一种可生物降解的固定化酶及其制备方法

一种可生物降解的固定化酶及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种固定化酶和包括一种具有支撑材料的交联酶的固定化酶材料，所述支撑材料包括不同于最初所述酶来源的生物质的生物质材料。优选的，所述固定化酶还包括一种聚合材料和/或最初取得所述酶的生物质，所得到的固定化酶材料可以是可生物降解的。本发明还公开了制备和使用所公开的固定化酶材料的方法。
【专利说明】-种可生物降解的固定化酶及其制备方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请涉及并且要求申请日为2011年11月11日，申请号为61/558, 758的美国 临时专利申请的优先权。

【技术领域】
[0003] 要求保护的技术总体上涉及诸如酶的生物催化剂，尤其涉及酶的固定化。

【背景技术】
[0004] 业已发现了固定化的生物催化剂在需要特殊化学转化的多种行业中的应用。食品 和制药行业的特大规模的实施例包括用于将葡萄糖转化成果糖的固定化的葡萄糖异构酶 和用于制备青霉素衍生物的固定化的青霉素酰化酶。固定化酶可用于大规模生物修复，如 降解不需要的化合物。另一种用途涉及用于诊断反应的小规模固定化酶，其中，所述生物催 化剂能促进产生可检测的化学成分或其他化学变化的化学反应。将来很可能开发出固定化 酶的更多用途。
[0005] 相对存在于溶液中的生物催化剂，例如那些以液体形式提供或是以需要溶解的干 燥形式提供的生物催化剂，固定化的生物催化剂（酶）具有诸多优点。固定化酶可以方便 地从液体中分离，因此可以再利用这些酶，从而降低所述酶在制备产品中的成本。在上文引 用的两个实施例中，固定化酶被用于填充柱中，泵送反应溶液通过填充柱，当所述溶液离开 时，需要的化学反应完成。在该过程中，所述酶以高浓度被多次使用，以实现对所述酶的有 效利用。
[0006] 除了便于分离之外，固定化酶还具有其他潜在优点，包括在储存和使用期间的更 高的热稳定性和pH稳定性等。与溶液中的酶相比，固定化的生物催化剂在各种溶剂中还具 有更高的活性。其物理形态通常具有优点，因为固定化的生物催化剂能够以颗粒形式提供， 它减少了粉尘，并且改善了产品的操控性。与干燥的酶类似，单位质量的固定化酶的活性可 以根据特定用途的需要而改变。
[0007] 固定化酶可以由与固体基质结合的酶材料组成，所述酶通过化学或物理方式与所 述固体基质结合或固定。所述酶可以结合在所述基质表面，或者如果所述基质的孔隙足以 允许底物扩散，则所述酶可以分布在所述基质中。多种用于生物催化剂的固定化方法被提 出，包括将所述酶包埋在凝胶中，通过共价，疏水，静电，和其他方法将所述酶结合在无机或 有机固体上。所述酶与全细胞，酶晶体等的交联可以通过使用诸如戊二醛（GA)和聚氮丙啶 (PEI)的试剂实现。
[0008] 生物催化剂转化成固定化形式可能需要更多的处理，因此可能会提高这种酶形式 的生产成本。任何增加的成本都必须通过提高生产率，货架期，在溶剂中使用或某些其他优 点来补偿。因此，固定化的成本是生产固定化酶时的一个重要考虑因素。因此，较低的固定 化成本可实现固定化酶的更经济的利用。
[0009] 在所提出的用于酶固定化的方法中，交联全细胞的使用是成本效益最高的方法之 一。该方法所使用的全细胞是用于制备所述酶的微生物，因此，能够零成本使用，或者如果 存在与处理所述细胞物质相关的成本的话甚至为负成本。
[0010] 业已提出了多种酶固定化的方法，包括结合在二氧化硅支撑材料上。该方法涉及 微生物发酵，以便生产所述酶，从所述生物质中分离（或纯化）所述酶，将所述酶化学结合 或包埋在所述基质中，以及生产最终形式的产品。所述固定化的缺陷是会产生结合所述酶 的所述基质的成本。从发酵生物质中进一步分离所述酶会产生某些酶和酶活性的损失，以 及相关的纯化处理成本。通过直接利用用于生产所述酶的生物质固定所述酶可以克服这些 缺陷。
[0011] 某些酶底物在水中具有有限的溶解度，而在有机溶剂或有机溶剂与水的混合物中 具有更好的溶解度。例如，由于上述特性，有机溶剂溶液通常被用于清洗有机磷化合物或有 机溶剂被用于甘油三酸酯的处理。可溶性酶在有机溶剂或混合物中通常是失活的或是惰性 的；不过，与可溶性酶相比，固定化酶能够保持一些活性。因此，固定化酶在这样的溶剂中能 够与更高浓度的它们的底物起反应。
[0012] 固定化酶的应用可能需要在使用之后处理所述酶。例如，用于塔式反应器的固定 化酶在使用之后需要处理。另外，也有一些固定化酶可以考虑在环境中直接利用。例如，固 定化的0ΡΗ酶可以分散在农田中，以便对农药或其他有机磷化合物进行降解。


【发明内容】

[0013] 在随后的权利要求书中提出了要求保护的技术，而下面的说明不是要以任何方式 限定、确定或以区域方式界定法律保护的范围。一般来说，所公开的技术涉及固定化酶和生 产这种酶的方法。
[0014] 所公开的技术的一个方面提供了多种固定化酶，这些酶利用一种或多种生物材料 作为支撑基质的成分。因此，所公开的技术降低了成本并且简化了生产。有利的是，所述 固定化酶稳定并且能够在多种条件下工作，特别是在存在多种溶剂的条件下，在各种pH值 下，以及在大田中所遭遇的温度下工作。在某些场合下，所述固定化酶和固定化酶材料还是 可生物降解的。本发明提供了特殊的固定化酶，它们能够将有机磷酸盐和相关的有毒材料 转化成危害较小/无害材料，并且能够选择性地为生物降解，以便进一步影响并简化修复 工作。本发明还提供了用于制备和使用所述固定化酶的方法。
[0015] 总之，本发明所公开的技术提供了一种固定化酶材料。所述材料可以是固定化的 有机磷降解酶材料。所述酶材料可以包括具有支撑基质的交联酶，所述支撑基质包括生物 材料。所述生物材料可以是不同于所述酶来源的生物质（Biomass materials)。所述交联 酶可以通过让所述酶与至少两种多功能材料反应生成。
[0016] 可用于所公开的技术的固定化酶中的酶包括，但不局限于，选自下列一组类型的 酶：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。可以使用有机磷降解酶，如有机 磷水解酶（0ΡΗ)，有机磷酸酐水解酶（0ΡΑΑ)，二异丙基氟磷酸酶（DFPase)等。还可以使用 诸如乳糖酶，葡萄糖异构酶，过氧化物酶，醇脱氢酶，木聚糖酶，丙酮酸脱羧酶，过氧化氢酶， 转化酶，肌醇六磷酸酶，淀粉葡萄糖苷酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等的酶。与游离的 酶相比，所公开的技术中的固定化酶改善了对的温度的稳定性。优选的，所公开的技术适 应并用于两种或两种以上酶的组合。因此，所公开的技术提供了低成本酶产品的可能性，其 中，所述酶可以是有机磷水解酶和/或其他酶。所述产品可用于分解有机磷化合物，以及用 于其他化学转化。所公开的技术提供了一种酶产品，该产品在储存和使用条件下都是稳定 的。另外，所公开的技术提供了一种酶产品，其中，所述酶在一些溶剂中是有活性的，在所述 溶剂中某些有机磷化合物的溶解度更高或在所述溶剂中可进行其他化学转化。另外，所公 开的技术提供了多种固定化酶产品，用于有机磷分解以及其他酶用途，这些用途需要对所 述酶进行处理或留在环境中分解。所述产品是适合生物降解的。
[0017] 在所公开的技术中，与游离的酶相比，所述固定化酶材料可以在实质上更宽的pH 范围内起作用，在存在多种溶剂的条件下，以及与游离的酶相比，在更高的温度下起作用。
[0018] 被用于所述支撑材料的生物质可以包括不同于所述酶来源的生物质的生物质。在 这点上，它可以包括不同于所述酶来源的生物质的生物质和与所述酶来源的生物质相同的 生物质的组合，只要至少某些所述生物质不同于所述酶来源的生物质即可。
[0019] 使用不同于所述酶来源的生物质的生物质具有优势。在这点上，一个好处是不同 于所述酶来源的生物质的生物质可能是废产物，换句话说废物必须要进行处理。另一个优 点是，生物质的特性可以根据固定化酶的预期用途进行选择。例如，所述固定化酶可以制成 生物可降解的形式。当所述固定化酶被用于清除环境灾难时该特征是有用的，所述灾难包 括某些形式的农药和化学战剂，并可用于生产用途，其中，随后必须处理所述固定化酶。例 如，处理被有机磷农药污染的农田，可以通过将生物可降解形式的固定化酶喷洒在田面上 排除污染。一旦降解完成，所述生物可降解的固定化酶只需随着时间的推移而降解，因此无 需进一步清除/排除。在某些实施例中，最终固定化酶材料的物理特性可以通过生物质的 选择进行改良。例如，可以使所述材料具有更高或更低的刚性，以提高其对各种反应器构造 的适应性。刚性更高的颗粒适用于填充床反应器构造。类似地，固定化酶材料特性，如孔隙 度，疏水性和溶解度也可以通过生物质的选择改良，以适应特定反应条件。一般，与局限于 用于制备所述酶的生物质的特性的全细胞固定化相比，采用不同于所述酶来源的生物质的 额外生物质，提供了特别适应所述固定化酶材料的额外选项。
[0020] 合适的支撑材料具有多个能够与所述交联材料反应的胺基或其他官能团。支撑 材料可以包括一种或多种生物质，如几丁质，黑曲霉（Aspergillus niger)细胞和羊毛 等。一种类型的合适的生物质具有多个能够与所述交联材料反应的官能团。业已使用了 含有氨基的生物质，例如聚胺。所述合适的生物质支撑材料的实施例包括，但不局限于，黑 曲霉（Aspergillus niger)细胞，酵母细胞，纤维素，葡聚糖，淀粉琼脂（starch agar，）， 藻酸盐（alginate),卡拉胶（carrageenans),胶原，明胶，白蛋白（albumin)和铁蛋白 (ferritin)。其他生物质，如棉和羊毛可选择性地使用，只要提供了至少某些具有多个 官能团的支撑材料以支撑交联。支撑材料还可以包括合成和/或聚合材料，如聚氮丙啶 (polyethylenimine)，壳多糖（chitosan)，聚批咯（polypyrrole)，或其他合适材料。优选 的，所述支撑材料包括一种或多种生物质和/或一种或多种聚合支撑材料的组合。合适的 聚合支撑材料可以包括聚胺，例如，聚氮丙啶，聚吡咯，蛋白，明胶等。一般来说，合适的生物 质可以包括一般没有官能团并且最低限度参与所述交联结构的生物质，具有多个参与必要 交联的官能团的生物质及其组合。合适的交联材料包括能够与所述支撑材料反应的多官能 团。
[0021] 合适的交联材料还可以包括能够与所述支撑材料反应的多官能团，例如，戊二醛， 二醛，有机二羧酸，辛二酸二琥珀酰亚胺，庚二亚氨酸二甲酯，二亚胺代己二酸二甲酯，氰尿 酰氯，琥珀酸，六亚甲基二异氰酸酯等。还可以使用能够与胺交联的其他试剂。
[0022] 优选的，利用生物质作为支撑基质的固定化酶为可生物降解的。在其他实施例中， 所述生物质是不可溶解的。因此，所公开的技术的固定化酶可以是可生物降解的。合适的可 生物降解的支撑材料包括，但不局限于，处理过或未处理过的外骨骼（矿物质或有机物）， 骨骼，几丁质（可溶的或不可溶的）和黑曲霉细胞等。
[0023] 在所述固定化酶被用于对环境开放的大面积区域的用途中，所述固定化酶如果是 可生物降解的将是有利的。因此，在所公开的技术的具体实施例中，所述固定化酶是可生物 降解的，可用于需要处理的多种酶或分散在环境中的酶。
[0024] 所述固定化酶材料还可以包括溶剂。该溶剂可以是适合要溶解转化的材料的溶 齐U。溶剂可以包括，但不局限于，己烧，甲苯，甲醇，二甲基亚砜等。与所述游离的酶相比，所 述固定化酶可表现出改良的温度稳定性。
[0025] 大体上，所公开的技术还提供了一种用于制备固定化酶材料的方法。在一个实施 例中，所述方法包括以下步骤：提供一种酶，一种支撑材料和一种交联材料，并且将所述支 撑材料和所述交联材料与所述酶的水悬浮液混合。所述材料能够以任意顺序混合；在某些 场合下，所述支撑材料在先于所述交联材料添加，而在其他场合下，所述交联材料在先于所 述支撑材料添加，以使活性最大化。所述混合材料的步骤可适当形成絮凝产物。所述产物 可直接使用或根据预期的用途进行分离、干燥、并且制成具有所需大小和形状的颗粒。所述 支撑材料可以包括一种生物质支撑材料。还可以额外提供除生物质支撑材料之外的支撑材 料，并且加入所述酶的水悬浮液中。优选的，所述交联材料提供在合适的溶剂中，如水，酒 精，DMS0等。
[0026] 由此生产的所述固定化酶材料可经受较高温度处理。与未经较高温度处理的类似 固定化酶相比，经受较高温度处理的所述固定化酶一般可提高所述固定化酶的活性。
[0027] 大体上，所公开的技术还提供了一种利用所述固定化酶材料转化对酶转化敏感的 材料的方法。所述固定化酶材料能够以可生物降解的形式提供。在一个实施例中，所述方法 包括提供所述固定化酶材料，其中，所述酶为适合接触所述对酶转化敏感的材料并且适合 实现所希望的转化的形式，以及让所述固定化酶材料与所述对酶转化敏感的材料接触。在 某些实施例中，所述接触包括将所述对酶转化敏感的材料溶解在一种溶剂中，以便形成溶 液，并且让所述固定化酶材料与所述溶液接触。在涉及环境修复的用途中，接触可能包括将 所述固定化酶材料分散在土壤中，并且根据土壤中的湿度起着溶剂的作用，溶解所述对酶 转化敏感的材料。在其他实施例中，当所述对酶转化敏感的材料不可溶于水或无水可用时， 就需要提供一种溶剂。在其他实施例中，所述希望的转化可以在塔，容器，或其他反应器中 进行，在这里，所述固定化酶材料和所述对酶转化敏感的材料与一种溶剂混合，所述对酶转 化敏感的材料在所述溶剂中至少具有一定的溶解度。在某些实施方案中，所述转化包括将 一种选自农药，化学战剂和神经毒剂等的材料转化或降解成低毒/无害成分。一般来说，所 述转化可以是分解成低毒/无害成分或转化成需要的化合物。
[0028] 本发明的第一方面是提供固定化的有机磷降解酶。在一个实施例中，交联的有 机磷降解酶（0DE)表现为通过让0ΡΗ与支撑材料和交联材料起反应形成的有机磷水解酶 (0ΡΗ)，而在其他实施例中，可以使用其他0DE。合适的支撑材料选择性具有多个胺基。支撑 材料可以包括生物质，如几丁质，黑曲霉细胞和羊毛等。另外，支撑材料可以是聚胺，如聚氮 丙啶，聚吡咯，蛋白，明胶等。合适的交联材料可以包括能够与所述支撑材料反应的多官能 团，例如，戊二醛，辛二酸二琥珀酰亚胺，庚二亚氨酸二甲酯等。
[0029] 在另一个实施例中，所述交联的0ΡΗ材料可以包含包括生物质的支撑基质。所述 生物质可以是用于生产所述0ΡΗ的生物质，另一种生物质，或其组合。生物质构成的合适的 支撑材料的例子包括，但不局限于几丁质，黑曲霉细胞和羊毛等。固定化酶利用生物质作为 支撑基质，并且所述支撑材料优选为可生物降解的。在其他实施例中，所述生物质是不可溶 解的。
[0030] 在另一个实施例中，所述交联的0ΡΗ材料还可以包括一种溶剂，优选的，所述溶剂 为具有适合溶解需要转化的材料的溶剂。溶剂可以包括，但不局限于己烷，甲苯，甲醇，二甲 基亚砜等。与所述游离的酶相比，所述固定化的0ΡΗ酶具有改善的温度稳定性。
[0031] 本发明的另一方面包括具有一种支撑基质的固定化酶，所述支撑基质包括不同于 所述酶来源的生物质的生物质。在这样一个实施例中，所述固定化酶可以是通过让一种酶 与一种支撑材料和一种交联材料起反应形成的，其中，所述支撑材料包括一种生物质。所使 用的生物质可以包括不同于所述酶来源的生物质的生物质，与所述酶来源相同的生物质， 或其组合，只要至少某些所述生物质不同于所述酶来源的生物质即可。一种类型的合适的 生物质具有能够与所述交联材料反应的多个官能团。业已使用了含有氨基的生物质，例如， 聚胺。所述合适的生物质支撑材料的实施例包括，但不局限于黑曲霉细胞，酵母细胞，纤维 素，葡聚糖，淀粉琼脂，藻酸盐，卡拉胶，胶原，明胶，白蛋白和铁蛋白。其他生物质，如棉和羊 毛可选择性使用，只要提供了至少某些具有多个官能团的支撑材料以支撑交联即可。合适 的支撑材料还可以包括聚胺，例如，聚氮丙啶，聚吡咯，蛋白，明胶等。合适的交联材料可以 包括能够与所述支撑材料反应的多官能团。适合与含有胺的支撑材料起反应的交联材料可 以包括戊二醛，辛二酸二琥珀酰亚胺，庚二亚氨酸二甲酯等。可以参入所述固定化酶的酶的 某些实施例包括选自下列一组的类型的酶：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶， 和连接酶。与所述游离的酶相比，上述固定化酶可能具有改善的温度稳定性。
[0032] 本发明的另一方面包括可生物降解的固定化酶。所述可生物降解的酶包括具有 支撑基质的交联酶，所述支撑基质来自包括生物质和交联材料的支撑材料。合适的生物质 支撑材料选择性具有能够与所述交联材料反应的多个官能团。业已使用了含有氨基的某 些生物质，例如，聚胺。在其他实施例中，根据需要，所使用的生物质是可溶于水或不可溶 于水的。所述合适的生物质支撑材料的其他实施例包括，但不局限于黑曲霉细胞或其他 细菌细胞材料，酵母细胞或其他真菌细胞材料，纤维素，葡聚糖，淀粉琼脂，藻酸盐，卡拉胶 (carrageenans)，胶原，明胶，白蛋白，和铁蛋白。其他生物质，如棉和羊毛可选择性使用。合 适的交联材料可选择性包括能够与所述支撑材料反应的多官能团。在其他实施例中，可以 使用杂官能的交联材料，就是说交联材料包括两种或两种以上不同的官能团。某些适合与 含有胺的支撑材料起反应的交联材料可以包括戊二醛，辛二酸二琥珀酰亚胺，庚二亚氨酸 二甲酯等。可以掺入所述固定化酶的某些酶包括选自下列一组的类型的酶：氧化还原酶，转 移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。与游离的酶相比，所述生物可降解的固定化酶可能 具有改善的温度稳定性。
[0033] 本发明的另一方面涉及一种制备固定化酶的方法，其中，所述支撑材料的至少一 部分是生物质。在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：提供一种酶，一种生物质支撑材 料和一种交联材料，将所述生物质支撑材料和所述交联材料添加到所述酶的水悬浮液中， 搅拌以形成絮凝物。水悬浮液可以包括含有至少某些水的任何悬浮液。还可以提供除了生 物质支撑材料之外的生物质，并且添加到所述酶的水悬浮液中。支撑材料还可以包括选自 下列一组的聚胺：聚氮丙啶，聚吡咯，聚乙烯亚胺；聚氮丙啶（例如，聚二乙撑三胺，聚三乙 撑四胺，聚五乙撑六胺或聚六亚甲基二胺）；聚亚甲基二环己基胺；聚亚甲基双苯胺；聚四 乙基五胺；聚苯二胺，两种或两种以上所述聚胺化合物的混合物等。另一个实施例包括一种 制备生物可降解的固定化酶的方法，该方法包括以下步骤：提供一种或多种可生物降解的 支撑材料和交联剂。合适的可生物降解的支撑材料包括，但不局限于处理过的（通过研磨， 粉碎，或其他机械方法）或未处理过的外骨骼（矿物质或有机物），骨骼，几丁质（可溶的 或不可溶的）和黑曲霉细胞等。合适的交联材料包括，但不局限于戊二醛，二醛，有机二酸， 辛二酸二琥珀酰亚胺，和庚二亚氨酸二甲酯，多官能醛，多官能有机卤化物，多官能酸酐，多 官能偶氮化合物，多官能异硫氰酸盐，多官能异氰酸盐，两种或两种以上所述胺反应材料的 混合物，丁二醛，对苯二甲醛，双-重氮对二氨基联苯-2, 2' -二磺酸，4,4' -二氟-3, 3' -二 硝基二苯讽，二苯基_4,4' -二硫氛酸_2, 2' -二横酸醋，3_甲氧基-二苯甲烧_4,4' -二异 氰酸酯，甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸酯，甲苯-2, -4-二异硫氰酸酯，重氮对二氨基联苯， 重氮对二氨基联苯-3, 3' -邻联茴香胺，Ν，Ν' -环已烷二碘代乙酰胺，六亚甲基二异氰酸酯， 氰尿酰氯，1，5-二氟-2,4-二硝基苯，两种或两种以上所述胺反应材料的混合物等。所述 交联材料科选择性地提供在合适的溶剂中，如水，酒精，DMSO等。所述方法可用于生产选自 下列一组的类型的固定化酶：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，和连接酶。与未 进行较高温度处理的类似的固定化酶相比，在分离之后对所述固定化酶进行较高温度的处 理，可提供所述固定化酶活性。
[0034] 本发明的另一方面涉及一种利用可生物降解的酶转化对酶转化敏感的材料的方 法。在这样一个实施例中，所述方法涉及提供一种可生物降解的酶，其中，所述酶为适合接 触所述对酶转化敏感的材料并且适合实现所希望的转化的形式，并且让所述生物可降解的 固定化酶与所述对酶转化敏感的材料接触。所述接触选择性包括将所述对酶转化敏感的 材料溶解在一种溶剂中，以便形成溶液，并且让所述可生物降解的固定化酶与所述溶液接 触。在涉及环境修复的用途中，接触可能包括将所述生物可降解的固定化酶材料分散在土 壤中，并且根据土壤中的湿度起着溶剂的作用，溶解所述对酶转化敏感的材料。在其他实施 例中，当所述对酶转化敏感的材料不可溶于水或无水可用时，就需要提供一种溶剂。
[0035] 特别是，有机磷化合物是有效的神经毒素，常被用作农药，杀虫剂和化学战剂。尽 管将有机磷酸盐用作化学战剂业已受到国际条约的限制；将这些化合物用作农业和家庭虫 害防治引起了关注土壤和水系的污染，以及被污染设备和容器的修复的法律关注。很多有 机磷酸盐可以用化学去污剂分解，如氢氧化钠，氢氧化钾，次氯酸盐，和过氧化氢或可以用 去污剂和水处理一个区域以排除污染。尽管上述每一种方法在处理污染方面都在一定程度 上是有效的，但在应用时还存在必须考虑的其他问题。例如，其中的某些材料本质上是腐蚀 性的，并且来自所述处理的所有废物必须做完有害废物处理。
[0036] 为了保持化学处理的效果并改进处理方法的废物处理特征，考虑过利用有机磷解 酶（0DE)对有机磷酸盐进行去污。0DE是一种类型酶的统称，用于表示能够催化多种有机 磷酸三酯环绕有机磷氟化物的水解作用的酶。业已证实芳二烷基磷酸酶（E. C. 3. 1. 8. 1)和 二异丙基-氟磷酸酶（E. G. 3. 1. 8. 2)能够裂解P-0, P-F，P-S，P-CN键，使其能够与多种有 机磷农药起反应，如：乙酰甲胺磷，蝇毒磷，内吸磷，二嗪农，毒死蜱，马拉硫磷，对氧磷，对硫 磷，甲基对氧磷，和甲基对硫磷；以及化学战剂，包括：沙林，索曼和VX。
[0037] 在其他实施例中，希望的转化可以在塔，反应床，容器，或其他反应器中进行，在这 里，所述可生物降解的固定化酶和所述对酶转化敏感的材料与一种溶剂混合，所述对酶转 化敏感的材料在该溶剂中具有至少一定的溶解度。在上述两个实施例中，与游离的酶相比， 所述生物可降解的固定化酶可以在存在多种溶剂的条件下，在相当宽的pH范围内起作用， 以及与游离的酶相比，在更高的温度下起作用。合适的溶剂的例子包括，但不局限于己烷， 甲苯，甲醇，二甲基亚砜等。
[0038] 通过本文所提供的说明书、附图和权利要求书，可以了解所公开的技术其他目的， 实施方案，形式，效果，方面，特征和优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 图1是表示细胞悬浮液中的0ΡΗ酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
[0040] 图2是表示固定化形式的0ΡΗ酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
[0041] 图3是表示细胞悬浮液中的和固定化形式的具有不同粒度的0ΡΗ酶在接受52. 5°C 温度处理4小时之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
[0042] 图4是表示悬浮在甲醇溶液中的细胞悬浮液中的0ΡΗ的吸收率与时间关系的曲线 图。
[0043] 图5是表示悬浮在甲醇溶液中的固定化形式的0ΡΗ的吸收率与时间关系的曲线 图。
[0044] 图6是表示悬浮在甲醇溶液中的具有不同粒度固定化形式的0ΡΗ的吸收率与时间 关系的曲线图。
[0045] 图7Α是表示细胞悬浮液中的0ΡΗ在接受65°C温度处理不同时间之后的吸收率与 时间数据关系的曲线图。
[0046] 图7B是表示固定化形式的0ΡΗ在接受65°C温度处理不同时间之后的吸收率与时 间数据关系的曲线图。
[0047] 图8是表示可溶性0ΡΗ酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
[0048] 图9是表示固定化形式的0ΡΗ酶的吸收率与时间数据关系的曲线图。
[0049] 图10是表示悬浮在10%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的0ΡΗ的吸收率与时间数据 关系的曲线图。
[0050] 图11是表示悬浮在20%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的0ΡΗ的吸收率与时间数据 关系的曲线图。
[0051] 图12是表示悬浮在30%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的0ΡΗ的吸收率与时间数据 关系的曲线图。
[0052] 图13是表示悬浮在40%甲醇溶液中的细胞悬浮液中的0ΡΗ的吸收率与时间数据 关系的曲线图。
[0053] 图14是表示悬浮在10%甲醇溶液中的固定化的0ΡΗ的吸收率与时间关系的曲线 图。
[0054] 图15是表示悬浮在20%甲醇溶液中的固定化的ΟΡΗ的吸收率与时间关系的曲线 图。
[0055] 图16是表示悬浮在30%甲醇溶液中的固定化的0ΡΗ的吸收率与时间关系的曲线 图。
[0056] 图17是表示悬浮在40%甲醇溶液中的固定化的0ΡΗ的吸收率与时间关系的曲线 图。
[0057] 图18是表示相对其在无溶剂溶液中的活性，游离0ΡΗ酶的活性随接触乙二醇溶液 的时间变化的曲线图。
[0058] 图19是表示相对其在无溶剂溶液中的活性，0ΡΗ酶的0ΡΗ-7固定化形式的活性随 接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
[0059] 图20是表示相对其在无溶剂溶液中的活性，0ΡΗ酶的0ΡΗ-14固定化形式的活性 随接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
[0060] 图21是表示相对其在无溶剂溶液中的活性，0ΡΗ酶的0ΡΗ-15固定化形式的活性 随接触乙二醇溶液的时间变化的曲线图。
[0061] 图22Α是表示干燥晶体形式的或悬浮在缓冲液中的游离的Ρ0在接受65°C温度处 理不同时间之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。
[0062] 图22B是表示干燥粉末形式的或悬浮在缓冲液中的固定化形式的P0在接受65°C 温度处理不同时间之后的吸收率与时间数据关系的曲线图。

【具体实施方式】
[0063] 为了帮助理解所公开的技术的原理并且提供目前所理解的最佳实施方式，参见在 附图中示出的实施方案，并且用特定语言说明这些实施方案。然而，应当理解的是，不是要 以这种方式限定所公开的技术的范围，所公开的【技术领域】的相关技术人员通常可以提出对 本文所公开的装置的改变和进一步改进，以及所公开的技术原理的其他用途。
[0064] 所公开的技术要解决的问题是，提供：(a)能够促进多种需要的转化的固定化酶， 所述酶具有包括生物质的支撑基质；(b)制备所述固定化酶的方法，和（c)利用所述固定化 酶的方法。本发明的固定化酶具有较低的材料成本，良好的热稳定性，在存在多种溶剂的条 件下，在较宽的pH范围内具有良好的活性，并且具有生物可降解性。合适的生物质可以包 括总体上没有官能团并且最低限度参与所述交联结构的生物质，具有多个官能团参与必须 的交联的生物质，及其组合。一个实施例涉及交联的固定化酶，包括有机磷水解酶，并且能 够将多种农药，和神经毒剂等转化或降解成低毒/无害成分。所述固定化的有机磷水解酶 的形式可以是可生物降解的。
[0065] 用于制备本发明的固定化酶的通用方法包括：提供所述酶，所述生物质，所述支 撑材料，和所述交联材料，将所述酶悬浮在水介质中，并且与用于形成絮凝物的其他材料混 合，所述絮凝物可以通过标准方法分离。基于处理效率和活性考虑，在某些场合下，所述支 撑材料应当先于所述交联材料添加，而在其他场合下，所述交联材料应当先于所述支撑材 料添加。根据预期的用途，所述含水絮凝物可以直接使用或经过分离、干燥并制成具有需要 的大小和形状的颗粒。当在较高温度下加热所述固体时，某些固定化酶的活性可显著地并 且令人惊讶地提高。
[0066] 下面定义的术语被用于本发明并且赋予它们本文专门描述的含义。
[0067] 支撑基质：用于形成一种颗粒的一种或多种材料，能够赋予可以包括在所述颗粒 内的酶机械和酶学稳定性，交联剂，反应性聚合物，支撑材料和生物质。
[0068] 生物质：由生物学资源，如微生物，植物，和/或其他生物机体，如软体动物，昆虫， 或甲壳类，或有机体的一部分，如外骨豁和/或外壳（有机型和矿物质-型）生产的材料。 所述材料可以是机械处理过的（研磨和粉碎等），但未经化学处理或处理过的。
[0069] 支撑材料：单独或组合用于支撑基质中的材料，如生物质，合成生产的聚合物，和 /或其他非有机材料。
[0070] 交联剂：包含两种或两种以上反应性端基的化学试剂，所述端基用于将特殊官能 团共价连接在酶和支撑材料上，例如，使胺基与乙醛结合。
[0071] 反应性聚合物：包括具有能够与交联剂起反应的反应性侧基的聚合物
[0072] 固定化方法
[0073] 下面的实施例是用于说明本发明的，而不是要以任何方式限定本发明。正如随后 的实施例所证实的，来自包括氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，和连接酶在内 的多种类型酶的可用于本发明中。用于以下实施例中的0DE酶是固定化的，利用宿主细胞 作为细胞悬浮液或裂解的细胞材料。在某些实施例中，使用纯化的酶。支撑材料还可以包 括合成材料和/或聚合材料，如聚氮丙啶，壳多糖，聚吡咯或其他合适材料。所述支撑材料 可选择性包括一种或多种生物支撑材料和/或聚合支撑材料的组合。交联包括多功能材 料，如戊二醛（GA)，辛二酸二琥珀酰亚胺（DSS)，庚二亚氨酸二甲酯（DMP)，二亚胺代己二酸 二甲酯（DMA)，氰尿酰氯（CyC)，琥珀酸（SA)，己二异氰酸酯（HDI)和/或能够与胺交联的其 他试剂。
[0074] 提供了一种酶（分离的或包含在可能含有其他蛋白或细胞悬浮液的菌丝体混合 物中），并且悬浮在含水缓冲溶液中。添加支撑物，同时搅拌并且持续大约1小时，直到该溶 液充分混合。优选的，根据需要可添加一定体积的额外去离子水。添加交联剂，同时持续搅 拌，以使所述固定化酶絮凝。所述固体可以是分离的并且利用标准方法干燥。这仅是通用 固定化方法的一个实施例。在其他实施例中，所述成分能够按不同的顺序添加，两种或两种 以上成分可同时添加，和/或所述步骤能够用更长或更短的时间完成。提供以下实施例仅 仅是出于说明目的，而不是要以任何方式限定所公开的技术。
[0075] 有机磷水解酶固定化方法
[0076] 在以下实施例中，所使用的0ΡΗ酶是在美国专利申请号12/241，574 (' 574号申请） 中所公开的类型，该申请的发明名称为Differentially Fluorescent Yeast Biosensors for the Detection and Biodegradation of Chemical Agents，申请日为 2008 年 9 月 30 日。本文所公开的方法和技术还可应用于其他类型的ΟΡΗ和/或应用于利用不同于' 574号 申请所述方法的方法生产的各种0ΡΗ。本文所公开的方法和技术还可应用于除了 0ΡΗ之外 的酶。还可以使用有机磷降解酶，如其他芳二烷基磷酸酶（E.C. 3. 1.8. 1)和二异丙基-氟 磷酸酶（E. C. 3. 1. 8. 2)等。在某些实施例中，有机磷降解酶是一种能够作用于连接磷一个 原子和一个分子的一种或多种键的酶，尽管所公开的技术还可应用于利用不同的分子机理 降解或裂解有机磷酸盐的酶。优选的，本文所公开的技术和方法适应并应用于两种或两种 以上酶的组合。在其他实施例中，本文所公开的方法和技术可单独适应并应用于两种或两 种以上酶，然后将所得到的固定化酶组合，以便用于特定用途。
[0077] 在一个实施例中，所述酶是利用先前用于生产所述酶的生物质固定化的。在这一 特定实施例中，所述酶通过发酵生产的，发酵生成含有所述酶的发酵液和生成所述酶的生 物的生物质。将所述发酵液从发酵罐中取出，干燥固体材料，并且选择性处理，以便得到具 有期望大小的颗粒。在干燥之前，可选择性地从所述溶液中除去小分子。另外，酶辅助因 子，在取出发酵液之前，可将构成含有所述生物质和酶的固体材料，或其他物质添加到所述 发酵罐中，和/或根据需要，在干燥之前或之后直接添加到所述固体材料中。
[0078] 通过所述方法生产的固定化酶可能比通过其他固定化方法生产的酶更便宜，因为 不存在用于支撑所述酶的固体基质材料成本。另外，当所述酶保留在所述生物质中时，酶和 酶活性损失较少。
[0079] 与游离的酶相比，这种固定化酶可表现出更高的热稳定性。因此，在储存和使用期 间它能够承受更大的温度波动，而依然保持活性。所述固定化酶还可在溶剂溶液中表现出 更高的活性。在除了水之外的溶剂中具有较高的活性是有利的，因为某些有机磷化合物在 除了水之外的溶剂中溶解度更高。可以考虑使用的溶剂有酒精/水混合物，如用水配制的 20%甲醇以及其他溶剂。
[0080] 本发明的另一方面是提供一种廉价的固定化酶，它在各种环境条件下都表现出较 高的生物降解能力。在某些实施例中，在生物可降解的固定化酶产品中，固定化酶中所包含 的大部分或全部化学成分都表现出较高的生物降解能力。在一个实施例中，酶是利用用于 生产所述酶的生物质固定化的，而所述生物质本身是生物可降解的。在其他实施例中，来自 其他发酵的生物质可用于固定首先用其他方法生产的可溶性酶。在其他实施例中，所使用 的生物质在水中是不可溶解的或具有有限的溶解度。
[0081] 以下实施例介绍了利用所述酶0ΡΗ进行酶固定化的方法。出于方便考虑，在所述 实施例中使用一种特殊的酶（0ΡΗ)。所公开的用于固定化酶的方法和技术不局限于0ΡΗ。应 当理解的是，本领域普通技术人员能够利用所公开的方法和技术固定多种其他的酶，包括， 但不局限于，乳糖酶，葡萄糖异构酶，过氧化氢酶，转化酶，肌醇六磷酸酶，淀粉葡萄糖苷酶， 葡萄糖氧化酶，青霉素酰化酶等。
[0082] 含酶细胞的固定化
[0083] 细胞生长，酶生产，初步制备
[0084] 在一个实施例中，由工程大肠杆菌（E. coli)生产0ΡΗ，始于培养原液的制备。起始 溶液，125mL，由25g/L LB发酵液组成，在121°C下灭菌15分钟。灭菌之后，让其冷却，并且 在无菌条件下将50 μ g/mL卡那霉素和50 μ g/mL氯霉素添加到所述原液中。用2mL该原液 以及从事先用需要的大肠杆菌生物划线或接种的琼脂平板上收集的1个大肠杆菌集落制 备种子培养物。所述2mL溶液在37°C下在振动台上以150RPM速度振动培养24小时。在培 养期结束之后，种子培养液以无菌方式按1% v/v的比例添加到较大体积的（20mL)被称为 起始培养液的培养原液中。然后，所述起始培养液在37°C下在振动台上以150RPM速度振动 培养24小时。
[0085] 将由15g L葡萄糖，10g/L酵母抽提物，和5 μ g/L Pharmamedia组成的用自来水 配制的所述发酵液导入14升发酵容器（10升工作容积）New Brunswick BioFlo3000发酵 罐。所述溶液在121°C下在所述发酵容器中消毒15分钟。消毒之后，让容器冷却，并且在 无菌条件下将50 μ g/mL卡那霉素和50 μ g/mL氯霉素添加到发酵液中。发酵控制点被设定 为371：，？!17.0,35%溶解氧，851^1过滤的干燥空气，并且以100-600印111的速度搅拌。所述 搅拌被用于控制溶解氧，温度是通过改变冷却水进入所述发酵罐的速度控制的。使所述容 器在温度，溶解氧，pH和其他化学特征方面平衡。然后用起始培养液以1% v/v接种所述 发酵容器。通过从所述发酵容器中取样，定期监测所述发酵液的OD600,同时保持所述容器 无菌。利用Pharmacia Ultrospec III分光光度计测定600nm下的光透射。当0D600的值 超过3. 5时，通过无菌添加47. 7mg/L IPTG和13. Omg/L CoCl2诱导大肠杆菌产生ΟΡΗ。诱 导发酵进行4小时，在该时间点收获所述发酵液。从所述发酵罐中收获的体积大约为7. 75 升。
[0086] 使用0. 14 μ m陶瓷微量过滤器，通过微孔过滤和膜渗滤用PBS将收获的发酵液浓 缩5-倍。通过所述微量过滤器的膜渗滤除去了所述溶液中的可溶性盐和聚合物。所述酶 包含在大肠杆菌细胞中，因此，被微量过滤器留下。分析所述过滤器渗透液，确定在该过滤 步骤中损失的酶很少。浓缩的微量过滤的细胞的体积为大约1.5升。所述浓缩的发酵液随 后以大约50mL等分试样形式以大约3000xG的速度离心30分钟，并且倒掉上清液。来自该 方法的细胞团在_20°C下保存待用。
[0087] 实施例1
[0088] 利用PEI和戊二醛的细胞固定化方法
[0089] 对固定化方法来说，将一个或多个冷冻细胞团从冷冻机中取出以便解冻。将10g 解冻的细胞团重新悬浮在l〇〇mL的pH7. 0磷酸缓冲液（PBS)中。用1分钟时间缓慢添加戊 二醛（GA)至所述体积，使终浓度为0. 2% (v/v)，并且在室温下混合1小时。然后用2倍体 积的去离子水稀释该溶液，使总体积为大约300ml，并且将高达0.075% (v/v)的不同量的 聚氮丙啶（PET)缓慢滴入该溶液，使细胞絮凝。通过以750xG的速度离心10分钟，收集固 定化的细胞块，得到大约l〇g湿的固定化细胞。将得到的固体展开，并且在室温下干燥24 小时。然后收集干燥的材料，并且利用研钵和研棒机械研磨或通过在试管中用玻璃珠湿研 磨至需要的粒度。如果必要，再次干燥所述颗粒。
[0090] 该方法的不同变化是可行的，包括添加 PEI和GA的顺序，间歇性顺序添加 PEI和 GA，每次添加的时间间隔，同时添加 PEI和GA，所添加 PEI和GA的量和浓度等。在该方法的 第一种变化形式中，颠倒了添加 PEI和GA的顺序，不过所述材料的总浓度保持不变。另外， 所述固定化是用相同的方法进行的。相对原始方法的第二种固定化变化形式，涉及使用两 倍的GA，同时加入，并且与前面一样反应1小时。相对原始方法的第二种固定化方法的变化 形式，使用二分之一原始量的PEI。在另一种变化形式中，GA可以用任何合适的二醛代替。
[0091] 实施例2
[0092] 生物可降解的固定化酶
[0093] 上文讨论的固定化涉及全细胞，PEI和戊二醛。所述全细胞和戊二醛是可生物降 解的，而PEI不是。在某些用途中，可能希望所有固定化的颗粒都是可生物降解的。因此， PEI能够用另一种更便于生物降解的材料代替。合适的材料可以包括可生物降解的聚合物， 具有能够与戊二醛，如蛋白，明胶，羊毛，几丁质，壳多糖等起反应的化学基团。
[0094] 为了形成生物可降解的全细胞固定化酶，上述固定化方法是用壳多糖（CHI)取代 PEI进行的。对于固定化方法来说，将一个或多个冷冻细胞团从冷冻机中取出以便解冻。将 l〇g解冻的细胞团重新悬浮在l〇〇mL的pH7. OPBS中。用1分钟时间缓慢添加 GA至所述体 积，使终浓度为0.2% (v/v)，并且在室温下混合1小时。然后用2倍体积的去离子水稀释 该溶液，使总体积为大约300ml，并且将高达lg的不同量的CHI缓慢滴入该溶液，使细胞絮 凝。通过以750xG的速度离心10分钟，收集固定化的细胞块，得到大约10g湿的固定化细 胞。将得到的固体展开，并且在室温下干燥24小时。然后收集干燥的材料，并且利用研钵 和研棒机械研磨或通过在试管中用玻璃珠湿研磨至需要的粒度。如果必要，再次干燥所述 颗粒。
[0095] 实施例3
[0096] 可溶性0ΡΗ酶的固定化
[0097] 有时候，酶是以可溶的形式提供的（例如，所述酶是由产生所述酶的微生物分泌 的）。可生物降解的固定化酶可能是使用所述可溶性酶的理想产物。全细胞固定化的一个 优点是，廉价的可生物降解的生物质来自产生所述酶的生物。例如，还可以通过利用所述可 溶性酶，来自其他发酵的生物质（通常是废物），壳多糖，和戊二醛形成固定化酶，以形成廉 价的生物可降解的固定化酶。
[0098] 可溶性0ΡΗ酶的初步制备
[0099] 可溶性0ΡΗ酶是通过化学裂解和层析方法从所述冷冻细胞团中收获的。冷冻细胞 团在室温水浴中解冻5分钟。首先，每克细胞团用5mL裂解缓冲液（98. 8% YPER，1%蛋白 酶抑制剂，〇. 2% DNAse I)裂解细胞。用涂有Teflon的刮勺分散所述细胞团，并且用另外 3_5mL裂解缓冲液将所述刮勺上的细胞材料漂洗下来，并入其余裂解液中。所述裂解液随后 置于冰上，放在回旋振荡器上温育40分钟。在温育之后，通过在4°C下以20, 000xG的速度 离心20分钟，澄清所述裂解液。收集来自所述离心的上清液，并且于4°C保存待用。
[0100] 对于所述层析方法来说，以每2mL制备的NTA-Nickel树脂8mL裂解液的用量将裂 解液添加到离心管中。所述裂解液树脂混合物于4°C在回旋振荡器上温育30分钟。温育之 后,所述混合物以800xG的速度离心5分钟，并除去上清液。以每2mL树脂13mL结合缓冲 液（50mM磷酸缓冲液，500mM NaCl)的用量添加到层析柱中。轻柔地重新悬浮所述树脂并使 其沉降，然后以800xG的速度离心5分钟。再次除去上清液，并且以每2mL树脂13mL洗涤 缓冲液（30mM咪唑，50mM磷酸缓冲液，500mM NaCl)的用量添加。在重新悬浮所述树脂并使 其沉降之后，以800xG的速度离心5分钟，并除去上清液。用所述洗涤缓冲液重复以上过程 一次。在洗涤步骤之后，以每2mL树脂的用量添加3mL洗脱缓冲液（250mM咪唑，50mM磷酸 缓冲液，500mM NaCl)。该最终混合物在室温下在回旋振荡器上温育10分钟。在让树脂沉 降之后，以800xG的速度离心5分钟，收集上清液（洗脱级份），并且于4°C保存待用。
[0101] 通过用10, OOOkDa过滤器离心过滤浓缩洗脱级份中的可溶性酶。这一过程还能起 到交换含有所述蛋白的缓冲溶液的作用。将12mL洗脱级份添加到每一个过滤装置中，并且 以5000xG的速度离心，将所述材料浓缩至lmL (?10分钟）。除去渗透液，并且用储存缓冲 液（50mM磷酸缓冲液，500mM NaCl)将滤液再次稀释到12mL。以上过程重复两次，然后收集 滤液，并且于4°C保存待用。
[0102] 利用可溶性0ΡΗ的固定化方法
[0103] 为了固定化所述可溶性酶，用DI水将0. 5mL浓缩的0ΡΗ滤液稀释到1. 5mL。将6mg 壳多糖添加到该溶液中，并混合30分钟。然后用DI水将所述溶液进一步稀释到5mL，并将 高达12 μ L的25% GA溶液缓慢滴入该溶液。在与GA反应之后，让所述材料重力沉降若干 小时，并小心除去?4mL的上清液，以便保持固定化的固体未受扰动。该材料于4°C保存待 用。这种固定化方法的一种变化形式涉及在添加壳多糖之后，再添加165mg消毒的黑曲霉 菌丝体（?12%固体）。
[0104] 实施例4
[0105] 细胞中的0ΡΗ的固定化变化形式
[0106] 用100mLPBS(pH7. 5)制备含有0ΡΗ的细胞悬浮液和相关细胞。添加戊二醒，并且在 室温下搅拌所述悬浮液1小时。添加去离子水（200mL)，随后添加壳多糖。絮凝反应开始， 并在持续搅拌若干分钟中持续进行。当絮凝反应结束后，分离固体，并且利用以下两种方法 之一干燥。第一种方法，通过将分离的材料转移到离心管并以750-1000xG的速度下离心大 约10分钟。颗粒状团块的干燥是通过风干24小时进行的。如果需要，在干燥之前先将湿 润的固体形成小球状。另一种方法，取出所述絮凝产物，并将其转移到冷冻干燥试管中，并 且使用标准技术冷冻干燥，直到获得干燥产物。通过机械研磨采用上述任一种方法获得的 干燥产物至需要的尺寸，都可以获得粉末状材料。
[0107] 用戊二醛作交联剂制备若干固定化的0ΡΗ酶，使用的支撑材料包括聚氮丙啶，壳 多糖，聚吡咯和生物质，所述生物质包括含有0ΡΗ的干燥细胞。每一种方法开始时都是将一 定量的0ΡΗ酶悬浮在作为起始缓冲液的磷酸缓冲盐溶液中，并且，让所述方法持续到足以 使最终固定化酶基本上完全絮凝的程度。下面的图表1提供了与制备所述固定化的变体相 关的信息。用于每一个实施例的方法的差异在下图表中标注。
[0108] 图表 1
[0109]

【权利要求】
1. 一种固定化酶材料，包括一种具有支撑基质的交联酶，所述支撑基质包括一种生物 质，该生物质为不同于所述酶来源的生物质，其中，所述交联酶是通过让所述酶与至少两种 多功能材料反应生成的。
2. 如权利要求1所述的固定化酶材料，其中，所述酶是有机磷降解酶。
3. 如权利要求1或2所述的固定化酶材料，其中，所述生物质是不可溶解的。
4. 如权利要求1-3中任意一项所述的固定化酶材料，所述两种多功能材料中的至少一 种选自下列一组：二醛，辛二酸二琥珀酰亚胺，有机二羧酸，戊二醛，庚二亚氨酸二甲酯，氰 尿酰氯，琥珀酸，六亚甲基二异氰酸酯，二酰亚胺酯，三嗪，二异氰酸酯，和二（η-羟基琥珀 亚胺酯）。
5. 如权利要求1-4中任意一项所述的固定化酶材料，所述两种多功能材料中的至少一 种是聚胺。
6. 如权利要求5所述的固定化酶材料，所述两种多功能材料中的至少一种是选自下列 一组的聚胺：聚氮丙啶，聚吡咯，壳多糖，蛋白和明胶。
7. 如权利要求1-6中任意一项所述的固定化酶材料，其中，所述生物质选自下列一组： 细菌细胞材料，真菌细胞材料，纤维素，葡聚糖，淀粉琼脂，藻酸盐，卡拉胶，胶原，明胶，白蛋 白，铁蛋白，棉，几丁质，外骨骼和羊毛。
8. 如权利要求1-7中任意一项所述的固定化酶材料，其中，所述固定化酶材料是可生 物降解的。
9. 如权利要求1-8中任意一项所述的固定化酶材料，其中，所述酶属于选自下列一组 的类型：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。
10. 如权利要求1-9中任意一项所述的固定化酶材料，其中，所述固定化酶材料还包括 所述酶来源的生物质。
11. 如权利要求1-10中任意一项所述的固定化酶材料，所述两种多功能材料中的至少 一种包括其上具有多个胺基的生物质。
12. 如权利要求11所述的固定化酶材料，其中，所述至少一种多功能材料包括选自下 列一组的生物质：细菌细胞材料，真菌细胞材料，纤维素，葡聚糖，淀粉琼脂，藻酸盐，卡拉 胶，胶原，明胶，白蛋白，铁蛋白，棉，几丁质，外骨骼和羊毛。
13. -种制备固定化酶材料的方法，包括： 提供一种酶的水悬浮液，一种生物质，该生物质不同于所述酶来源的生物质，以及至少 两种多功能材料； 将所述生物质，和所述两种多功能材料之一添加到所述酶的水悬浮液中，以便形成反 应混合物； 将所述第二种多功能材料添加到所述反应混合物中，以便使所述固定化酶材料絮凝。
14. 如权利要求13所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述第二种多功能材料添 加到所述反应混合物中之前搅拌所述反应混合物。
15. 如权利要求13或14所述的方法，其中，提供一种生物质和至少两种多功能材料包 括提供一种可生物降解的生物质和可生物降解的多功能材料。
16. 如权利要求13-15中任意一项所述的方法，其中，提供一种生物质包括提供一种不 可溶解的生物质。
17. 如权利要求13-16中任意一项所述的方法，其中，提供一种生物质包括提供一种选 自下列一组的生物质：细菌细胞材料，真菌细胞材料，纤维素，葡聚糖，淀粉琼脂，藻酸盐，卡 拉胶，胶原，明胶，白蛋白，铁蛋白，棉，几丁质，外骨骼和羊毛。
18. 如权利要求13-17中任意一项所述的方法，其中，提供一种酶的水悬浮液包括提供 一种选自下列一组的类型的酶的水悬浮液：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和 连接酶。
19. 如权利要求13-18中任意一项所述的方法，其中，提供至少两种多功能材料包括提 供一种上面具有多个胺基的额外的生物质。
20. 如权利要求19所述的方法，其中，所述额外的生物质选自下列一组：细菌细胞材 料，真菌细胞材料，纤维素，葡聚糖，淀粉琼脂，藻酸盐，卡拉胶，胶原，明胶，白蛋白，铁蛋白， 棉，几丁质，外骨骼和羊毛。
21. 如权利要求13-20中任意一项所述的方法，所述两种多功能材料中的至少一种选 自下列一组：二醛，辛二酸二琥珀酰亚胺，有机二羧酸，戊二醛，庚二亚氨酸二甲酯，氰尿酰 氯，琥珀酸，六亚甲基二异氰酸酯，二酰亚胺酯，三嗪，二异氰酸酯和二（η-羟基琥珀亚胺 酯）。
22. 如权利要求13-21中任意一项所述的方法，其中，提供至少两种多功能材料包括提 供一种选自下列一组的聚胺：聚氮丙啶，聚吡咯，壳多糖，蛋白和明胶。
23. 如权利要求13-22中任意一项所述的方法，其中，所述提供的酶是有机磷降解酶。
24. 如权利要求13-23中任意一项所述的方法，其中，所述固定化酶材料还包括所述酶 来源的生物质。
25. 如权利要求13-24中任意一项所述的方法，所述两种多功能材料中的至少一种是 聚胺。
26. -种净化含有对酶促降解敏感材料的区域的方法，包括： 以适合一个区域使用并且适合降解所述材料的形式提供一种可生物降解的固定化酶 材料； 让所述区域与所述可生物降解的固定化酶材料接触； 其中，在降解所述材料时，所述可生物降解的固定化酶材料本身发生生物降解，因此无 需除去所述酶材料。
27. -种用于转化对酶转化敏感的材料的方法，包括： 以适用于反应室的形式提供一种适合转化所述材料的可生物降解的固定化酶材料； 将所述固定化酶材料放入反应室； 在所述反应室中让所述要转化的材料与所述固定化酶材料接触； 从所述反应室中取出所述固定化酶材料，放置到所述固定化酶材料可以被生物降解的 区域。
28. 如权利要求27所述的方法，其中，所述反应室是一个反应塔。
29. 如权利要求27所述的方法，其中，所述反应室是一个封闭的反应容器.
30. 如权利要求27所述的方法，其中，所述反应室是一个填充床。
【文档编号】C12N11/00GK104114700SQ201280066295
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年11月13日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】奥古斯蒂娜·A·迪诺夫, 多米尼斯·P·迪诺夫, 大卫·A·斯科菲尔德, 马修·F·史麦科夫斯基, 弗郎西斯·H·费尔霍夫 申请人:吉尔德联合有限公司