用于治疗巨细胞病毒的组合物和方法

用于治疗巨细胞病毒的组合物和方法
【专利摘要】本公开提供了可用于治疗HCMV感染的组合物和方法。如本文所述，所述组合物和方法基于开发包含病毒样颗粒(VLP)的免疫原性组合物，所述病毒样颗粒包含一个或更多个莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)核心蛋白并且包含一个或更多个HCMV表位，例如来自HCMV的包膜糖蛋白gB和/或gH和/或被膜蛋白pp65。除了其他方面以外，本发明涵盖了可导致有益免疫应答的抗原(例如，包膜糖蛋白和结构蛋白)之组合的识别，所述免疫应答包括例如体液应答(例如中和抗体的产生)和细胞应答(例如T细胞活化)二者。
【专利说明】用于治疗巨细胞病毒的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2011年11月11日提交的美国临时申请号61/558, 800和于2012 年6月1日提交的美国临时申请号61/654, 157的优先权，二者的内容通过引用整体并入本 文。

【背景技术】
[0003] 人巨细胞病毒（HCMV) ( 0-疱疹病毒）是一种无所不在的病原体。在免疫正常的 人中HCMV感染通常被忽视，其具有最温和的且非特异性的症状。相比之下，某些高危人群， 例如在免疫抑制患者（例如AIDS患者或移植受者）中，以及产前感染后，HCMV感染具有 严重的表现（StarasSA等，2006ClinInfectDis43(9):1143-51;HebartH等，2004Hum 1臟11]1〇165(5):432-6;1?〇￥811&111六1'等，20051'四118卩1&1^&1:;[01179(4):381-6)。现有的治疗 方法包括使用免疫球蛋白和抗病毒制剂（例如更昔洛韦及其衍生物），其在高危人群中预 防性使用或在非常早期的感染过程中使用时是最有效的。然而，现有疗法的特征为显著的 毒性和有限的疗效，尤其是对晚发性疾病（BoeckhM.，2004PediatrTransplants(增刊5): 19-27;LimayeAP.，2004Transplantation78 (9) : 1390-6)，而且他们对先天性HCMV疾病尚 无影响。开发有效的疫苗来防止HCMV疾病被认为是重要的公共卫生优先事项（ArvinAM 等，2004ClinInfectDis39(2) :233-9)。
[0004] 发明概述
[0005] 除了其他方面以外，本发明提供了可用于预防、治疗和/或研究人巨细胞病毒 (HCMV)感染的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供了病毒样颗粒（virus-like particles，VLP)，其包含一个或更多个莫洛尼鼠白血病病毒（MoloneyMurineleukemia virus，MMLV)核心蛋白并且包含一个或更多个HCMV表位，例如来自HCMV的包膜糖蛋白gB 和/或gH和/或被膜蛋白pp65。除了其他方面以外，本发明涵盖了抗原（例如，包膜糖蛋 白和结构蛋白）之组合可导致有益的免疫应答之诱导改善，所述免疫应答包括例如体液应 答（例如中和抗体的产生）和细胞应答（例如T细胞活化）二者。可提供的VLP特征在于 他们不含有病毒DNA并且无感染性。
[0006] 在一些实施方案中，提供的VLP被脂质膜包围，任选地含有来自病毒包膜糖蛋白 (例如gB和/或gH)的一个或更多个表位，其是在病毒中和抗体的诱导中发挥作用的抗原。
[0007] 在一些实施方案中，提供的VLP含有来自病毒结构蛋白（例如pp65)的一个或更 多个表位，其是在诱导细胞免疫应答（例如T细胞应答）中发挥作用的抗原。在一些实施 方案中，利用的病毒结构蛋白（例如PP65)不仅刺激T辅助细胞的形成还诱导抗HCMV的细 胞毒性T淋巴细胞（CTL)。
[0008] 在一些实施方案中，本发明提供了病毒包膜糖蛋白（例如gB和/或gH)的变体。 在一些实施方案中，变体病毒包膜糖蛋白为融合蛋白或包含融合蛋白。在一些实施方案中， 病毒糖蛋白的变体包含异源蛋白结构域（例如，来自不同蛋白的跨膜和/或胞质结构域）。 在一些实施方案中，病毒结构蛋白的变体包含异源抗原或表位。在一些实施方案中，本发明 提供了包含病毒结构蛋白之变体的VLP。在一些实施方案中，病毒结构蛋白的变体为融合蛋 白或包含融合蛋白。
[0009] 本申请中所用的术语"约"和"大约"等同使用。在本申请中使用的带有或不带有 约/大约的任意数值意味着涵盖被相关领域的普通技术人员理解的任何正常波动。
[0010] 本发明的其他特性、目的和益处在以下的详细描述中将变得明显。然而，应当理 解，尽管所述详细描述显示了本发明的实施方案，其仅通过举例说明的方式给出而非限制。 从该详细描述，本发明范围内的多种改变和修饰对本领域技术人员将变得显而易见。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 附图仅用于举例说明目的而非限制。
[0012] 图1示出DNA表达质粒图谱⑷和示例性重组表达质粒的构建（B)。
[0013] 图2示出HEK293包装细胞上示例性异源表面抗原的FACS分析（A)和示例性VLP 组合物中异源抗原表达的蛋白质印迹分析（B)。
[0014] 图3 (A)和（B)示出两种示例性VLP组合物的颗粒大小测定和多分散指数。
[0015]图 4 示出在用示例性gB/pp65 (A)、gH-G/pp65 (B)或gB/gH-G/pp65 (C)VLP组合物 处理之小鼠中的ELISA效价。
[0016] 图5示出用示例性VLP组合物处理的小鼠中的中和抗体活性（在人成纤维细胞中 测定）。
[0017] 图6示出用示例性VLP组合物处理的小鼠中的中和抗体活性（在人上皮细胞中测 定）。
[0018] 图7示出用示例性VLP组合物相对于重组gB蛋白处理的小鼠中的中和抗体活性 (在人成纤维细胞中测定）。
[0019] 图8示出用HEK293细胞中表达的示例性VLP组合物处理之小鼠中的抗原特异性 CTL应答，其描述为基于CFSE衰减、选通⑶3+⑶8+T细胞的CTL频率（A)或pp65-特异性CTL 增殖的频率（B)。
[0020] 图9示出用HEK293细胞中表达的示例性VLP组合物处理的兔中的抗-gB和中和 抗体效价（在人成纤维细胞中测定）。
[0021] 图10示出用HEK293细胞中表达的示例性VLP组合物处理的兔中的中和抗体效价 (在人上皮细胞中测定）。
[0022] 图11示出通过（A)切向流过滤（TFF)或⑶阴离子交换（AEX)色谱纯化的CH0 细胞中表达的示例性VLP组合物之负染电子显微镜（EM)图像。
[0023] 图12示出用在CH0细胞中表达并通过切向流过滤（TFF)和阴离子交换（AEX)色 谱纯化的示例性VLP组合物处理之兔中的中和抗体效价（在人成纤维细胞中测定）。
[0024] 图13示出用通过切向流过滤（TFF)和阴离子交换（AEX)色谱纯化的CH0细胞中 表达的示例性VLP组合物处理之兔中的中和抗体效价（在人上皮细胞中测定）。
[0025] 图14示出用在CH0细胞中表达并通过切向流过滤（TFF)和阴离子交换（AEX)色 谱纯化的示例性VLP组合物处理之兔中产生的抗体之亲和力指数。
[0026] 定义
[0027] 为了本发明变得更易于理解，下文中首先对某些术语进行定义。以下术语和其他 术语的另外定义列在整个说明书中。
[0028] 氨基酸：本文所用的术语"氨基酸"以其最广泛的含义，指可被并入多肽链的任何 化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通式结构!1#-〇〇1)〇〇-(1)011。在一些 实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成的氨基酸；在 一些实施方案中，氨基酸是d_氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是1-氨基酸。"标准氨 基酸"指任何在天然存在之肽中常规存在的20种标准1-氨基酸。"非标准氨基酸"指除了 标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。本文所用的 "合成氨基酸"涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物（例如酰胺）和/或 取代。氨基酸（包括肽中羧基和/或氨基末端氨基酸）可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保 护基团和/或用其他化学基团取代进行修饰，这可改变肽的循环半衰期且不负面影响其活 性。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一种或更多种翻译后修饰，例如与一种或更多 种化学实体（例如甲基基团、乙酸盐/酯基团、乙酰基基团、磷酸盐/酯基团、甲酰基部分、 类异戊二烯基团、硫酸盐/酯基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分 等）结合。术语"氨基酸"与"氨基酸残基"可互换使用，并且可以指游离的氨基酸和/或 肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文中，指游离氨基酸还是指肽的残基将会是显而易 见的。
[0029] 抗原：本文所使用的术语"抗原"是指包含有一种或更多种被抗体识别的表位（线 性表位、构象表位或两者）的物质。在某些实施方案中，抗原是或包含病毒或病毒多肽。在 一些实施方案中，术语"抗原"指亚单位抗原（即从完整病毒分开或分离的抗原，所述抗原 与所述完整病毒本质上相关；例如与病毒样颗粒相关的抗原）。或者或此外，在一些实施方 案中，术语"抗原"指杀死的、减毒或灭活的病毒。在某些实施方案中，抗原是"免疫原"。
[0030] 大约或约：本文所用的应用至一个或更多个目的值的术语"大约"或"约"，指类似 于所述参考值的值。在某些实施方案中，术语"大约"或"约"指落入所述参考值之任意方 向（大于或小于）的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小之内（除了这样的数字将超过可能值的 100%的情况）的一系列值。
[0031] 改善：本文所用的术语"改善"意味着预防、减少或减轻状态，或改进对象的状态。 改善包括但不需要完全恢复或完全预防疾病、病症或病状（例如HCMV感染）。术语"预防" 指延缓疾病、病症或病状的发作。当疾病、病症或病状的发作已经被延迟了预定的时间段 时，可以视为完成了预防。
[0032] 特征部分：本文所用的术语物质的"特征部分"，以最广泛的含义，是享有完整物质 的指定程度之结构同一性的一部分。在某些实施方案中，特征部分享有完整物质的至少一 个功能特征。例如，蛋白质或多肽的"特征部分"是含有氨基酸之连续延伸，或者氨基酸连 续延伸之集合的一部分，其一起构成了蛋白质或多肽的特征。在一些实施方案中，每个这种 连续延伸通常含有至少2、5、10、15、20、50或更多个氨基酸。一般而言，物质（例如蛋白质 或抗体等）的特征部分是（除以上详细说明的序列和/或结构同一性）享有相关的完整物 质之至少一个功能特征的部分。在一些实施方案中，特征部分可以为生物学活性。
[0033] 特征序列："特征序列"是指存在于多肽或核酸家族的所有成员中的序列，并且由 此可被本领域的普通技术人员用来定义家族的成员。
[0034] 胞质结构域：如本领域已知的，多肽有时具有跨膜、胞质和/或胞外结构域。一般 而言，本文所用的"胞质结构域"指具有存在于胞质中的性质的结构域。应当理解，不需要 胞质结构域中的每一个氨基酸都存在于胞质中。例如，在一些实施方案中，胞质结构域的特 征在于蛋白质的指定延伸或部分基本上位于胞质中。如本领域中公知的，可以使用多种算 法分析氨基酸或核酸序列以预测蛋白亚细胞定位（例如胞质定位）。示例性的这样的程序 包括psort(PSORT.org)、Prosite(prosite,expasy.org)等等。
[0035] 剂型：本文所用的术语"剂型"和"单位剂型"指用于待治疗之患者的治疗剂的物 理不连续单位。各个单位含有预定量的经计算活性物质以产生期望的治疗效果。然而，应 当理解，组合物的总剂量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
[0036]给药方案：本文所用的术语"给药方案"（或"治疗方案"）是单独施用至对象的通 常被时间段隔开的一组单位剂量（通常多于一个）。在一些实施方案中，给定的治疗剂具 有推荐的给药方案，其可涉及一个或更多次给药。在一些实施方案中，给药方案包括多次给 药，各次之间被相同长度的时间段相互隔开；在一些实施方案中，给药方案包括多次给药以 及将各次给药分开的至少两种不同的时间段。
[0037] 表达：如本文使用的核酸序列的"表达"指一个或更多个以下事件：⑴从DNA序 列产生RNA模板（例如通过转录）；（2)加工RNA转录物（例如通过剪切、编辑、5'帽形成 和/或3'尾形成）；（3)将RNA翻译成多肽或蛋白；和/或⑷多肽或蛋白质的翻译后修 饰。
[0038] 胞外结构域：如本领域已知的，多肽有时具有跨膜、胞质和/或胞外结构域。一般 而言，本文所用的"胞外结构域"指具有存在于细胞之外部的性质的结构域。应当理解，不 需要胞外结构域中的每个氨基酸都存在于细胞的外部。例如，在一些实施方案中，胞外结构 域的特征在于蛋白的指定延伸或部分基本上位于细胞外。如本领域中公知的，可以使用多 种算法分析氨基酸或核酸序列以预测蛋白亚细胞定位（例如细胞外定位）。示例性的这样 的程序包括psort(PS0RT.org)、Prosite(prosite,expasy.org)等等。
[0039] 融合蛋白：本文所用的术语"融合蛋白" 一般指包含至少两个片段的多肽，所述片 段各自显示出与（1)天然存在的和/或（2)代表多肽的功能结构域的肽部分具有高度的氨 基酸同一性。通常，含有至少两个这样的片段的多肽被认为是融合蛋白，如果所述两个片段 是这样的部分：（1)不包括在天然的同一肽中，和/或（2)之前在单个多肽中未相互连接， 和/或（3)已经通过人手工作用相互连接。
[0040] 基因：术语"基因"具有其本领域理解的含义。本领域的普通技术人员应当理解， 术语"基因"可以包括基因调控序列（例如启动子、增强子等）和/或内含子序列。还应当 理解，基因的定义包括涉及不编码蛋白而编码功能RNA分子（例如tRNA、RNAi-诱导剂等） 的核酸。出于澄清的目的，我们注释本说明书中使用的术语"基因"一般指编码蛋白的核酸 部分；本领域的普通技术人员将从上下文中明白，该术语可任选地涵盖调控序列。这一定义 不旨在排除将术语"基因"应用于非蛋白编码表达单位，而是为了澄清在大多数情况下，在 本文中使用的该术语指编码蛋白的核酸。
[0041] 基因产物或表达产物：本文所用的术语"基因产物"或"表达产物"一般指从基因 (加工前和/或加工后）转录的RNA或者由从该基因转录的RNA编码的多肽（修饰前或修 饰后）。
[0042] 异源：对于蛋白或多肽，本文所用的术语"异源"指非天然存在于特定有机体中的 蛋白或多肽，例如反转录病毒或VLP。在一些实施方案中，异源蛋白或多肽在特定的反转录 病毒病毒体中是非天然存在的。对于蛋白结构域，本文所用的术语"异源"一般指在特定蛋 白中非天然存在的蛋白结构域。
[0043] 免疫原性：本文所用的术语"免疫原性"意味着能够在宿主动物中针对非宿主实体 (例如HCMV抗原）产生免疫应答。在某些是实施方案中，这种免疫应答形成了通过针对特 定感染性生物（例如HCMV)的疫苗引起之保护性免疫的基础。
[0044]免疫应答：本文所用的术语"免疫应答"指在动物中引起的应答。免疫应答可以指 细胞免疫、体液免疫或者可以涉及二者。还还可免疫应答限制在免疫系统的一部分。例如， 在某些实施方案中，免疫原性组合物可以诱导IFNy应答增加。在某些实施方案中，免疫原 性组合物可以诱导黏膜IgA应答（例如，在鼻和/或直肠清洗液中测量的）。在某些实施方 案中，免疫原性组合物可以诱导全身的IgG应答（例如，在血清中测量的）。在某些实施方 案中，免疫原性组合物可以诱导病毒中和抗体或者中和抗体应答。
[0045] 改善、增加或减少：本文所用的术语"改善"、"增加"或"减少"或语法等价物，指示 相对于基线测量的值，所述基线测量例如在本文所述的处理开始之前在相同的个体中的测 量或在缺乏本文所述之处理的情况下在对照个体（或多个对照个体）中的测量。
[0046] 个体、对象、患者：本文所用的术语"对象"、"个体"或"患者"指人或非人哺乳动物 对象。在一些实施方案中，被治疗的个体（也称为"患者"或"对象"）是患有疾病（例如 HCMV感染）的个体（胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人）。在一些实施方案中，对象有HCMV 感染的风险。在一些实施方案中，所述对象是免疫抑制的对象。例如，在一些实施方案中， 免疫抑制的对象选自HIV感染的对象、AIDS患者、移植受者、儿童对象以及妊娠对象。在一 些实施方案中，所述对象已经暴露于HCMV感染。在一些实施方案中，所述对象是人。
[0047] 分离的：本文所用的术语"分离的"指如下物质和/或实体，其已经（1)从在初始 产生（无论在自然和/或在实验环境中）时与其相关联的至少一些组分分离，和/或（2)通 过人手工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以从初始与其相关的其他组分的 约 10%、约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%、约 91 %、约 92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或大于约99%分离。在一 些实施方案中，分离的药剂为约80%、约85%、约90%、约91 %、约92%、约93%、约94%、 约95 %、约96 %、约97 %、约98 %、约99 %或者大于约99 %纯的。如果物质基本上没有其 他组分，那么该物质是"纯的"。如本文所述的，分离的物质和/或实体之百分比纯度的计算 不应当包括赋形剂（例如，缓冲液、溶剂、水等）。
[0048]接头：本文所用的术语"接头"指（例如在融合蛋白中）非在天然蛋白的特定位置 出现的适当长度的氨基酸序列，并且一般被设计为柔性和/或插入结构（例如两个蛋白部 分之间的a-螺旋）。一般而言，接头允许融合蛋白的两个或更多个结构域保留各自结构域 之 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的生物活性。接头还可 以指间隔子。
[0049]核酸：本文所用的术语"核酸"，以其最广泛的含义，指被并入或能够并入寡核苷酸 链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过磷酸二酯键被并入或能够 并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，"核酸"指单个核苷酸残基（例 如核苷酸和/或核苷）。在一些实施方案中，"核酸"指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。 本文所用的术语"寡核苷酸"和"多核苷酸"可互换使用。在一些实施方案中，"核酸"涵盖 RNA以及单链和/或双链DNA和/或eDNA。此外，术语"核酸"、"DNA"、"RNA"和/或类似 的术语包括核酸类似物，例如具有非磷酸二酯骨架的类似物。例如，在本领域已知并且在骨 架中具有肽键而非磷酸二酯键的所谓的"肽核酸"被视为在本发明的范围内。术语"编码 氨基酸序列的核苷酸序列"包括为彼此间的兼并版本（degenerateversion)和/或编码 相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和/或RNA的核苷酸序列可以包括内含子。 核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学地合成等。其中，例 如在化学合成分子的情况下，合适的核酸分子可包括核苷酸类似物，例如具有经化学修饰 的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，核酸序列以5'至3'方向给出。本文所 用的术语"核酸片段"是指为较长核酸序列之一部分的核酸序列。在许多实施方案中，核酸 片段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核 苷（例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷）；核苷 类似物（2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔 基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔 基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧 代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷）；化学修饰的碱基；生物修饰的碱 基（例如甲基化的碱基）；插入的碱基；修饰的糖（例如2' -氟核糖、核糖、2' -脱氧核糖、 阿拉伯糖和己糖）；和/或经修饰的磷酸盐/酯基团（例如硫代磷酸盐/酯和5' -N-亚磷 酰胺键）。在一些实施方案中，本发明具体地涉及"未经修饰的核酸"，意指核酸（例如多核 苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷）尚未被化学修饰以利于或实现递送。
[0050] 可药用：本文所用的术语"可药用"指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类 和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利 益/风险比相当的物质。
[0051] 多肽：本文所用的"多肽"一般而言是至少两个氨基酸通过肽键彼此连接的串。在 一些实施方案中，多肽可以包含至少3至5个氨基酸，每一个通过至少一个肽键与其他相连 接。本领域的普通技术人员应当理解，任选地，多肽有时包括"非天然"氨基酸或者仍能够 并入多肽链的其他部分。
[0052] 多蛋白：本文所用的术语"多蛋白"一般指在合成后可以被切割以产生几个功能不 同的多肽的蛋白。多蛋白通常由单个氨基酸序列编码。在一些实施方案中，未切割的多蛋 白保留其组成部分的生物活性。一些病毒产生这样的多蛋白，例如，Gag多蛋白，其可作为 功能多蛋白保留或者可被加工成几个功能不同的多肽。功能上，Gag多肽被分成3个结构 域：膜结合结构域，其使Gag多蛋白祀向细胞膜；相互作用结构域，其促进Gag聚合；以及晚 期结构域，其利于新生病毒体从宿主细胞释放。一般而言，介导病毒颗粒组装的Gag蛋白的 形式是多蛋白。
[0053]自组装部分：一般而言，本文所用的"自组装部分"指采取限定的排列而无需来自 外源的指导或管理之实体的相关延伸。在一些实施方案中，实体是蛋白。在一些实施方案 中，实体是多蛋白。在一些这样的实施方案中，相关延伸为至少1〇、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、 375、400、425、450、475、500或更多个残基。自组装可以在例如在细胞的内容物内（例如体 内）展示。或者或此外，自组装可以在细胞内容物外部（例如体外）展示。自组装可以为 分子内（例如折叠）和/或分子间。在一些实施方案中，自组装可以是巨大分子，实体由 此自组装成复合物和/或延展的巨大分子结构。自组装实体可以表现出广泛的结构模体 (motif)，包括但不限于颗粒、纤维、片层和带。在一些实施方案中，实体的自组装对于实体 的生物学功能是重要的。例如，在一些实施方案中，脂质的自组装导致细胞膜结构的形成。 在一些实施方案中，蛋白（例如病毒结构蛋白）的自组装导致颗粒结构（例如，病毒颗粒结 构）的形成。例如，病毒结构多蛋白可以含有靶向序列，其能够引导其定位至其宿主细胞的 细胞膜（例如质膜、内体等），病毒结构多蛋白可以从所述宿主细胞出芽形成VLP，其含有包 围病毒结构多蛋白的宿主细胞膜材料。
[0054] 基本同源性（Substantialhomology):本文所用的短语"基本同源性"指氨基酸 或核酸序列之间的比较。本领域的技术人员应当理解，如果两个序列在对应的位置含有同 源残基，那么他们一般被认为是"基本同源"。同源残基可以为相同残基。或者，同源残基可 以为具有大致相似的结构和/或功能特征的非相同残基。例如，本领域的普通技术人员公 知，某些氨基酸通常分类为"疏水的"或"亲水的"氨基酸，和/或具有"极性"或"非极性" 侧链。相同类型的一个氨基酸对另一个的替代经常可以认为是同源替代。
[0055] 如本领域所公知的，可以用多种算法的任一种进行氨基酸或核酸序列的比较，包 括那些市售的计算机程序，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、 缺口的BLAST和PSI-BLAST。示例性的这样的程序描述于Altschul，等，Basiclocal alignmentsearchtool,J.Mol.Biol. ,215(3) ：403-410,1990 ；Altschul,等，Methods inEnzymology266 :460_480(1996) ;Altschul，等，"GappedBLASTandPSI-BLAST: anewgenerationofproteindatabasesearchprograms" ,NucleicAcidsRes. 25 ： 3389-3402,1997 ;Baxevanis,等，Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysis ofGenesandProteins,Wiley, 1998;andMisener,等，（编辑），BioinformaticsMethods andProtocols(MethodsinMolecularBiology，132卷），HumanaPress，1999。除了鉴 别同源序列，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果在残基的相关 延伸中其对应残基的至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多为同源，那么两个序列被认为是基本同源。 在一些实施方案中，相关延伸是整个序列。在一些实施方案中，相应延伸为至少10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500 或更多个残基。
[0056] 基本同一性：本文所用的短语"基本同一性"指氨基酸或核酸序列之间的比较。 本领域的普通技术人员应当理解，如果两个序列在对应位置含有相同的残基，那么他们 一般被认为是"基本同一"。本领域公知，可以用多种算法中的任一种进行氨基酸或核酸 序列的比较，包括那些市售的计算机程序，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸 序列的BLASTP、缺口的BLAST和PSI-BLAST。示例性的这样的程序描述于Altschul，等， Basiclocalalignmentsearchtool,J.Mol.Biol. , 215(3) ：403-410,1990 ；Altschul, 等，MethodsinEnzymology266:460_480 (1996) ;Altschul，等，NucleicAcidsRes. 25: 3389-3402,1997 ;Baxevanis,等，Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysis ofGenesandProteins,Wiley, 1998;andMisener,等，（编辑），BioinformaticsMethods andProtocols(MethodsinMolecularBiology，132 卷），HumanaPress，1999。除了鉴 别相同序列，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果在残基的相关 延长中其对应残基的至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多为同一，两个序列被认为是基本同一的。在 一些实施方案中，相关延伸是整个序列。在一些实施方案中，相关延伸为至少10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500 或更多个残基。
[0057] 患有："患有"疾病、病症或病况（例如HCMV感染）的个体已经被诊断为具有和/ 或表现出该疾病、病症或病况的一种或更多种症状。
[0058] 易感："易感"疾病、病症或病况（例如HCMV感染）的个体具有发生疾病、病症或 病况的风险。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病况的个体不表现出疾病、病症或病况 的任何症状。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病况的个体已经被诊断为具有疾病、病 症和/或病况。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病况的个体是已经暴露于与该疾病、 病症或病况的发生相关之条件的个体（例如个体已经暴露于HCMV)。
[0059]症状减轻：根据本发明，当特定疾病、病症或病况的一种或更多种症状的程度（强 度、严重程度等）或频率降低时，则"症状减轻"。出于澄清的目的，特定症状之发作的延迟 被认为是减少所述症状之频率的一种形式。不旨在将本发明仅限制为症状消除的情况。本 发明具体地考虑到使得虽然未完全消除，但一种或更多种症状减轻（并且对象的病症由此 "改善"）的治疗。
[0060] 治疗有效量：本文所用的术语"治疗有效量"指以可应用于任何医疗治疗的合理 的益处/风险比，足以对所治疗的对象产生治疗效果的量。治疗效果可为客观的（例如可 通过某种测试或标志物测量）或主观的（例如对象给出效果的指示或感觉到效果）。特别 地，"治疗有效量"指有效地治疗、改善或预防期望的疾病或病症或者表现出可检测的治疗 或预防效果（例如通过改善与疾病相关的症状、预防或延迟疾病的发作、和/或还减轻疾病 症状之严重程度或频率）的治疗蛋白或组合物的量。治疗有效量通常以可以包含多种单位 剂量的给药方案施用。对于任何特定的免疫原性组合物，治疗有效量（和/或有效给药方 案内的适当单位剂量）可以根据（例如）施用途径或与其他药剂的组合变化。此外，对于 任何特定患者，具体的治疗有效量（和/或单位剂量）可以取决于多种因素，包括：被治疗 的病症和病症的严重程度；所采用的具体药剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、 体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径、和/或所采用的具体免疫原性组合 物的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医药领域中公知的类似因素。
[0061]跨膜结构域：本领域中已知，多肽有时具有跨膜、胞质和/或胞外结构域。一般而 言，本文所用的"跨膜结构域"指具有存在于膜（例如跨越细胞膜的一部分或全部）中之性 质的结构域。应当理解，不需要跨膜结构域中的每个氨基酸都存在于膜中。例如，在一些实 施方案中，跨膜结构域的特征在于蛋白的指定延伸或部分基本上定位于膜中。本领域中公 知，可以使用多种算法分析氨基酸或核酸序列以预测蛋白亚细胞定位（例如跨膜定位）。示 例性的这样的程序包括psort(PS0RT.org)、Prosite(prosite,expasy.org)等等。
[0062] 治疗：本文所用的术语"治疗"指对于特定疾病、病症和/或病况（例如HCMV感染） 的一种或更多种症状或特征或者对该疾病的易感性予以部分或完全地减轻、改善、缓解、抑 制、延迟其发作、减轻其严重程度、和/或减轻其发生率的免疫原性组合物的任何施用。这 样的治疗可以对不表现出相关疾病、病症和/或病况之病征的对象进行，和/或仅表现出该 疾病、病症和/或病况之早期病征的对象进行。或者或此外，这样的治疗可以对表现出相关 疾病、病症和/或病况之一种或更多种已确定病征的对象进行。在某些实施方案中，术语 "治疗"指患者的接种疫苗。
[0063] 接种疫苗：本文所用的术语"接种疫苗"指旨在对例如致病剂（例如，HCMV)产生 免疫应答的组合物的施用。出于本发明的目的，接种疫苗可以在暴露于致病剂之前、期间和 /或之后施用，并且在某些实施方案中，在暴露于致病剂之前、期间和/或不久之后施用。在 一些实施方案中，接种疫苗包括疫苗组合物以适当间隔的时间多次施用。
[0064] 载体：本文所用的"载体"指能够转运与其缔合的另一个核酸的核酸分子。在一些 实施方案中，载体能够染色体外复制和/或表达在宿主细胞（例如真核和/或原核细胞） 中与其相连接的核酸。能够引导有效连接的基因之表达的载体在本文中称作"表达载体"。 [0065] 某些实施方案的详细描述
[0066] 除了其他方面以外，本发明提供了用于预防、治疗和/或研究人巨细胞病毒 (HCMV)感染的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供了病毒样颗粒（virus-like particles，VLP)，其包含一个或更多个莫洛尼鼠白血病病毒（MoloneyMurineleukemia virus，MMLV)核心蛋白并且包含一个或更多个HCMV表位，例如来自HCMV的包膜糖蛋白gB 和/或gH和/或被膜蛋白（tegumentprotein)pp65。除了其他方面以外，本发明涵盖了以 下认识：抗原（例如，包膜糖蛋白和结构蛋白）之组合可导致改善的有益免疫应答之诱导， 所述有益免疫应答包括例如体液应答（例如中和抗体的产生）和细胞应答（例如T细胞活 化）二者。所提供的VLP特征可在于他们不含有病毒RAN或DNA并且无感染性。在一些实 施方案中，提供的VLP确实含有病毒RNA或DNA并且有感染性。在一些这样的实施方案中， 提供的VLP可用作DNA疫苗。
[0067] 在一些实施方案中，对象中的体液免疫应答持续至少约1个月、至少约2个月、至 少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至 少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个 月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少 约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月、至少约24个月、至少约28个 月、至少约32个月、至少约36个月、至少约40个月、至少约44个月、至少约48个月或更长。 在一些实施方案中,对象中的细胞免疫应答持续至少约1个月、至少约2个月、至少约3个 月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个 月、至少约10个月、至少约11个月或至少12个月。
[0068] 在一些实施方案中，所提供的VLP被脂质膜包围，所述脂质膜任选地含有来自病 毒包膜糖蛋白（例如gB和/或gH)的一种或更多种表位，其是在病毒中和抗体的诱导中发 挥作用的抗原。
[0069] 在一些实施方案中，所提供的VLP含有来自病毒结构蛋白（例如pp65)的一个或 更多个表位，其是在细胞免疫应答（例如，T细胞应答）的诱导中发挥作用的抗原。在一些 实施方案中，所利用的病毒结构蛋白（例如PP65)不仅刺激T辅助细胞（TH)的形成而且还 诱导针对HCMV的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)。
[0070] 在一些实施方案中，本发明提供了多种病毒包膜糖蛋白（例如gB和/或gH)。在 一些实施方案中，变体病毒包膜糖蛋白是或者包含融合蛋白。在一些实施方案中，病毒糖蛋 白的变体包含异源蛋白结构域（例如，来自不同蛋白的跨膜和/或胞质结构域）。在一些实 施方案中，病毒结构蛋白的变体包含异源抗原或表位。在一些实施方案中，本大明提供了包 含病毒结构蛋白之变体的VLP。在一些实施方案中，病毒结构蛋白的变体是或者包含融合蛋 白。
[0071]I?病毒样颗粒（VLP)
[0072] 反转录病毒是包膜的RNA病毒，其属于反转录病毒科（Retroviridae)。宿主 细胞被反转录病毒感染后，RNA经酶反转录酶转录为DNA。然后DNA通过整合酶并入宿 主细胞的基因组并且之后作为宿主细胞DNA的一部分复制。反转录病毒科包括以下属： a反转录病毒属（Alpharetrovirus)、0反转录病毒属（Betaretrovirus)、Y反转录 病毒属(Gammearetrovirus) > 6反转录病毒属（Deltaretrovirus)、e反转录病毒属 (Epsilonretrovirus)、慢病毒属（Lentivirus)和泡沫病毒属（Spumavirus)。反转录病毒 科的宿主一般为脊椎动物。反转录病毒产生感染性病毒体，其含有被来自宿主细胞膜的脂 质双层包围的球形核壳（与病毒结构蛋白复合的病毒基因组）。
[0073] 反转录病毒载体可用于产生包膜的病毒体，其是感染性的并且有复制能力或者复 制缺陷的。有复制能力的感染性反转录病毒载体含有用于病毒体合成的所有必需基因并且 一旦发生宿主细胞的感染后持续增殖自身。复制缺陷的感染性反转录病毒载体在初始感染 后不传播。这通过用待转移的基因或核苷酸序列替换反转录病毒的大多数编码区完成；使 得载体能够制造另外的复制循环所述的蛋白。
[0074] 或者或此外，反转录病毒载体可用于产生病毒样颗粒（VLP)，其缺乏来自反转录病 毒的基因组并且是非感染性和非复制的。由于VLP有益的性质，VLP可以用作抗原递送系 统。此外，因为VLP是非感染性的，它们可作为免疫原性组合物（例如，疫苗）安全地施用。 VLP通常结构类似于上述的包膜的病毒体，但缺乏来自反转录病毒的基因组，使得病毒复制 将不太可能发生。一些病毒（例如鼠白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV))的衣 壳蛋白（例如Gag)的表达导致自组装成类似于相应天然病毒的颗粒，该颗粒没有病毒遗传 物质。
[0075] 已经制备了各种各样的VLP。例如，已经制备了包含单种或多种衣壳蛋白，有或 者没有包膜蛋白和/或表面糖蛋白的VLP。在一些情况下，VLP是非包膜的并且通过仅表 达一种主要衣壳蛋白装配，如所示的从嗜肝DNA病毒（例如Engerix?，GSK和Recombivax HB?，Merck)、乳头状瘤病毒（例如Cervarix?，GSK和Gardasil?，Merck)、细小病毒 (paroviruse)或多瘤病毒制备的VLP。在一些实施方案中，VLP是包膜的并且可包含存在 于相应的天然病毒中的多个抗原蛋白。VLP通常类似于其对应的天然病毒并且可为多价的 颗粒结构。在一些实施方案中，抗原蛋白可以存在于VLP内作为VLP结构的组分和/或在 VLP的表面上。本发明涵盖了以下认识：与其他形式的抗原呈递（例如不与VLP缔合的可溶 性抗原）相比，在VLP的情形中的抗原呈递有利于诱导针对该抗原的中和抗体。中和抗体 大多数经常识别三级或四级结构，这经常需要以其天然病毒构象呈递抗原蛋白（如包膜糖 蛋白）。或者或此外，VLP可用于在诱导细胞免疫（例如T细胞应答）的情形下呈递抗原。 本发明还涵盖了这样的观点，在VLP系统中使用抗原组合可产生改进的免疫应答。
[0076]A?结构蛋白
[0077] 在一些实施方案中，本发明利用由一种或更多种反转录病毒结构蛋白（例如Gag) 组成的VLP。在一些实施方案中，根据本发明所使用的结构蛋白为a反转录病毒属（例如 禽白血病病毒）、0反转录病毒属（小鼠乳腺瘤病毒）、Y反转录病毒属（鼠白血病病毒）、 S反转录病毒属（牛白血病病毒）、e反转录病毒属（大眼梭S卢皮肤肉瘤病毒，walley dermalsarcomavirus)、慢病毒属（人免疫缺陷病毒1)和泡沫病毒属（黑猩猩泡沫病毒） 结构蛋白。在某些实施方案中，结构蛋白为鼠白血病病毒（MLV)结构蛋白。这些反转录病 毒的基因组在数据库中可容易地得到。所有这些反转录病毒的Gag基因具有整体上类似的 结构并且在各个反转录病毒群中在氨基酸水平是保守的。反转录病毒Gag蛋白主要功能为 病毒组装。多蛋白形式的Gag基因产生VLP的核心结构蛋白。MLVGag基因编码65kDa多 蛋白前体，其在成熟的病毒体中由MLV蛋白酶蛋白水解切割为4个结构蛋白（基质（MA); pl2 ;衣壳（CA)和核壳（NC))。反转录病毒组装不成熟衣壳，其由从Gag多肽形成的Gag多 蛋白组成但缺乏其他病毒元件（如病毒蛋白酶），Gag作为该未成熟病毒颗粒的结构蛋白。 功能上，Gag多蛋白分为3个结构域：膜结合结构域，其将Gag多蛋白靶向细胞膜；相互作用 结构域，其促进Gag聚合；以及晚期结构域，其利于新生病毒体从宿主细胞的释放。介导病 毒颗粒组装的Gag蛋白之形式为多蛋白。
[0078] 在一些实施方案中，根据本发明使用的反转录病毒结构蛋白为Gag多肽。本文所 用的术语"Gag多肽"为来自反转录病毒的结构多肽，其负责本文所述的VLP的形成并且指 其氨基酸序列包括Gag之至少一个特征序列的多肽序列。本领域和本领域普通技术人员已 知来自多种反转录病毒的各种各样的Gag序列，参考这样的序列，可容易地鉴别一般Gag蛋 白和/或特定Gag多肽的特征性序列。
[0079] 根据本发明使用的示例性Gag多肽如以下SEQIDN0 :1所示。在一些实施方案中， 合适的Gag多肽与已知的反转录病毒Gag多肽基本同源。例如，Gag多肽可以为经修饰的反 转录病毒Gag多肽，其与野生型或天然存在的Gag多肽（例如SEQIDNO: 1)相比含有一个 或更多个氨基酸替代、缺失和/或插入，同时基本上保留自组装活性。因此，在一些实施方 案中，适合用于本发明的Gag多肽基本上与MMLVGag多肽（SEQIDN0 :1)同源。在一些实 施方案中，适合用于本发明的Gag多肽具有与SEQIDNO: 1有至少50 %、55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同 源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合用于本发明的Gag多肽与MMLVGag多肽（SEQ IDN0 :1)基本同一。在一些实施方案中，适合用于本发明的Gag多肽具有与SEQIDN0 :1 有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %、99 %或更高同一性的氨基酸序列。
[0080]MMLVGag氨某酸序列（SEQIDN0 :1)
[0081]MGQTVTTPLSLTLGHWKDVERIAHNQSVDVKKRRWVTFCSAEWPTFNVGWPRDGTFN
[0082]RDLITQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPPSAPSLPL
[0083]EPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRPPPSDRDGNGG
[0084]EATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQYWPFSSSDLYNW
[0085]KNNNPSFSEDPGKLTALIESVLITHQPTWDDCQQLLGTLLTGEEKQRVLLEARKAVRGD
[0086]DGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGRNHLVHYRQLLLAGLQNAGRSPTNLAKV
[0087]KGITQGPNESPSAFLERLKEAYRRYTPYDPEDPGQETNVSMSFIWQSAPDIGRKLERLED
[0088]LKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETEEKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREM
[0089] SKLLATVVSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQT
[0090] SLLTLDD(SEQ ID NO：1)
[0091] MMLV Gag核苷酸序列（SEQ ID NO :2)

【权利要求】
1. 病毒样颗粒（VLP)，其包含： 第一多肽，所述第一多肽为鼠白血病病毒（MLV) gag多肽，其中其氨基酸序列包含与具 有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的参考MLV gag蛋白之自组装部分显示至少70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300或更多个氨基酸的 部分，以及 第二多肽，其氨基酸序列包含被结合人巨细胞病毒（HCMV)蛋白的一种或更多种抗体 识别的表位。
2. 权利要求1所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含被HCMV糖蛋白B(gB)蛋白的一 种或更多种抗体识别之表位的氨基酸序列。
3. 权利要求1所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含被HCMV糖蛋白H (gH)蛋白的一 种或更多种抗体识别之表位的氨基酸序列。
4. 权利要求1至3中任一项所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含跨膜结构域、胞质 结构域或二者的氨基酸序列。
5. 权利要求4所述的VLP，其中所述跨膜结构域不天然地存在于HCMV蛋白中。
6. 权利要求4所述的VLP，其中所述跨膜结构域天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 蛋白中。
7. 权利要求4所述的VLP，其中所述跨膜结构域具有不同于SEQ ID N0:7和SEQ ID NO :13中所存在氨基酸序列的氨基酸序列。
8. 权利要求4所述的VLP，其中所述跨膜结构域具有选自以下的氨基酸序列：存在于 SEQ ID NO :7中的跨膜结构域，存在于SEQ ID NO: 13中的跨膜结构域和存在于SEQ ID NO: 16中的跨膜结构域。
9. 权利要求4所述的VLP，其中所述跨膜结构域具有SEQ ID NO :10中752至795位残 基的氨基酸序列。
10. 权利要求4所述的VLP，其中所述跨膜结构域具有由SEQ ID NO :20中2152至2622 位核苷酸编码的氨基酸序列。
11. 权利要求4至10中任一项所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含以下的氨基酸 序列：1)存在于SEQ ID NO : 13中的表位；以及2)包含SEQ ID NO : 10中752至795位残基 之跨膜结构域的氨基酸序列。
12. 权利要求4至10中任一项所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含以下的氨基酸 序列：1)存在于SEQ ID NO : 13中的表位；以及2)包含由SEQ ID NO :20中2152至2622位 核苷酸所编码氨基酸序列之跨膜结构域的氨基酸序列。
13. 权利要求11或权利要求12所述的VLP，其中所述第二多肽具有氨基酸序列，其包 含存在于SEQ ID NO :13中的除所述表位外的一个或更多个序列，其中所述一个或更多个序 列不包含完整的跨膜结构域。
14. 权利要求1至13中任一项所述的VLP，其中所述第一多肽为融合蛋白或包含融合 蛋白。
15. 权利要求1至13中任一项所述的VLP，其中所述第二多肽为融合蛋白或包含融合 蛋白。
16. 跨膜的经修饰的gH多肽。
17. 权利要求16所述的多肽，其包含存在于HCMV中的gH蛋白之N端胞外结构域。
18. 权利要求16或权利要求17所述的多肽，其包含跨膜结构域、胞质结构域或二者。
19. 权利要求18所述的多肽，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或二者不天然地存在 于所述gH蛋白中。
20. 权利要求18所述的多肽，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或二者天然地存在于 VSV蛋白中。
21. 权利要求19所述的多肽，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或二者天然地存在于 gB蛋白中。
22. 权利要求16所述的多肽，其包含SEQ ID NO : 16。
23. 权利要求16至22中任一项所述的多肽，其中所述多肽存在于VLP中。
24. 多核苷酸，其编码权利要求16至22中任一项所述的多肽。
25. 载体，其包含权利要求24所述的多核苷酸。
26. 病毒样颗粒（VLP)，其包含多肽，所述多肽包含存在于HCMV中的gB蛋白之表位。
27. 权利要求26所述的VLP，其中所述多肽包含存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外 结构域。
28. 权利要求26或27所述的VLP，其中所述多肽包含跨膜结构域、胞质结构域或者二 者。
29. 权利要求28所述的VLP，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或者二者不天然地存在 于gB蛋白中。
30. 权利要求28所述的VLP，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或者二者天然地存在于 VSV蛋白中。
31. 权利要求26所述的VLP，其中所述多肽包含SEQ ID NO :7。
32. 权利要求30所述的VLP，其中所述多肽包含SEQ ID NO : 10。
33. 融合蛋白，其包含： a) 第一多肽，所述第一多肽为MLV gag多肽，其中其氨基酸序列包含与具有SEQ ID NO : 1氨基酸序列的参考MLV gag蛋白之自组装部分显示至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300或更多个氨基酸的部分，以及 b) 第二多肽，所述第二多肽为包含pp65表位的HCMV pp65多肽，其中其氨基酸序列包 含与具有SEQ ID NO :4中539至1099位残基之氨基酸序列的参考pp65蛋白显示至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300 或更多 个氨基酸的部分。
34. 包含融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，其包含： a) 第一多肽，所述第一多肽为MLV gag多肽，其中其氨基酸序列包含与具有SEQ ID NO : 1氨基酸序列的参考MLV gag蛋白之自组装部分显示至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300或更多个氨基酸的部分，以及 b) 第二多肽，所述第二多肽为包含pp65表位的HCMV pp65多肽，其中其氨基酸序列包 含与具有SEQ ID NO :4中539至1099位残基之氨基酸序列的参考pp65蛋白显示至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300 或更多 个氨基酸的部分。
35. 病毒样颗粒（VLP)，其包含： 第一多肽，其包含存在于HCMV中的gB蛋白之表位；和 第二多肽，其包含跨膜的经修饰的gH多肽。
36. 权利要求35所述的VLP，其中所述第一多肽包含存在于HCMV中的gB蛋白之N端 胞外结构域。
37. 权利要求36所述的VLP，其中所述第一多肽包含跨膜结构域、胞质结构域或者二 者。
38. 权利要求37所述的VLP，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或者二者不天然地存在 于gB蛋白中。
39. 权利要求38所述的VLP，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或者二者天然地存在于 VSV蛋白中。
40. 权利要求35所述的VLP，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO :7。
41. 权利要求39所述的VLP，其中所述第一多肽包含SEQ ID N0:10。
42. 权利要求35所述的VLP，其中所述第二多肽包含天然地存在于HCMV中的gH蛋白 之N端胞外结构域。
43. 权利要求35或42所述的VLP，其中所述第二多肽包含跨膜结构域、胞质结构域或 者二者。
44. 权利要求43所述的VLP，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或者二者不天然地存在 于gH蛋白中。
45. 权利要求43所述的VLP，其中所述跨膜结构域、胞质结构域或者二者天然地存在于 VSV蛋白中。
46. 权利要求35所述的VLP，其中所述第二多肽包含SEQ ID N0:16。
47. 病毒样颗粒（VLP)，其包含： 融合蛋白，其包含： a) 第一多肽，所述第一多肽为MLV gag多肽，其中其氨基酸序列包含与具有SEQ ID NO : 1氨基酸序列的参考MLV gag蛋白之自组装部分显示至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300或更多个氨基酸的部分，以及 b) 第二多肽，所述第二多肽为包含pp65表位的HCMV pp65多肽，其中其氨基酸序列包 含与具有SEQ ID NO :4中539至1099位残基之氨基酸序列的参考pp65蛋白显示至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的长度为至少100、200、300 或更多 个氨基酸的部分；以及 存在于HCMV中的第二蛋白之表位。
48. 权利要求47所述的VLP，其中所述融合蛋白设置并构建为使得其自组装以形成 VLP，从而所述pp65表位位于所述VLP内部。
49. 权利要求47或权利要求48所述的VLP，其设置和构建为使得第二HCMV蛋白表位 位于VLP表面上。 50. VLP，其包含： 融合蛋白，其包含融合在HCMV中所存在pp65蛋白之表位上游的MLV中所存在gag蛋 白之N端部分；以及 多肽，其包含存在于HCMV中的gB蛋白之表位。
51. 权利要求50所述的VLP，其中所述gag蛋白之N端部分不包含存在于MLV中的C 端聚合酶序列。
52. 权利要求50或权利要求51所述的VLP，其中所述gag蛋白之N端部分包含全长蛋 白的1至538位残基。
53. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位存在于全长gB蛋 白中。
54. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被结合全长gB中 表位的抗体识别。
55. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被结合SEQ ID NO: 7中表位的抗体识别。
56. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含全 长gB蛋白中1至751位残基的氨基酸序列。
57. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7之至少15个连续残基的氨基酸序列。
58. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7的氨基酸序列。
59. 权利要求50至52中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽包含融合蛋 白。
60. 权利要求59所述的VLP，其中所述融合蛋白包含与第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含来自存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外结构域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV中的跨膜结构域、胞质结构域或二者。
61. 权利要求60所述的VLP，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 中。
62. 权利要求60的VLP，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO :10。 63. VLP，其包含： 融合蛋白，其包含与存在于HCMV中的pp65蛋白之表位融合的存在于MLV中的gag蛋 白之N端部分；以及 多肽，其包含存在于HCMV中的gH蛋白之表位。
64. 权利要求63所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分不包含存在于MLV中的C 端聚合酶序列。
65. 权利要求63或权利要求64所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分包含全长蛋 白的1至538位残基。
66. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位存在于全长gH蛋 白中。
67. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被结合全长gH中 表位的抗体识别。
68. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被结合SEQ ID NO: 13中表位的抗体识别。
69. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含全 长gH蛋白中1至751位残基的氨基酸序列。
70. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13之至少15个连续残基的氨基酸序列。
71. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
72. 权利要求63至65中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽包含融合蛋 白。
73. 权利要求72所述的VLP，其中所述融合蛋白包含与第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含来自存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外结构域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV蛋白中的跨膜结构域、胞质结构域或二者。
74. 权利要求73所述的VLP，其中所述第二多肽为gB蛋白。
75. 权利要求73所述的VLP，其中所述在第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 中。 76. VLP，其包含： 融合蛋白，其包含融合在人巨细胞病毒（HCMV)中所存在pp65蛋白之表位上游的鼠白 血病病毒（MLV)中所存在gag蛋白之N端部分； 多肽，其包含存在于HCMV中的糖蛋白B(gB)蛋白之表位；以及 多肽，其包含存在于HCMV中的糖蛋白H(gH)蛋白之表位。
77. 权利要求76所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分不包含存在于鼠白血病病 毒（MLV)中的C端聚合酶序列。
78. 权利要求76或权利要求77所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分包含全长蛋 白的1至538位残基。
79. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位存在于全长gB蛋 白中。
80. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被结合全长gB中 表位的抗体识别。
81. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被结合SEQ ID NO: 7中表位的抗体识别。
82. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含全 长gB蛋白中1至751位残基的氨基酸序列。
83. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7之至少15个连续残基的氨基酸序列。
84. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7的氨基酸序列。
85. 权利要求76至78中任一项所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽包含融合蛋 白。
86. 权利要求85所述的VLP，其中所述融合蛋白包含与第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含来自存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外结构域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV蛋白中的跨膜结构域、胞质结构域或二者。
87. 权利要求86所述的VLP，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 中。
88. 权利要求86所述的VLP，其中所述融合蛋白包含SEQ ID N0:10。
89. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位存在于全长gH蛋 白中。
90. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被结合全长gH中 表位的抗体识别。
91. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被结合SEQ ID NO: 13中表位的抗体识别。
92. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含全 长gH蛋白中1至717位残基的氨基酸序列。
93. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13之至少15个连续残基的氨基酸序列。
94. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
95. 权利要求76至88中任一项所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽包含融合蛋 白。
96. 权利要求95所述的VLP，其中所述融合蛋白包含与第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含来自存在于HCMV中的gH蛋白之N端胞外结构域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV蛋白中的跨膜结构域、胞质结构域或二者。
97. 权利要求96所述VLP，其中所述第二多肽为gB蛋白。
98. 权利要求96所述VLP，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV)中。
99. 权利要求1至15、26至32和34至98中任一项所述的VLP，其中所述VLP的特征 在于其直径范围的下限由20、30、40、50、60、70、80、90或100nm界定并且上限由300、290、 280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180 或 170nm 界定。
100. 根据权利要求1至15、26至32和34至98中任一项所述VLP的群体，其中所述群 体中VLP平均直径范围的下限由20、30、40、50、60、70、80、90或10011111界定并且上限由300、 290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180 或 170nm 界定。
101. 根据权利要求1〇〇所述的VLP之群体，其中所述群体中VLP的多分散指数小于 0· 5〇
102. 权利要求1至15、26至32和34至98中任一项所述的VLP，其中所述VLP的特征 在于所述糖蛋白的表位暴露在VLP的表面上并且所述融合蛋白位于VLP的被膜/内腔中。
103. 免疫原性组合物，其包含权利要求1至15、26至32和34至98中任一项所述的 VLP。
104. 权利要求103所述的免疫原性组合物，其中所述组合物的特征在于当施用至对象 时其诱导体液免疫应答和细胞免疫应答二者。
105. 权利要求104所述的免疫原性组合物，其中所述体液免疫应答在对象中持续至少 约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少 约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少12个月。
106. 权利要求104所述的免疫原性组合物，其中所述细胞免疫应答在对象中持续至少 约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少 约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少12个月。
107. 免疫原性组合物，其包含权利要求50所述之VLP与权利要求63所述之重组VLP 的混合物。
108. 免疫原性组合物，其包含权利要求50所述之VLP与权利要求75所述之VLP的混 合物。
109. 载体，其包含： 编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含融合在人巨细胞病毒（HCMV)中所存在 PP65蛋白之表位上游的鼠白血病病毒（MLV)中所存在gag蛋白之N端部分； 其中所述编码融合蛋白的多核苷酸在单个启动子的控制之下；并且 其中所述载体包含在编码融合蛋白载体之多核苷酸下游的多聚腺苷酸化信号。
110. 权利要求109所述的载体，其中所述gag蛋白的N端部分不包含存在于鼠白血病 病毒（MLV)中的C端聚合酶序列。
111. 权利要求109或权利要求110所述的载体，其中所述gag蛋白的N端部分包含全 长蛋白的1至538位残基。
112. 权利要求109至111中任一项所述的载体，其包含SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或 SEQ ID NO :22的多核苷酸序列。
113. 权利要求109至111中任一项所述的载体，其中所述载体如图1中所描绘。
114. 载体，其包含： 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含存在于HCMV中的糖蛋白B(gB)蛋白之表位； 其中所述多核苷酸在单个启动子的控制之下；并且 其中所述载体包含所述多核苷酸上游的信号序列和所述多核苷酸下游的多聚腺苷酸 化信号。
115. 权利要求114所述的载体，其中包含所述gB蛋白之表位的所述多肽包含全长gB 蛋白的1至751位残基。
116. 权利要求114或权利要求115所述的载体，其包含SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9 的多核苷酸序列。
117. 权利要求114至116中任一项所述的载体，其中所述载体如图1中所描绘。
118. 载体，其包含： 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含存在于HCMV中的糖蛋白H(gH)蛋白之表位； 其中所述多核苷酸在单个启动子的控制下；并且 其中所述载体包含所述多核苷酸上游的信号序列和所述多核苷酸下游的多聚腺苷酸 化信号。
119. 权利要求118所述的载体，其中包含所述gH蛋白之表位的所述多肽不包含来自存 在于HCMV中的gH蛋白之跨膜结构域或胞质结构域。
120. 权利要求118或权利要求119所述的载体，其中包含所述gH蛋白之表位的所述多 肽包含融合蛋白。
121. 权利要求120所述的载体，其中所述融合蛋白包含融合在第二多肽上游的来自 HCMV的gH蛋白质之N端胞外结构域，所述第二多肽包含不天然地存在于HCMV蛋白中的跨 膜结构域、胞质结构域或二者。
122. 权利要求121所述的载体，其中所述第二多肽为gB蛋白。
123. 权利要求121所述的载体，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒 (VSV)中。
124. 权利要求118至123中任一项所述的载体，其中包含gH表位的所述多肽包含全长 gH蛋白的1至717位残基。
125. 权利要求118至124中任一项所述的载体，其包含SEQ ID NO : 14中1至2148位 核苷酸或SEQ ID NO : 15中1至2148位核苷酸的多核苷酸序列。
126. 权利要求118至125中任一项所述的载体，其中载体如图1所描绘。
127. 细胞，其包含权利要求109至126中任一项所述的一种或更多种载体。
128. 权利要求127所述的细胞，其中所述细胞用一种或更多种所述载体瞬时转染。
129. 权利要求127所述的细胞，其中所述细胞用一种或更多种所述载体稳定转染。
130. 用于生产VLP的方法，所述方法包括： 用权利要求109至113中任一项所述的载体和权利要求114至117中任一项所述的载 体共转染宿主细胞；以及 在合适的培养基中于允许表达由所述载体编码之蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
131. 用于生产VLP的方法，所述方法包括： 用权利要求109至113中任一项所述的载体和权利要求118至126中任一项所述的载 体共转染宿主细胞；以及 在合适的培养基中于允许表达由所述载体编码之蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
132. 用于生产VLP的方法，所述方法包括： 用权利要求109至113中任一项所述的载体、权利要求114至117中任一项所述的载 体以及权利要求118至126中任一项所述的载体共转染宿主细胞；以及 在合适的培养基中于允许表达由所述载体编码之蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
133. 权利要求130至132中任一项所述的方法，其还包括从所述培养基和/或所述宿 主细胞回收VLP的步骤。
134. 药物组合物，其包含权利要求1至15、26至32和34至98中任一项所述的VLP和 可药用载体。
135. 权利要求134所述的药物组合物，其还包含佐剂。
136. 权利要求135所述的药物组合物，其中所述佐剂选自细胞因子、凝胶型佐剂、微生 物佐剂、油乳剂和基于乳化剂的佐剂、颗粒佐剂、合成佐剂、聚合物佐剂和/或其组合。
137. 用于在对象中减少HCMV感染之症状的频率、严重程度或延迟所述症状发作的方 法,所述方法包括施用权利要求134至136中任一项所述的药物组合物。
138. 权利要求137所述的方法，其中所述对象处于HCMV感染的风险中。
139. 权利要求138所述的方法，其中所述对象为免疫抑制的对象。
140. 权利要求139所述的方法，其中所述免疫抑制的对象选自：HIV感染的对象、AIDS 患者、移植受者、儿童对象和妊娠对象。
141. 权利要求137至140中任一项所述的方法，其中所述对象已经暴露于HCMV感染。
142. 权利要求137至141中任一项所述的方法，其中所述对象为人。
143. 权利要求137所述的方法，其中与施用所述药物组合物前所述对象中HCMV感染之 症状的频率、严重程度或发作相比，所述对象中HCMV感染之症状的频率、严重程度或发作 减少约50 %或更多。
144. 权利要求143所述的方法，其中与施用所述药物组合物前所述对象中HCMV感染之 症状的频率、严重程度或发作相比，所述对象中HCMV感染之症状的频率、严重程度或发作 减少约60 %或更多、约70 %或更多、或约75 %或更多。
145. 权利要求137至144中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以初始剂量和至 少一次加强剂量施用。
146. 权利要求145所述的方法，其中所述药物组合物以初始剂量和两次加强剂量施 用。
147. 权利要求145所述的方法，其中所述药物组合物以初始剂量和三次加强剂量施 用。
148. 权利要求145所述的方法，其中所述药物组合物以初始剂量和四次加强剂量施 用。
149. 权利要求145所述的方法，其中所述药物组合物以初始剂量和在所述初始剂量后 约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月的至少一次加强剂量施用。
150. 权利要求149所述的方法，其中所述药物组合物在所述初始剂量后约6个月、约7 个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约1年以第二加强剂量施用。
151. 权利要求137至150中任一项所述的方法，其中所述药物组合每1年、每2年、每 3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年以加强剂量施用。
【文档编号】C12N7/01GK104271745SQ201280066355
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】大卫·E·安德森, 安妮-凯瑟琳·弗卢基格 申请人:变异生物技术公司