方法，其中所述治疗剂是抗-1L6R抗体。
77.辅助预测受试者中AD的亚型的预后的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP的存在，其中所述AD的亚型至少部分特征在于，在来自所述受试者的生物样品中与一个或多个对照受试者相比减少的TrkB活化。
78.预测受试者对靶向TrkB的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在NTF4的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向TrkB的治疗剂的应答。
79.权利要求78的方法，其中所述治疗剂是TrkB激动剂。
80.辅助预测受试者中AD的业型的预后的方法，所述方法包括在来自所述受试者的生物样品中检测在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换Τ835Μ的SNP的存在，其中所述AD的亚型至少部分特征在于，与一个或多个对照受试者相比，在来自所述受试者的生物样品中UNC5C增加的细胞凋亡活性。
81.预测受试者对靶向UNC5C的AD治疗剂的应答的方法，所述方法包括在获自所述受试者的生物样品中检测在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，其中所述SNP的存在指示对靶向UNC5C的治疗剂的应答。
82.权利要求81的方法，其中所述治疗剂靶向UNC5C死亡结构域。
83.诊断或预测受试者中的阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括: (a)使来自所述受试者的样品与能够检测存在或不存在一种或多种SNPs的试剂接触，所述SNPs选自由下述组成的组:在IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列中导致氨基酸置换R206W的SNP和在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，并且 (b)分析所述样品以检测所述一种或多种SNPs的存在，其中在所述样品中存在所述一种或多种SNPs指示所述受试者患有或有危险发生AD。
84.权利要求85的方法，所述方法还包括检测选自表3中列出的SNPs的一种或多种SNPs。
85.用于实施权利要求83的方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种寡核苷酸检测试剂，其中所述寡核苷酸检测试剂区分所述一种或多种SNP处至少两种不同的等位基因的每一种。
86.权利要求85的试剂盒，其中所述检测通过选自由下述组成的组的方法进行:直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增、测序、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。
87.权利要求85的试剂盒，其中所述寡核苷酸检测试剂固定在基底上。
88.权利要求87的试剂盒，其中所述寡核苷酸检测试剂排列在阵列上。
89.诊断或预测受试者中的阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括: (a)使来自所述受试者的样品与能够检测存在或不存在一种或多种氨基酸置换的试剂接触，所述氨基酸置换选自由下述组成的组:IL6R的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸置换D358A、NTF4的氨基酸序列中的氨基酸置换R206W和UNC5C的氨基酸序列(SEQ IDNO:3)中的氨基酸置换T835M，并且 (b)分析所述样品以检测所述一种或多种氨基酸置换的存在，其中在所述样品中存在所述一种或多种氨基酸置换指示所述受试者患有或有危险发生AD。
90.用于实施权利要求89的方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种抗体检测试剂，其中所述抗体检测试剂区分所述一种或多种氨基酸置换处至少两种不同的氨基酸的每一种。
91.用于治疗AD的治疗剂，其中所述治疗剂是由选自IL6R、NTF4和UNC5C的基因编码的蛋白之一或组合。
92.用于诊断或预测AD的分子探针组合，所述组合包含至少两种能够直接或间接检测至少两种标记的探针，所述至少两种标记选自包括下述的组:在IL6R的氨基酸序列(SEQID NO:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列中导致氨基酸置换R206W的SNP和在UNC5C的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP，其中所述分子探针不与多于1000个元件的微阵列缔合。
93.权利要求92的分子探针组合，所述组合还包含一种或多种能够直接或间接检测选自表3中列出的SNPs的至少两种标记的探针。
94.在具有至少一种APOE-ε 4等位基因的受试者中筛选对AD的发生具有有害或有益作用的遗传变异的方法，所述方法包括，与年龄在75岁以上、无AD并且具有至少一种APOE- ε 4等位基因的对照受试者相比，在年龄在65岁以下、患有AD并且具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中鉴定以增加或减小的频率存在的遗传变异，其中，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中增加的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有害作用相关，并且，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中减小的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有益作用相关。
95.权利要求94的方法，其中使用全基因组关联扫描鉴定所述遗传变异。
96.权利要求94的方法，其中所述有害作用是增加的发生AD的危险或AD在较低年龄发病。
97.权利要求94的方法，其中所述有益作用是减少的发生AD的危险或AD在较晚年龄发病。
98.筛选在具有至少一种APOE-ε 4等位基因的受试者中对AD的发生具有有害或有益作用的遗传变异的方法，所述方法包括: (a)确定在多名年龄在65岁以下、患有AD并且具有至少一种APOE-ε 4等位基因的受试者的一个或多个基因座的基因型； (b)确定在多名年龄在75岁以上、无AD并且具有至少一种APOE-ε 4等位基因的对照受试者的一个或多个基因座的基因型；并且 (c)在患有AD的受试者中鉴定与对照受试者相比以增加的或减小的频率存在的遗传变异，其中，与对 照受试者相比，在患有AD的受试者中增加的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE-ε 4等位基因的受试者中的有害作用相关，并且，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中减小的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- ε 4等位基因的受试者中的有益作用相关。
【文档编号】C12Q1/68GK103930568SQ201280055180
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月10日
【发明者】蒂莫西·W·贝伦斯, 罗伯特·R·格雷厄姆, 图沙尔·班加莱 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司