糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法

糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法
【专利摘要】本发明提供一种以较少的使用量即可获得优异的糖化性能的糖化酶组合物以及使用了该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法。糖化酶组合物对作为基质的木质纤维素类生物质进行糖化处理。糖化酶组合物含有：不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
【专利说明】糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方 法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法。 【背景技术】
[0002] 近年来，人们正在研究将乙醇汽油（ethanol gasoline)混合燃料用作汽车燃料。 人们认为在将通过植物性物质的发酵、蒸馏而得到的生物乙醇作为所述乙醇使用时，能够 通过严密地进行土壤管理，获得所谓的碳中和效果，减轻二氧化碳的排出量，从而能够有助 于防止地球温暖化。
[0003] 然而，当例如使用甘鹿（sugarcane)、玉米等农作物作为所述植物性物质时，由于 该农作物作为乙醇的原料被大量消耗，因此存在食物或饲料的供应量减少的问题。因此，人 们在研究采用不构成食用或饲料用途的木质纤维素类（lignocellulose type)生物质作为 所述植物性物质来制造乙醇的技术。
[0004] 所述木质纤维素类生物质由于含有纤维素（cellulose)，通过使用糖化酶对该纤 维素进行糖化处理而分解成葡萄糖，使得到的葡萄糖发酵，能够获得乙醇。以往，作为这种 糖化酶，例如已知有来自高纤维素分解酶生产菌（Acremonium cellulolyticus)的纤维素 酶（Cellulase)(例如参照专利文献1)。
[0005] 由于所述糖化酶价格昂贵，在制造所述乙醇中，为了降低该糖化酶的使用量，将作 为基质的木质纤维素类生物质调制成低浓度。但是，将所述基质调制成低浓度时，制得的糖 化溶液也形成低浓度，进而对该糖化溶液进行发酵而得的乙醇也形成低浓度。其结果是，为 了浓缩制得的乙醇而对其进行蒸馏时，存在蒸馏所需时间和热能增加的问题。
[0006] 为了解决上述问题，可以考虑采用以下方法：通过将所述基质调制成高浓度并同 时增加所述糖化酶的使用量，制成高浓度的乙醇，由此降低乙醇浓缩及蒸馏等所需的能量， 从而提高整体的能量效率。然而，在这种情况下，由于所述糖化酶价格昂贵，增加其使用量 时，存在成本上升的问题。
[0007] 因此，为了解决上述问题，人们希望在维持糖化效率的同时降低糖化酶的使用量。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1 :日本专利公开2010 - 148427号公报
【发明内容】

[〇〇11] 本发明要解决的技术问题
[〇〇12] 但是，在仅仅是降低糖化酶总量的情况下，存在糖化效率与糖化酶的量成比例下 降的缺陷。
[0013] 本发明的目的在于提供一种能够解决上述缺陷并在较少的使用量下即可获得优 异糖化性能的糖化酶组合物。
[0014] 另外，本发明的目的还在于提供一种使用了所述糖化酶组合物的糖化溶液的调制 方法。
[0015] 解决技术问题的技术手段
[0016] 本发明的
【发明者】们经研究发现：从高纤维素分解酶生产菌中提取的纤维素酶 (cellulase)是一种由各种纤维素酶构成的混合物，在木质纤维素类生物质的糖化中不显 示优异效果的纤维素酶也包含其中。
[0017] 因此，仅仅是降低所述纤维素酶的混合物总量，在木质纤维素类生物质的糖化中 显示出优异效果的纤维素酶以及不显示优异效果的纤维素酶一律减少，糖化效率与糖化酶 的量成比例下降。
[0018] 本发明的
【发明者】们对所述纤维素酶的混合物中含有的各纤维素酶针对木质纤维 类生物质的糖化性能进行了各种研究。其结果是，发现由特定的纤维素酶的组合构成的糖 化酶组合物在木质纤维类生物质的糖化中显示了优异的性能，从而完成了本发明。
[0019] 即，本发明的特征在于，在对作为基质的木质纤维类生物质进行糖化处理的糖化 酶组合物中含有：不含纤维素结合结构域（cellulose binding domain)的内切葡聚糖酶 (endoglucanase)、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase)以及含 纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase)。
[0020] 这里，所述内切葡聚糖酶是将纤维素从该纤维素的内部区域水解成较为短链的 β -1，4-葡聚糖的糖化酶。另外，所述纤维二糖水解酶是将纤维素或较为短链的β -1，4-葡 聚糖从该纤维素或较为短链的β-1，4_葡聚糖的末端水解成纤维二糖（cellobiose)的糖 化酶。另外，所述β_葡萄糖苷酶是将纤维二糖水解成葡萄糖（glucose)的糖化酶。纤维 素结合结构域是指用于让糖化酶与纤维素的表面结合的结构。
[0021] 根据本发明的糖化酶组合物，首先，所述内切葡聚糖酶对木质纤维素类生物质产 生作用。由于所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域，因而不与作为基质的木质纤维素 类生物质中含有的纤维素的表面特定部位结合，而在所述纤维素的分子链的较大范围内与 不特定部位接触，从而能够产生较为短链的β -1，4-葡聚糖。
[0022] 另一方面，如果内切葡聚糖酶含有纤维素结合结构域，则该内切葡聚糖酶即使将 纤维素水解成较为短链的β-l，4-葡聚糖后，也只是停留在该水解的反应部位内。其结果 是，内切葡聚糖酶与其他的纤维素接触的机会下降，导致生成较为短链的β -1，4-葡聚糖 的效率下降。
[0023] 由于所述纤维二糖水解酶含有纤维素结合结构域，因而该纤维二糖水解酶通常 与纤维素结合，从纤维素的末端对该纤维素进行水解，生成纤维二糖。而当较为短链的 β -1，4-葡聚糖存在时，所述纤维二糖水解酶与较为短链的β -1，4-葡聚糖也发生结合，从 该β_1，4-葡聚糖的末端进行水解，产生纤维二糖。因此，通过所述内切葡聚糖酶产生较为 短链的β -1，4-葡聚糖时，所述纤维二糖水解酶的反应开始点增大，该纤维二糖水解酶促 进纤维二糖的生成。
[0024] 另外，由于所述β_葡萄糖苷酶也含有纤维素结合结构域，在所述纤维二糖水解 酶生成纤维二糖时的反应部位中，该β-葡萄糖苷酶也存在。因此，能够通过β-葡萄糖苷 酶将通过所述纤维二糖水解酶生成的纤维二糖快速地水解成葡萄糖。
[0025] 因此，根据本发明的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及 所述β-葡萄糖苷酶共同协作，对作为基质的木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖 化，由此能够提高糖化效率，用较少的使用量即可获得优异的糖化性能。
[0026] 另外，本发明的糖化酶组合物的所述葡萄糖苷酶中含有的纤维素结合结构 域，优选是相对所述纤维二糖水解酶中含有的纤维素结合结构域的氨基酸序列显示70 %以 上的同源性的氨基酸序列构成。
[0027] 纤维素结合结构域的氨基酸序列的同源性越高，与纤维素或较为短链的 β -1，4-葡聚糖的表面结合时在同一部位上结合的几率越大。因此，当采用含有氨基酸序列 具有70%以上的同源性的纤维素结合结构域的所述纤维二糖水解酶及所述β -葡萄糖苷 酶时，在该纤维二糖水解酶生成纤维二糖时，该β -葡萄糖苷酶存在于相同的反应部位中 的几率增大。
[0028] 因此，根据本发明的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及 所述葡萄糖苷酶共同协作，能够更为高效地进行糖化。
[0029] 另一方面，当所述同源性不足70 %时，所述纤维二糖水解酶和所述β -葡萄糖苷 酶无法充分地存在于相同的反应部位。
[0030] 在本发明的糖化酶组合物中，优选是所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以 及所述β -葡萄糖苷酶相对该糖化酶组合物总质量的总含量是30质量％?80质量％的范 围。
[0031] 当所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶相对所 述糖化酶组合物的总质量的总含量是80质量％以上时，所述糖化酶组合物的糖化效 率反而下降。因此，所述糖化酶组合物优选含有木聚糖酶（xylanase)等半纤维素酶 (Hemicellulase)。另外，当所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β-葡萄糖 苷酶相对所述糖化酶组合物的总质量的总含量不足30质量％时，该糖化酶组合物无法获 得足够的糖化性能。
[0032] 作为本发明的糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶，例如可以举出通过由序列号1 表示的氨基酸序列构成的糖化酶。另外，作为本发明的糖化酶组合物的所述纤维二糖水解 酶，例如可以举出通过由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶。此外，作为本发明的糖 化酶组合物的所述β -葡萄糖苷酶，例如可以举出通过由序列号3表示的氨基酸序列构成 的糖化酶。
[0033] 另外，本发明的糖化酶组合物优选是以质量比0. 2?2. 5:1:0. 2?2. 5的范围含 有所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β -葡萄糖苷酶。
[0034] 当所述内切葡聚糖酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比不足0.2时，纤维素 通过所述内切葡聚糖酶生成较为短链的β -1，4-葡聚糖时的生成速度相对较为短链的 β -1，4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维素时的生成速度过小，无法获得足够的 糖化效果。
[0035] 而另一方面，当所述内切葡聚糖酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比超过2. 5 时，纤维素通过所述内切葡聚糖酶生成较为短链的β -1，4-葡聚糖时的生成速度相对较为 短链的β -1，4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维素时的生成速度过大，无法获得 足够的糖化效果。
[0036] 另外，当所述β -葡萄糖苷酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比不足0. 2时，纤维 二糖通过所述β-葡萄糖苷酶生成葡萄糖时的生成速度相对较为短链的β-1，4-葡聚糖通 过所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的生成速度过小，无法获得足够的糖化效果。
[〇〇37] 而另一方面，当所述葡萄糖苷酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比超过 2.5时，纤维二糖通过所述β-葡萄糖苷酶生成葡萄糖时的生成速度相对较为短链的 β -1，4-葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的生成速度过大，无法获得足够 的糖化效果。
[0038] 另夕卜，本发明的糖化酶组合物可以进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶 (xylosidase)。通过含有木聚糖酶或木糖苷酶，所述糖化酶组合物能够将作为基质的木质 纤维素类生物质中含有的半纤维素糖化，从而获得木糖（xylose)。因此，能够提升作为基质 的木质纤维素类生物质的糖化率。
[0039] 另外，本发明的糖化溶液的配制方法是在作为基质的木质纤维素类生物质中添加 糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖 化溶液，该糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中，至少同时添加作为所述糖化酶 的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含 纤维素结合结构域的β_葡萄糖苷酶。
[0040] 像这样同时添加糖化酶时，首先所述内切葡聚糖酶与木质纤维素类生物质中含有 的纤维素发生作用。由于所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域，在被添加到所述基质 中时，不与所述纤维素的表面的特定部位结合，而在该纤维素的分子链的较大范围内与不 特定部位接触，生成较为短链的β -1，4-葡聚糖。
[0041] 由于所述纤维二糖水解酶含纤维素结合结构域，因而该纤维二糖水解酶通常与纤 维素结合，对该纤维素从该纤维素的末端进行水解，从而生成纤维二糖。而当较为短链的 β -1，4-葡聚糖存在时，所述纤维二糖水解酶与较为短链的β -1，4-葡聚糖也发生结合，从 该β-1，4-葡聚糖的末端进行水解，生成纤维二糖。因此，通过所述内切葡聚糖酶产生较为 短链的β -1，4-葡聚糖时，所述纤维二糖水解酶的反应开始点增大，该纤维二糖水解酶促 进纤维二糖的生成。
[〇〇42] 另外，由于β_葡萄糖苷酶也含纤维素结合结构域，在所述纤维二糖水解酶生成 纤维二糖时的反应部位中，该葡萄糖苷酶也同时存在。所以，能够通过葡萄糖苷酶 将通过所述纤维二糖水解酶生成的纤维二糖快速地水解成葡萄糖。
[〇〇43] 根据本发明的糖化溶液的配制方法，由于所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解 酶和所述β -葡萄糖苷酶共同协作，对木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，因 此能够高效地制得糖浓度较高的糖化溶液。
[0044] 另外，本发明的糖化溶液的配制方法是在作为基质的木质纤维素类生物质中添加 糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖 化溶液，该糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中至少添加作为所述糖化酶的不 含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶后，至少添加含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶 以及含纤维素结合结构域的β_葡萄糖苷酶。
[〇〇45] 像这样在先添加所述内切葡聚糖酶时，所述纤维二糖水解酶以及所述β -葡萄糖 苷酶不存在于所述内切葡聚糖酶的反应部位中。因此，由于先被添加的所述内切葡聚糖酶 相对纤维素的分子链能够高效地进行接触，能够优先对木质纤维素类生物质中含有的纤维 素进行水解，从而生成较为短链的β-1，4-葡聚糖。
[0046] 这样，与同时添加所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄 糖苷酶的情形相比，在添加所述纤维二糖水解酶和所述β -葡萄糖苷酶时，较为短链 的β-1，4-葡聚糖的数量增加。因此，所述内切葡聚糖酶能够简单地将所述较为短链的 β -1，4-葡聚糖水解成纤维二糖。
[〇〇47] 另外，所述β_葡萄糖苷酶因纤维素结合结构域的作用而存在于基于所述纤维二 糖水解酶的水解的反应部位中，因此能够高效地对所述纤维二糖进行水解，从而生成葡萄 糖。
[〇〇48] 因此，根据本发明的糖化溶液，通过先添加所述内切葡聚糖酶，然后添加所述纤维 二糖水解酶和所述β -葡萄糖苷酶，能够进一步高效地制成糖浓度高的糖化溶液。 【专利附图】

【附图说明】
[0049] 图1是表示本发明的糖化溶液的配制方法的一个实施方式的流程图。
[0050] 图2是表示能够提取本发明的糖化酶组合物的菌株的菌落直径和AZCL晕直径的 图表。
[0051] 图3是表示能够提取本发明的糖化酶组合物的菌株的CMC分解活性的图表。
[0052] 图4是表示本发明的糖化酶的糖化性能的图表。
[0053] 图5是表示相对本发明的糖化酶组合物总质量的含量对葡萄糖生成产生的影响 的研究结果的图表。
[0054] 图6是表示本发明的糖化酶组合物中的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β -葡萄 糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶（β-xylosidase)的质量比对糖生成产生的影响的研 究结果的图表。 【具体实施方式】
[0055] 接着，参照附图就本发明的实施方式进行进一步详细说明。
[0056] 图1中表示使用作为基质的木质纤维素类生物质制造乙醇时的糖化处理步骤。
[0057] 在上述糖化处理中，首先，对作为基质的木质纤维素类生物质中的一种的稻杆进 行粗粉碎，将氨水混合到被粗粉碎的稻杆中，制成含稻杆和氨的基质混合物。这里，所述氨 水的浓度范围是20质量/体积％?30质量/体积％。所述基质混合物优选是相对所述氨 水含有20质量％?70质量％范围的稻杆。
[0058] 接着，在25°C?100°C范围的温度下，将制成的所述基质混合物保持2小时?200 小时范围，实施糖化前处理。其结果是，木质素（lignin)从作为所述基质的稻杆中解离或 者稻杆湿润膨胀，从而获得含氨糖化前处理物。
[0059] 另外，在本实施方式中，解离是指与纤维素等结合的木质素的结合部位中，至少一 部分结合被切断的现象。另外，湿润膨胀是指构成结晶性纤维素的纤维素等因液体侵入而 产生空隙、或者在纤维素纤维内部产生空隙而膨胀的现象。
[0060] 然后，从所述含氨糖化前处理物中释放出氨，将氨分离，从而制得氨分离糖化前处 理物。接着，将氨分离糖化前处理物的pH调整到糖化酶能够起作用的范围，例如PH3?PH7 的范围。
[0061] 接着，向所述被调整了 pH的所述氨分离糖化前处理物中添加糖化酶，调制基质和 糖化酶混合物，并将该基质和糖化酶混合物在30°C?60°C温度范围内保持50小时?150 小时，进行糖化处理。通过所述糖化处理，所述基质和糖化酶混合物中含有的纤维素因所述 糖化酶的作用被水解。其结果是，能够得到含葡萄糖等糖的糖化溶液。
[〇〇62] 这里，在本实施方式的糖化溶液的配制方法中，采用下述糖化酶组合物作为所述 糖化酶。该糖化酶组合物含有不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构 域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
[〇〇63] 本实施方式中使用的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述β -葡萄 糖苷酶例如可以通过下述方法制得。
[0064] 首先，作为变异前培养步骤，将高纤维素分解酶生产菌（acremonium cellulolyticus)TN菌株（独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号： FERM-BP-685,以下简记作"TN菌株"）植菌到具有表1中所示组成的培养液中，在30°C下培 养一晚。接着，作为变异处理步骤，将上述培养后的TN菌株涂敷到具有表2中所示组成的 固体培养基的表面上，通过照射紫外线，获得变异处理菌株。然后，作为变异后培养步骤，在 30°C温度下培养所述变异处理菌株7天。
[0065] (表 1)
【权利要求】
1. 一种糖化酶组合物，其对作为基质的木质纤维类生物质进行糖化处理，该糖化酶组 合物的特征在于，含有：不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤 维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
2. 根据权利要求1所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述β -葡萄糖苷酶中含有的纤 维素结合结构域由相对所述纤维二糖水解酶中含有的纤维素结合结构域的氨基酸序列、显 示了 70%以上的同源性的氨基酸序列构成。
3. 根据权利要求2所述的糖化酶组合物，其特征在于，该糖化酶组合物进一步含有木 聚糖酶或木糖苷酶。
4. 根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶是由序列 号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
5. 根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述纤维二糖水解酶是由序 列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
6. 根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述β -葡萄糖苷酶是由序 列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
7. 根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶是由序列 号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶，所述纤维二糖水解酶是由序列号2表示的氨基酸序 列构成的糖化酶，所述β-葡萄糖苷酶是由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。
8. 根据权利要求7所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶、所述纤维 二糖水解酶以及所述β -葡萄糖苷酶的总含量相对所述糖化酶组合物的总质量为30质 量％?80质量％的范围。
9. 根据权利要求8所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述糖化酶组合物以0. 2? 2. 5:1:0. 2?2. 5的质量比范围含有所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述 β-葡萄糖苷酶。
10. -种糖化溶液的配制方法，在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成 基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液， 所述糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中，至少同时添加作为所述糖化酶 的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含 纤维素结合结构域的β_葡萄糖苷酶。
11. 一种糖化溶液的配制方法，在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成 基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液， 所述糖化溶液的配制方法的特征在于：在所述基质中，至少添加作为所述糖化酶的不 含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶后，至少添加含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶 以及含纤维素结合结构域的β-葡萄糖苷酶。
【文档编号】C12N9/42GK104093832SQ201280066298
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年1月6日
【发明者】福浦麻衣子, 光泽茂信, 竹田汀, 荒武, 柴田大辅 申请人:本田技研工业株式会社