胚珠特异性启动子及使用方法
【专利摘要】本发明公开了用于调节异源核苷酸序列在植物中的表达的组合物和方法。组合物包含拟南芥(AT?SVL3)启动子的核苷酸序列。还提供了使用本文公开的启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。
【专利说明】胚珠特异性启动子及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及植物中基因表达的调节。
【背景技术】
[0002]异源DNA序列在植物宿主中的表达有赖于在该植物宿主中有功能的可操作连接的调节元件的存在。启动子序列的选择将决定在生物体中何时和何处表达异源DNA序列。需要在特定组织或者器官中表达的情况下，可以使用组织优选启动子。需要应答于刺激而表达基因的情况下，诱导型启动子是首选的调节元件。相比之下，在需要在植物的整个细胞中持续表达的情况下，采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包括位于核心启动子序列上游和/或下游的另外调节序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中不同水平的表达。
[0003]常常需要在植物的特定组织或器官中表达DNA序列。例如，可以通过遗传操纵植物的基因组以包含可操作连接到异源病原体抗性基因的组织优选启动子，从而在所需植物组织中产生病原体抗性蛋白质，实现植物对土源和空气源病原体感染的抗性增加。或者，可能需要抑制植物组织内的天然DNA序列的表达以实现所需的表型。在这种情况中，可以如下实现这种抑制:将植物转化以使其包含可操作连接到反义核苷酸序列的组织优选启动子，从而该反义序列的表达产生了干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。
[0004]此外，可能需要在处于特定生长或发育阶段(例如细胞分裂或伸长)的植物组织中表达DNA序列。这种DNA序列可用于促进或抑制植物生长过程，从而影响植物的生长速率或架构。
[0005]为了影响植物的各种性状以及为了与可评分标志物一起使用，需要分离和表征胚珠优选的启动子，特别是能在种子发育早期充当目的分离核苷酸序列的表达的调节元件的启动子。
[0006]发明概沭
[0007]提供用于调节植物中基因表达的组合物和方法。组合物包含在授粉之前、授粉过程中和授粉之后在胚珠组织中活跃的启动子的新型核苷酸序列。此类优选表达对于筛选不定胚生殖是特别合乎需要的。更具体而言，该启动子在胚珠中活跃，大约在受精时和在受精之前直至球形胚形成为止主要在拟南芥(Arabidopsis)的内珠被的珠孔端。本发明的某些实施例包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列及其功能片段，其驱动可操作连接的核苷酸序列的胚珠优选表达。本发明的实施例还包括包含可操作连接到目的异源核苷酸序列的启动子的DNA构建体，其中所述启动子能够驱动所述核苷酸序列在植物细胞中的表达，并且所述启动子包含本文公开的核苷酸序列中的一个。本发明的实施例还提供表达载体，以及在其基因组中稳定掺入了如上所述的DNA构建体的植物或植物细胞。另外，组合物包括这种植物的转基因种子。具有这种优选的空间和时序表达的启动子对于通过双子叶植物中种子的无性繁殖是特别合乎需要的。通过种子的无性繁殖将会用于保持经多代的稳定的基于杂交的杂种优势。[0008]另外的实施例包括在植物中选择性表达核苷酸序列的方法，该方法包括用DNA构建体转化植物细胞，并从所述植物细胞再生出转化植物，所述DNA构建体包含本发明的启动子和可操作连接到所述启动子的异源核苷酸序列，其中所述启动子启动所述核苷酸序列在再生的植物中的胚珠优选转录。按这种方式，启动子序列可用于以组织优选方式控制可操作连接的编码序列的表达。
[0009]在启动子的转录起始区的下游将是目的序列，其将提供对植物的表型的修饰。这种修饰包括调节内源产物的生成(数量、相对分布等方面)或者外源表达产物的生成，以在植物中提供新颖的或者经调节的功能或产物。例如，涵盖编码这样的基因产物的异源核苷酸序列，该基因产物赋予对除草剂、盐、寒冷、干旱、病原体、线虫或昆虫的抗性或耐受性。
[0010]在另一个实施例中，提供了调苄基因在稳定转化的植物中的表达的方法，该方法包括以下步骤:(a)用包含与至少一个核苷酸序列可操作连接的本发明的启动子的DNA构建体转化植物细胞；(b)使该植物细胞在植物生长条件下生长，以及(C)从其中该连接的核苷酸序列的表达改变该植物的表型的植物细胞再生出稳定转化的植物。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1(A和B)示出了可操作连接到启动子AT-SLV3(PHP43852)的异源基因(OTS)在处于四核大配子体阶段的幼胚珠中的表达模式。表达在胚珠珠孔所在半部(micropylarhalf)处的珠被中发生，而不在胚囊中发生。图1A为透明的拟南芥胚珠的彩色微分干涉差(DIC)图像，示出了蓝色的GUS染色。图1B为使用亮场光学器件获得的相同胚珠的灰度图，靛蓝GUS晶体作为小的黑色颗粒可见。
[0012]图2(A和B)示出了可操作连接到启动子AT-SLV3(PHP43852)的异源基因(OTS)在处于八核大配子体阶 段 的胚珠中的表达模式。表达在整个胚珠的珠被中发生，不同的是合点的四分之一仅显示弱表达。现在可在胚囊中看到一些表达。图2A为透明的拟南芥胚珠的彩色DIC图像，示出了蓝色的GUS染色。图2B为使用亮场光学器件获得的相同胚珠的灰度图。
[0013]图3(A和B)示出了可操作连接到启动子AT-SLV3(PHP43852)的异源基因(CTS)在处于接合子阶段的胚珠中的表达模式。表达在胚珠珠孔所在半部处的珠被和胚囊中发生。图3A为透明的拟南芥胚珠的彩色DIC图像，示出了蓝色的⑶S染色。图3B为使用亮场光学器件获得的相同胚珠的灰度图。
[0014]图4(A和B)示出了可操作连接到启动子AT-SLV3(PHP43852)的异源基因(CTS)在处于接合子阶段的胚珠中的表达模式。表达在除珠柄之外的整个胚珠的珠被中观察到。表达在珠孔的珠被中尤其强烈。表达在胚囊内也很显著。只有珠柄未显示出表达。图4A为透明的拟南芥胚珠的彩色DIC图像，示出了蓝色的GUS染色。图4B为使用亮场光学器件获得的相同胚珠的灰度图。
[0015]图5(A和B)示出了可操作连接到启动子AT-SLV3(PHP43852)的异源基因(CTS)在处于早期球形胚阶段的胚珠中的表达模式。弱表达在除珠柄之外的整个胚珠的珠被中和胚囊内发生。图5A为透明的拟南芥胚珠的彩色DIC图像，示出了蓝色的⑶S染色。图5B为使用亮场光学器件获得的相同胚珠的灰度图。
[0016]图6(A-D)示出了包含连接到⑶S(PHP43852)的AT-SLVL3启动子的表达盒的活性。启动子AT SVL3 (AT3G20520)在大配子体发生过程(megagametogenesis)的早期显示出表达(A和B)。在四核大配子体阶段，表达最初在珠孔的内珠被和外珠被中较强，且遍布整个胚珠的珠被。通过接合子阶段(C和D)，表达强度已在珠被组织中增大。另外，胚乳和胚现在显示出弱表达。表达在珠柄中不存在。图6A和C为透明的拟南芥胚珠的彩色DIC图像，示出了蓝色的GUS染色。图6B和D为使用亮场光学器件获得的相同胚珠的灰度图。
[0017]发明详沭
[0018]本发明涉及针对植物启动子的组合物和方法以及它们的应用方法。组合物包含被称为AT SVL3的胚珠体细胞组织优选启动子的核苷酸序列。组合物还包含DNA构建体，该DNA构建体包含可操作连接至目的异源核苷酸序列的AT SVL3启动子区的核苷酸序列。具体地讲，本发明提供了包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列以及其片段、变体和互补序列的分尚的核酸分子。
[0019]本发明的AT SVL3启动子序列包括可以在植物中引发转录的核苷酸构建体。在具体的实施例中，AT SVL3启动子序列可以以组织优选方式、更具体地讲以胚珠体细胞组织优选方式引发转录。本发明的这种构建体包括与植物发育调节相关的受调节的转录起始区域。因此，本发明的组合物包括包含可操作连接到植物启动子的目的核苷酸序列的DNA构建体，该植物启动子具体地讲是胚珠体细胞组织优选启动子序列，更具体而言是拟南芥SVL3启动子序列。包含拟南芥SVL3启动子区的序列在SEQ ID NO:9中示出。
[0020] 表1
[0021]
【权利要求】
1.一种分尚的核酸分子,所述分尚的核酸分子包含选自以下的多核苷酸: (a)包含SEQID NO:9核苷酸序列的核苷酸序列； (b)包含SEQID NO:9核苷酸序列的片段或变体的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录； (C)与(a)或(b)的所述多核苷酸互补的多核苷酸。
2.一种表达盒，所述表达盒包含可操作连接到目的异源多核苷酸的权利要求1所述的多核苷酸。
3.一种载体,所述载体包含权利要求2所述的表达盒。
4.一种植物细胞,所述植物细胞包含权利要求2所述的表达盒。
5.根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述表达盒被稳定整合到所述植物细胞的基因组中。
6.根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
7.根据权利要求6所述的植物细胞，其中所述单子叶植物选自包含下列的组:玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和裸麦。
8.一种植物,所述 植物包含权利要求2所述的表达盒。
9.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
10.根据权利要求9所述的植物，其中所述单子叶植物选自包含下列的组:玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘鹿和裸麦。
11.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。
12.根据权利要求9所述的植物，其中所述双子叶植物选自包含下列的组:大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的植物，其中所述表达盒被稳定整合到所述植物的所述基因组中。
14.一种权利要求8所述的植物的转基因种子，其中所述种子包含所述表达盒。
15.根据权利要求8所述的植物，其中所述目的异源多核苷酸编码参与器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、胚发生启动、自繁殖植物和顶端分生组织发育的基因产物。
16.根据权利要求15所述的植物，其中所述基因选自:WUS、CLAVATA、Babyboom、LECdeafy cotyledon)、MYBl 15 和 MYBl 18 基因。
17.根据权利要求8所述的植物，其中所述目的异源多核苷酸编码赋予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草剂耐受性、病原体抗性或昆虫抗性的基因产物。
18.根据权利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸的表达改变所述植物的表型。
19.一种在植物或植物细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括将包含可操作连接到目的异源多核苷酸的启动子的表达盒引入到所述植物或所述植物细胞中，其中所述启动子包含选自以下的核苷酸序列: (a)包含SEQID NO:9核苷酸序列的核苷酸序列； (b)包含SEQID NO:9核苷酸序列的片段或变体的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录； (C)与(a)或(b)互补的核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述目的异源多核苷酸编码参与器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、胚发生启动、自繁殖植物和顶端分生组织发育的基因产物。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述基因选自:WUS、CLAVATA、Babyboom、LECdeafy cotyledon)、MYBl 15 和 MYBl 18 基因。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述目的异源多核苷酸编码赋予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草剂耐受性、病原体抗性或昆虫抗性的基因产物。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述目的异源多核苷酸优先在所述植物的早期胚珠体细胞组织中表达。
25.一种优先在植物的胚珠组织中表达多核苷酸的方法，所述方法包括将表达盒引入到植物细胞中并从所述植物细胞再生出植物，所述植物在其基因组中稳定掺入了所述表达盒，所述表达盒包含可操作连接到目的异源多核苷酸的启动子，其中所述启动子包含选自以下的核苷酸序列: (a)包含SEQID NO:9核苷酸序列的核苷酸序列； (b)包含SEQID NO:9核苷酸序列的片段或变体的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录； (C)与(a)或(b)互补的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述目的异源多核苷酸编码影响器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、胚发生启动、自繁殖植物和顶端分生组织发育的基因产物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述基因选自:WUS、CLAVATA、Babyboom、LECdeafy cotyledon)、MYBl 15 和 MYBl 18 基因。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述目的异源多核苷酸编码赋予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草剂耐受性、病原体抗性或昆虫抗性的基因产物。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
【文档编号】C12N15/82GK104039966SQ201280066342
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年4月12日 优先权日:2012年1月6日
【发明者】M.A.钱伯林, S.J.拉维特 申请人:先锋国际良种公司