经修饰的微生物和使用其制造丁二烯的方法
【专利摘要】本发明大体上涉及微生物，其包含一或多种编码一或多种路径中催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸。还提供在工业过程中使用所述微生物的方法，包括用于制造丁二烯和衍生自其的产物。
【专利说明】经修饰的微生物和使用其制造丁二烯的方法
【背景技术】
[0001] 丁二烯（1，3- 丁二烯，CH2= CH-CH = CH 2, CAS 106-99-0)是典型地通过蒸汽裂解 石油基烃制造（与其它4-碳分子一起）的直链、共轭4-碳烃。此工艺涉及苛刻条件和高 温（至少约850°C )。其它丁二烯制造方法涉及有毒和/或昂贵的催化剂、高度可燃和/或 气态碳来源以及高温。全世界每年制造几百万吨含丁二烯的聚合物。丁二烯可以聚合以形 成聚丁二烯，或在镍催化剂存在下与氰化氢（氢氰酸）反应以形成己二腈（一种尼龙前驱 体）。然而，更通常地，丁二烯与其它烯烃聚合以形成共聚物，例如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯 (ABS)、丙烯腈-丁二烯（ABR)或苯乙烯-丁二烯（SBR)共聚物。
【发明内容】
[0002] 本发明大体上涉及微生物（例如非天然存在的微生物，在本文中也称为被修饰的 微生物），其包含一或多种编码一或多种路径中催化碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸； 和所述微生物在工业过程中的用途，包括用于制造丁二烯和衍生自其的产物。
[0003] 本发明提供从可发酵碳源制造丁二烯的方法，其包含：提供可发酵碳源；使所述 可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触，所述微生物包含一或多种编码在丁二烯制造路 径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸，和一或多种编码 路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸；以及使所述一或多种编码 在所述丁二烯制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述 酶的多核苷酸、和所述一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的 多核苷酸在所述微生物中表达，以制造丁二烯。
[0004] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，在所述丁二 烯制造路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述酶陈列于表1-3中的任 一者中。
[0005] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，催化所述一 或多种中间物向丁二烯转化的所述酶陈列于表1-3中的任一者中。
[0006] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，丁二烯经由 乙酰CoA和丙酰CoA中间物；巴豆酰CoA中间物；和/或甲酸中间物来制造。
[0007] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶， 包括例如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。
[0008] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化酮戊酰CoA向（R)或（S) 3-羟基戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码氧化 还原酶，包括例如由如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。
[0009] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化（R)或（S)羟基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA转化的酶的多核苷酸编码脱 水酶，包括例如由如SEQ ID N0:37-55中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱水酶。
[0010] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸转化的酶的多核苷酸编码转移酶或水解酶， 包括例如分别由如SEQ ID NO: 1-28或29-33中的任一者陈列的多核苷酸编码的转移酶或 水解酶。
[0011] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化2-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如SEQ ID NO:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。
[0012] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸转化的酶的多核苷酸编码异构酶，包括例如和由 如SEQ ID N0:99-102中的任一者陈列的多核苷酸编码的异构酶。
[0013] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化4-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如SEQ ID NO:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。
[0014] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酰CoA转化的酶的多核苷酸编码脱氢酶， 包括例如由如SEQ ID NO: 124-139中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱氢酶。
[0015] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化戊-2, 4-二烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酸转化的酶的多核苷酸编码转移酶 或水解酶，包括例如分别由如SEQ ID NO: 1-28或29-33中的任一者陈列的多核苷酸编码的 转移酶或水解酶。
[0016] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化2, 4-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如由如 SEQ ID N0:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。
[0017] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醇转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由 如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。
[0018] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化巴豆酰CoA向巴豆醛转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由 如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码的氧化还原酶。
[0019] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化巴豆醛向巴豆醇转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶或CoA合成酶，包 括例如分别由如SEQ ID NO: 103-123或SEQ ID NO 34-36中的任一者陈列的多核苷酸编码 的氧化还原酶或合成酶。
[0020] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化巴豆醇向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱水酶，包括例如由如SEQ ID NO:37-55中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱水酶。
[0021] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或 多种编码路径中催化CO 2向甲酸转化的酶的多核苷酸编码脱氢酶，包括例如由如SEQ ID NO: 124-139中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱氢酶。
[0022] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化丙酮酸酯和CoA向乙酰CoA和甲酸转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶， 包括例如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。
[0023] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化甲酸向甲酰CoA转化的酶的多核苷酸编码转移酶或CoA合成酶，包括例 如分别由如SEQ ID NO: 1-28或34-36中的任一者陈列的多核苷酸编码的转移酶或CoA合 成酶。
[0024] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化2乙酰CoA向乙酰乙酰CoA转化的酶的多核苷酸编码酮硫解酶，包括例 如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。
[0025] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化乙酰乙酰CoA和甲酰CoA向3, 5-酮戊酰CoA转化的酶的多核苷酸编码 酮硫解酶，包括例如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陈列的多核苷酸编码的酮硫解酶。
[0026] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化3, 5-酮戊酰CoA向（R)或（S) -5-羟基-3-酮戊酰CoA转化的酶的多核 苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陈列的多核苷酸编码 的氧化还原酶。
[0027] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化（R)或（S)-5-羟基-3-酮戊酰CoA向（R)或（S)-3, 5-二羟基戊酰CoA 转化的酶的多核苷酸编码氧化还原酶，包括例如由如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陈列 的多核苷酸编码的氧化还原酶。
[0028] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化（R)或（S)-3, 5-二羟基戊酰CoA向（R)或（S) 3-羟基-4-戊烯酰CoA 转化的酶的多核苷酸编码脱水酶，包括例如由如SEQ ID N0:37-55中的任一者陈列的多核 苷酸编码的脱水酶。
[0029] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化（R)或（S) -3-羟基-4-戊烯酰CoA向3-羟基-4-戊烯酸转化的酶的多 核苷酸编码转移酶或水解酶，包括例如分别由如SEQ ID NO: 1-28或29-33中的任一者陈列 的多核苷酸编码的转移酶或水解酶。
[0030] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述一或多 种编码路径中催化3-羟基-4-戊烯酸向丁二烯转化的酶的多核苷酸编码脱羧酶，包括例如 由如SEQ ID N0:79-98中的任一者陈列的多核苷酸编码的脱羧酶。
[0031] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述 微生物是选自由以下组成的属的细菌：伯克霍尔德菌属（Burkholderia)、丙酸杆菌 属（Propionibacterium)、丙酸螺菌属（Propionispira)、梭菌属（Clostridium)、芽抱 杆菌属（Bacillus)、埃希氏菌属（Escherichia)、暗杆菌属（Pelobacter)或乳杆菌属 (Lactobacillus) 〇
[0032] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物 是真核生物，是酵母、丝状真菌、原生动物或藻类。
[0033] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述酵母是 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)或巴斯德 毕赤酵母（Pichia pastoris)。
[0034] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述碳源是 甘蔗汁、甘蔗糖蜜、水解淀粉、水解木质纤维素材料、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳酸酯、乳糖、木 糖、丙酮酸酯或甘油，呈其任何形式或混合物形式。
[0035] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述碳源是 单糖、寡糖或多糖。
[0036] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述丁二烯 由所述微生物分泌到所述发酵培养基中。
[0037] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述方法可 以进一步包含从所述发酵培养基回收所述丁二烯。
[0038] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物 已经被遗传修饰，以使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵 碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和所述一或多种编码路径中催化一或多种中 间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸表达。
[0039] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述可发酵 碳源向丁二烯的所述转化是ATP阳性（例如每分子制造的丁二烯产生净ATP)，并且可以与 NADH消耗路径组合以提供丁二烯制造的厌氧工艺。
[0040] 本发明还提供微生物，其包含一或多种编码在丁二烯制造路径中路径中催化可发 酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种 中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸。
[0041] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，在所述丁二 烯制造路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的所述酶陈列于表1-3中的任 一者中。
[0042] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，催化所述一 或多种中间物向丁二烯转化的所述酶陈列于表1-3中的任一者中。
[0043] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，丁二烯经由 乙酰CoA和丙酰CoA中间物；巴豆酰CoA中间物；和/或甲酸中间物来制造。
[0044] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物 是选自由以下组成的属的细菌：伯克霍尔德菌属、丙酸杆菌属、丙酸螺菌属、梭菌属、芽孢杆 菌属、埃希氏菌属、暗杆菌属或乳杆菌属。
[0045] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物 是真核生物，是酵母、丝状真菌、原生动物或藻类。
[0046] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述酵母是 酿酒酵母、运动发酵单胞菌或巴斯德毕赤酵母。
[0047] 在一些可以与上文或下文提及的实施例中的任一者组合的实施例中，所述微生物 已经被遗传修饰，以使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵 碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和所述一或多种编码路径中催化一或多种中 间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸表达。
[0048] 本发明的这些和其它实施例将更详细揭示于下文中。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 本发明的以上
【发明内容】
以及以下【具体实施方式】当结合附图阅读时将得到更好理 解。出于说明本发明的目的，图中展示本发明优选的实施例。然而，应理解，本发明不限于 所示的确切配置、实例和手段。
[0050] 图1描绘经由乙酷CoA和丙酰CoA中间物从可发酵碳源制造丁二烯的一例示性路 径。
[0051] 图2描绘经由巴豆酷CoA中间物从可发酵碳源制造丁二烯的一例示性路径。
[0052] 图3描绘经由甲酸中间物从可发酵碳源制造丁二燔的一例示性路径。
【具体实施方式】
[0053] 本发明大体上涉及微生物（例如非天然存在的微生物；被修饰的微生物），其包含 被遗传修饰的路径；和所述微生物用于将可发酵碳源转化为丁二烯的用途（参看图1-3)。 所述微生物包含一或多种编码经由新颖酶路径催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核 苷酸。任选地，所制造的丁二烯接着可以转化为聚丁二烯或许多其它含丁二烯的聚合物。
[0054] 本发明部分提供新颖酶路径（包括例如新颖酶路径组合）的发现，其用于从碳源 (例如可发酵碳源）制造丁二烯。本文中揭示的酶路径允许经由以下来酶促制造丁二烯： 乙酰CoA和丙酰CoA中间物；巴豆酰CoA中间物；和/或甲酸中间物。
[0055] 本文中提供的方法提供类似于灭菌的最后结果而无典型地为建立和在整个制造 工艺期间维持无菌所需的高资金支出和持续较高管理成本。在此方面，大多数工业规模的 丁二烯制造工艺因其工艺的好氧性质而在可测量数目的细菌污染物存在下操作。据信，丁 二烯制造工艺的细菌污染导致产物产率降低和制造丁二烯的微生物的生长抑制。由于制造 的丁二烯的有毒性质减少制造工艺中的污染物，因此现有方法的所述缺陷通过本发明揭示 的方法来避免。
[0056] 本文中揭示的酶路径与先前已知酶路径相比对于制造丁二烯来说是有利的，由于 本文中揭示的酶路径是ATP阳性并且当与NADH消耗路径组合时它可以提供丁二烯的厌氧 路径。虽然有可能使用好氧工艺制造丁二烯，但厌氧工艺因当在发酵工艺（尤其丁二烯发 酵）期间烯烃（其本质上是爆炸性的）与氧气混合时招致的风险而是优选的。此外，在发 酵器中补充氧气和氮气需要空气压缩机、发酵器（泡罩塔或气提发酵器）、温度控制和氮气 的额外投资。氧气的存在还可以催化丁二烯的聚合并且可以促进发酵器培养液中好氧污 染物的生长。另外，制造丁二烯的好氧发酵工艺在工业规模下呈现出几个缺陷（其中它对 于维持无菌条件是技术上有挑战的），例如以下事实：（i)获得更多生物质，对于所要产物 来说降低碳的总产率；（ii)存在和氧气促进污染物的生长（韦斯特许斯（Weusthuis)等 人，2011，生物技术动向（Trends in Biotechnology), 2011，第 29 卷，第 4 期，153-158); 和（iii)氧气与气态化合物（例如丁二烯）的混合物造成严重爆炸风险；（iv)氧气可能会 催化不期望的烯烃聚合反应；以及最终（V)在好氧条件下的较高发酵和纯化成本。另外，通 过本文中揭示的工艺制造的丁二烯未搀入0 2和N2，因此防止所制造的丁二烯的高成本并且 费时的纯化。
[0057] 应理解，本文中描述的任何和所有方法中涉及的步骤可以按任何次序进行并且不 限制或局限于具体叙述的次序。举例来说，本发明提供从可发酵碳源制造丁二烯的方法，其 包含：提供可发酵碳源；使所述可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触，所述微生物包 含一或多种编码在丁二烯制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化 的酶的多核苷酸，和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多 核苷酸；以及使所述一或多种编码在所述丁二烯制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳 源向一或多种中间物转化的所述酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种 中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸在所述微生物中表达，以制造丁二烯。因此，使所述一 或多种编码在所述丁二烯制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物 转化的所述酶的多核苷酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化 的酶的多核苷酸在所述微生物中表达以制造丁二烯可以在使所述可发酵碳源与微生物在 发酵培养基中接触之前或之后进行，所述微生物包含一或多种编码在所述丁二烯制造路径 中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核苷酸、和一或多种编码路 径中催化所述一或多种中间物向丁二烯转化的酶的多核苷酸。
[0058] 还应理解，本文中揭示的微生物可以包含图1-3中的任一者中揭示的整个路径， 包括、包含所有编码催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸。或者，还应理解，本文 中揭示的微生物可以包含一或多种编码图1-3中的任一者中的催化可发酵碳源向丁二烯 转化的酶的多核苷酸（例如微生物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上编码如图 1-3中的任一者中所揭示的催化可发酵碳源向丁二烯转化的酶的多核苷酸）。
[0059] 在一些实施例中，所制造的丁二烯的克数与可发酵碳源的克数的比率是0.20、 0· 21、0· 22、0· 23、0· 24、0· 25、0· 26、0· 27、0· 28、0· 29、0· 30、0· 31、0· 32、0· 33、0· 34、0· 35、 0· 36、0· 37、0· 38、0· 39、0· 40、0· 41、0· 42、0· 43、0· 44、0· 45、0· 46、0· 47、0· 48、0· 49、0· 50、 0· 51、0· 52、0· 53、0· 54、0· 55、0· 56、0· 57、0· 58、0· 59、0· 60、0· 61、0· 62、0· 63、0· 64、0· 65、 0· 66、0· 67、0· 68、0· 69、0· 70、0· 71、0· 72、0· 73、0· 74、0· 75、0· 76、0· 77、0· 78、0· 79、0· 80、 0. 81、0. 82、0. 83、0. 84、0. 85、0. 86、0. 87、0. 88、0. 89、0. 90、0. 91、0. 92、0. 93、0. 94、0. 95、 0· 96、0· 97、0· 98、0· 99 或 L 00。
[0060] 在一些实施例中，所制造的丁二烯中的碳的摩尔数目构成可发酵碳源中的碳的 摩尔数目的 20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33 %,34 %,35 %,36 %,37 %,38 %,39 %,40 %,41 %,42 %,43 %,44 %,45 %,46 %,47 %, 48 %,49 %,50 %,51 %,52 %,53 %,54 %,55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %, 63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %, 78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0061] 如本文中所用，"丁二烯"旨在意指丁 -1，3-二烯或1，3- 丁二烯（CAS 106-99-0)， 通式是CH2= CH-CH = CH 2，并且分子质量是54. 09g/mol。
[0062] 如本文中所用，术语"生物活性"或"功能活性"当提及蛋白质、多肽或肽时，可以 意指所述蛋白质、多肽或肽展现关于某一生物过程、路径或反应适用的功能或性质。生物或 功能活性可以指例如与另一多肽或分子相互作用或缔合（例如结合）的能力，或它可以指 催化或调节其它蛋白质或分子的相互作用（例如酶促反应）的能力。
[0063] 如本文中所用，术语"培养"可以指使细胞（例如微生物细胞）群体在适用于生长 的条件下在液体培养基中或在固体培养基上生长。
[0064] 如本文中所用，术语"衍生自"可以涵盖术语源自、获自、可获自、分离自和产生自， 并且一般来说表示一种规定物质在另一规定物质中得到其来源或具有可以参考另一规定 物质描述的特征。
[0065] 如本文中所用，术语"表达载体"可以指含有编码多肽或蛋白质的多核苷酸或核酸 序列（例如可操作地连接于一或多个能够影响宿主中的编码序列表达的适合控制序列的 DNA编码序列（例如基因顺序））的DNA构建体。所述控制序列包括影响转录的启动子、控 制所述转录的任选的操纵序列、编码适合mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻 译的终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是可能的基因组插入物。在转型到 适合宿主中后，载体可以复制并且独立于宿主基因组而起作用（例如独立载体或质粒），或 在一些情况下，可以自身整合到基因组中（例如整合的载体）。质粒是最常用的表达载体形 式。然而，本发明旨在包括这样的其它表达载体形式，以便提供等效功能并且在本领域中已 知或变得已知。
[0066] 如本文中所用，术语"表达"可以指基于编码多肽（例如基因）的核酸序列制造多 肽的过程。所述过程包括转录和翻译。
[0067] 如本文中所用，术语"基因"可以指制造多肽或蛋白质（例如融合蛋白）中涉及的 DNA区段，并且包括在编码区之前和之后的区以及个别编码区段（外显子）之间的介入序列 (内含子）。
[0068] 如本文中所用，术语"异源"关于核酸、多核苷酸、蛋白质或肽可以指非天然存在于 规定细胞（例如宿主细胞）中的核酸、多核苷酸、蛋白质或肽。希望所述术语涵盖由天然存 在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。相比之下，术语同源关于核酸、多核苷 酸、蛋白质或肽是指天然存在于细胞中的核酸、多核苷酸、蛋白质或肽。
[0069] 如本文中所用，术语"宿主细胞"可以指细胞或细胞系，包括细胞，例如重组表达载 体可以被转染用于表达多肽或蛋白质（例如融合蛋白）的微生物。宿主细胞包括单一宿主 细胞的子代，并且子代因天然、意外或蓄意突变而可以不必与初始母细胞完全一致（在形 态方面或在总基因组DNA互补序列方面）。宿主细胞可以包括用表达载体进行体内转染或 转型的细胞。
[0070] 如本文中所用，术语"引入"在将核酸序列或多核苷酸序列插入到细胞中的情形 下，可以包括转染、转型或转导并且指将核酸序列或多核苷酸序列并入到真核或原核细胞 中，其中核酸序列或多核苷酸序列可以被并入到细胞的基因组（例如染色体、质粒、质体或 线粒体DNA)中、转化为自主复制子或瞬时表达。
[0071 ] 如本文中所用，术语"非天然存在"在关于本发明的微生物体或微生物使用时旨在 意指微生物体具有至少一个在所参考物种的天然存在菌株（包括所参考物种的野生型菌 株）中并不常见的基因改变。基因改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、 其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物体遗传物质的其它功能性破坏。所述修饰包括例如 所参考物种的异源、同源或异源与同源多肽的编码区和其功能片段。其它修饰包括例如修 饰改变了基因或操纵子的表达的非编码调节区。本发明的非天然存在的微生物体可以含有 稳定基因改变，其是指可以被培养五代以上而无改变损失的微生物。一般来说，稳定基因改 变包括持续10代以上的修饰，具体地说稳定修饰将持续约25代以上，并且更具体地说稳定 遗传修饰将持续50代以上，包括无限期。本领域的技术人员应理解，包括本文中例示的代 谢修饰的基因改变参考适合宿主生物体（例如大肠杆菌（E. coli))和其相应代谢反应或所 要遗传物质（例如所要代谢路径的基因）的适合来源生物体来描述。然而，考虑到多种生 物体的完整基因组定序和基因组学领域中的高技术水平，本领域的技术人员将能够容易地 将本文中提供的教示和指导应用于基本上所有其它生物体。举例来说，本文中例示的大肠 杆菌代谢改变可以通过并有来自不同于所参考物种的物种的相同或类似编码核酸容易地 应用于其它物种。所述基因改变大体上包括例如物种同源物的基因改变，和尤其直系同源 物、旁系同源物或非直系同源基因置换。
[0072] 如本文中所用，"丁二烯"旨在意指一种共轭直链二烯，分子式是C4H6,通式是CH2 =CH-CH = CH2，并且分子质量是54. 09g/mol。丁二烯在本领域中还称为1，3- 丁二烯、 丁 -1，3-二稀、联乙稀、刺桐稀、二乙稀和乙稀基乙稀。
[0073] 如本文中所用，术语"可操作地连接"可以指规定元件的并置或配置，其使所述元 件一齐起作用以实现一种效果。举例来说，启动子在它控制编码序列的转录时可以可操作 地连接于编码序列。
[0074] 如本文中所用，术语"启动子"可以指结合RNA聚合酶以引发基因转录中涉及的调 节序列。启动子可以是诱导性启动子或组成性启动子。诱导性启动子是在环境或发育调节 条件下活性的启动子。
[0075] 如本文中所用，术语"多核苷酸"或"核酸序列"可以指具有任何长度和任何三维结 构并且单链或多链（例如单链、双链、三螺旋等）的核苷酸聚合形式，其含有脱氧核糖核苷 酸、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或被修饰的形式，包括被修 饰的核苷酸或碱基或其类似物。所述多核苷酸或核酸序列可以编码氨基酸（例如多肽或蛋 白质，例如融合蛋白）。因为遗传密码是简并的，所以一个以上密码子可以用以编码具体氨 基酸，并且本发明涵盖编码具体氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的被修饰的核 苷酸或核苷酸类似物，只要多核苷酸在使用条件下维持所要功能即可，包括增加核酸酶抗 性的修饰（例如脱氧、2' -Ο-Me、硫代磷酸酯等）。还可以出于检测或捕获例如放射性或非放 射性标记或锚定（例如生物素）的目的并入标记。术语多核苷酸还包括肽核酸（PNA)。多 核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语多核苷酸、核酸和寡核苷酸在本文中可互 换使用。多核苷酸可以含有RNA、DNA或两者和/或其被修饰的形式和/或类似物。核苷酸 的序列可以杂有非核苷酸组分。一或多个磷酸二酯键联可以置换为替代性键联基团。这些 替代性键联基团包括（但不限于）其中磷酸酯置换为P (〇) S (硫代酯）、P (S) S (二硫代酯）、 (0) NR2 (酰胺化物）、P (0) R、P (0) OR'、COCH2 (甲缩醛）的实施例，其中每个R或R'独立地 是H或被取代或未被取代的烷基（1-20个C)，任选地含有乙醚（-0-)键联、芳基、烯基、环烷 基、环烯基或芳醛基。多核苷酸中并非所有键联都需要相同。多核苷酸可以是直链或环状 或包含直链和环状部分的组合。
[0076] 如本文中所用，术语"蛋白质"或"多核苷酸"可以指包含氨基酸并且由本领域的技 术人员公认为蛋白质的组合物。本文中使用氨基酸残基的常规一字母或三字母编码。术语 蛋白质和多肽在本文中可互换用以指具有任何长度的氨基酸聚合物，包括包含键联（例如 融合）肽/多肽（例如融合蛋白）的那些。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含被修饰 的氨基酸，并且它可以杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已经被天然地或通过介入而修饰的 氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，例 如与标记组分结合。定义内还包括例如含有一或多种氨基酸（包括例如非天然氨基酸等） 类似物以及本领域中已知的其它修饰的多肽。
[0077] 如本文中所用，相关蛋白质、多肽或肽可以涵盖变异蛋白质、多肽或肽。变异蛋白 质、多肽或肽在少量氨基酸残基方面不同于母体蛋白质、多肽或肽和/或彼此。在一些实施 例中，不同氨基酸残基的数目是以下中的任一者：约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或 50个。在一些实施例中，变异体相差约1到约10个氨基酸。或者或另外，变异体与参考蛋 白或核酸可以具有规定程度的序列一致性，例如如使用序列比对工具（例如BLAST、ALIGN 和CLUSTAL)测定（参看下文）。举例来说，变异蛋白质或核酸与参考序列可以具有至少 约 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至99.5%氨基酸序列一致 性。
[0078] 如本文中所用，术语"回收"、"隔离"、"纯化"和"分离"可以指从至少一种组分移 出的物质（例如蛋白质、肽、核酸、多核苷酸或细胞），其与所述组分天然地相关。举例来说， 这些术语可以指实质上或基本上不含如其天然状态下可见的通常伴随其的组分（例如完 整生物系统）的物质。
[0079] 如本文中所用，术语"重组"可以指已经由人操纵以使得其与如天然所见的核酸、 多肽和细胞不相同的核酸序列或多核苷酸、多肽或蛋白质以及基于其的细胞。重组还可以 指已经被修饰以改变其序列或表达特征（例如通过使编码序列突变以制造改变的多肽、使 编码序列与另一编码序列或基因融合、在不同启动子控制下放置基因、使基因在异源生物 体中表达、使基因以降低或提升的水平表达、使基因有条件地或组成性地以不同于其天然 表达谱的方式表达等）的遗传物质（例如核酸序列或多核苷酸、其编码的多肽或蛋白质以 及包含所述核酸序列或多核苷酸的载体和细胞）。
[0080] 如本文中所用，术语"选择性标记"或"可选择标记"可以指能够表达于宿主细胞 中的基因，其提供那些含有引入的核酸序列、多核苷酸或载体的宿主的选择便利性。可选择 标记的实例包括（但不限于）抗微生物物质（例如潮霉素、博莱霉素或氯霉素）和/或赋 予宿主细胞代谢优势（例如营养优势）的基因。
[0081] 如本文中所用，术语"实质上类似"和"实质上一致"在至少两个核酸、多核苷酸、蛋 白质或多肽的情形下，可以意指核酸、多核苷酸、蛋白质或多肽包含与参考（例如野生型） 核酸、多核苷酸、蛋白质或多肽相比具有至少约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%或甚至99. 5%序列一致性的序列。序列一致性可以使用已知程序（例如 BLAST、ALIGN和CLUSTAL)使用标准参数测定。（参看例如阿特休尔（Altshul)等人（1990) 分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )215:403-410;亨尼科夫（Henikoff)等人（1989)国家科 学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. )89:10915;卡林（Karin)等人（1993)国家科学院院刊 90:5873;和希金斯（Higgins)等人（1988)基因（Gene)73:237)。可在国家生物技术信息 中心（the National Center for Biotechnology Information)公开获得用于执行 BLAST 分析的软件。此外，可以使用FASTA搜寻数据库（珀森（Person)等人（1988)国家科学院 院刊85:2444-2448)。在一些实施例中，实质上一致多肽不同之处仅是一或多个保守氨基酸 取代。在一些实施例中，实质上一致多肽是可免疫交叉反应的。在一些实施例中，实质上一 致核酸分子在严格条件下（例如在一系列高严格性的培养基内）彼此杂交。
[0082] 如本文中所用，术语"转染"或"转型"可以指将外源核酸或多核苷酸插入到宿主细 胞中。外源核酸或多核苷酸可以维持为非整合载体（例如质粒）形式，或者，可以整合到宿 主细胞基因组中。术语转染（transfecting或transfection)旨在涵盖用于将核酸或多核 苷酸引入到宿主细胞中的所有常规技术。转染技术的实例包括（但不限于）磷酸钙沉淀、 DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体转染、电穿孔和显微注射。
[0083] 如本文中所用，术语"转型"、"稳定转型"和"转基因"可以指具有非天然（例如异 源）核酸序列或多核苷酸序列整合到其基因组中或为游离型质粒形式维持多代的细胞。
[0084] 如本文中所用，术语"载体"可以指经设计以将核酸引入到一或多种细胞类型中的 多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、单链和双链盒 等。
[0085] 如本文中所用，术语"野生型"、"天然"或"天然存在的"蛋白质可以指天然所见的 那些蛋白质。术语野生型序列是指天然所见或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施 例中，野生型序列是蛋白质工程化计划（例如制造变异蛋白质）的起点。
[0086] 除非另作定义，否则在本文中，本文中所用的所有技术与科学术语都具有如本发 明所属的本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。辛格尔顿（Singleton)等人，微 生物学与分子生物学词典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),第 二版，约翰威利父子公司（John Wiley and Sons),纽约（New York) (1994)和黑尔&马 卡姆（Hale&Markham),哈泊柯林斯生物学词典（The Harper Collins Dictionary of Biology),哈泊永久公司（Harper Perennial),纽约（1991)给技术人员提供本发明中所用 的许多术语的通用词典。此外，应理解本文中路径中的任一者中揭示的底物中的任一者可 以或者包括底物的阴离子或阳离子。
[0087] 本文中提供的数值范围包括界定所述范围的数目。
[0088] 除非另外说明，否则对应地，核酸序列以5'到3'定向左到右地书写；氨基酸序列 以氨基到羧基定向左到右地书写。
[0089] 虽然本发明能够以各种形式形式体现，但以下对几个实施例的描述在以下理解下 进行：本发明应视为本发明的例证，并且不旨在将本发明限于说明的具体实施例。标题仅为 了方便起见而提供并且不应视为以任何方式限制本发明。任何标题下说明的实施例都可以 与任何其它标题下说明的实施例组合。
[0090] 除非另外明确指示，否则本申请案中规定的各个数量值中的数值的使用陈述为仿 佛所述范围内的最小和最大值前面都有词语"约"的近似值。此外，本发明的范围预期为连 续范围，包括所述最小与最大值之间的每个值以及可以通过所述值形成的任何范围。本文 中还揭示可以通过用揭示的数值除任何其它揭示的数值而形成的任何和所有比率（和任 何所述比率的范围）。因此，技术人员应理解，许多所述比率、范围和比率范围可以明确衍生 自本文中呈现的数值，并且在所有情况下，所述比率、范围和比率范围都表示本发明的各个 实施例。
[0091] 微生物的修饰
[0092] 微生物可以通过本领域中已知的任何方法修饰（例如遗传工程化）以包含和/或 表达（例如包括过表达）一或多种编码一或多种路径中能够将可发酵碳源转化为丁二烯的 酶的多核苷酸（例如异源多核苷酸和/或非异源多核苷酸）。微生物可以天然地表达一或 多种路径中将可发酵碳源转化为丁二烯所需的全部酶，或可以被修饰以表达（包括例如过 表达）一或多种路径中的一或多种酶。在一些实施例中，微生物可以包含所述路径中的少 于全部酶，并且编码缺少的酶的多核苷酸可以被遗传引入到微生物中。举例来说，被修饰的 微生物可以被修饰以包含一或多种编码丁二烯制造路径中催化可发酵碳源（例如葡萄糖） 向一或多种中间物（例如乙酰CoA和丙酰CoA ;巴豆酰CoA ;和/或甲酸）转化的酶的多核 苷酸。另外或或者，被修饰的微生物可以被修饰以包含一或多种编码催化一或多种中间物 (例如乙酰CoA和丙酰CoA;巴豆酰CoA;和/或甲酸）向丁二烯转化的酶的多核苷酸。在 一些实施例中，多核苷酸可以编码丁二烯制造路径中催化一或多种中间物转化的酶。在一 些实施例中，多核苷酸可以被修饰（例如遗传工程化）以调节（例如增大或减小）编码的 酶的底物特异性，或多核苷酸可以被修饰以改变编码的酶的底物特异性（例如编码对一底 物具有特异性的酶的多核苷酸可以被修饰以使得酶对另一底物具有特异性）。优选的微生 物可以包含编码如表1-3和图1-3中的任一者中陈列的酶的多核苷酸。
[0093] 微生物可以包含一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯转化的酶 的多核苷酸。在一些实施例中，一或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯转 化的酶的多核苷酸可以包括（但不限于）：
[0094] - -或多种编码路径中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA转化的酶（例如硫 解酶）的多核苷酸；
[0095] -一或多种编码路径中催化酮戊酰CoA向（R)或（S) 3-羟基戊酰CoA转化的酶（例 如羟基戊酰CoA脱氢酶）的多核苷酸；
[0096] -一或多种编码路径中催化（R)或（S)羟基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA转化的酶 (例如羟基戊酰CoA脱水酶）的多核苷酸；
[0097] -一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸转化的酶（例如戊烯酰CoA 水解酶或转移酶）的多核苷酸；
[0098] --或多种编码路径中催化2-戊烯酸向丁二烯转化的酶（例如2-戊烯酸脱羧酶） 的多核苷酸；
[0099] -一或多种编码路径中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸转化的酶（例如移位C = C键 异构酶）的多核苷酸；
[0100] --或多种编码路径中催化4-戊烯酸向丁二烯转化的酶（例如4-戊烯酸脱羧酶） 的多核苷酸；
[0101] -一或多种编码路径中催化2-戊烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酰CoA转化的酶（例如 戊烯酰CoA脱氢酶）的多核苷酸；
[0102] - -或多种编码路径中催化戊_2, 4-二烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酸转化的酶（例 如戊-2, 4-二烯酰CoA水解酶或转移酶）的多核苷酸；和/或
[0103] --或多种编码路径中催化2, 4-戊烯酸向丁二烯转化的酶（例如戊-2, 4-二烯酸 脱羧酶）的多核苷酸。
[0104] 在一些实施例中，微生物进一步包含一或多种编码路径中催化可发酵碳源（例如 葡萄糖）向甲基丙二酰CoA和/或丙烯酰CoA转化的酶的多核苷酸。
[0105] 在一些实施例中，提供一种微生物，其包含一或多种以上多核苷酸，包括所有的以 上多核苷酸。
[0106] 将乙酰CoA和丙酰CoA转化为丁二烯的例示性酶以及其作用的底物和其制造的产 物呈现于下表1中。表1中表示的酶编号与图1中所用的酶编号有关，所述图示意地表示 可发酵碳源经由乙酰CoA和丙酰CoA中间物向丁二烯的酶促转化。
[0107] 表1 :经由乙酰CoA和丙酰CoA中间物制造丁二烯.
[0108]
【权利要求】
1. 一种从可发酵碳源制造了二締的方法，所述方法包含： a. )提供可发酵碳源； b. )使所述可发酵碳源与微生物在发酵培养基中接触，所述微生物包含一或多种编码 在了二締制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多核巧酸， 和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向了二締转化的酶的多核巧酸；W及 C.)使所述一或多种编码在了二締制造路径中所述路径中催化所述可发酵碳源向一或 多种中间物转化的所述酶的多核巧酸、和所述一或多种编码路径中催化所述一或多种中间 物向了二締转化的酶的多核巧酸在所述微生物中表达，W制造了二締。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在所述了二締制造路径中催化所述可发酵碳源向 一或多种中间物转化的所述酶陈列于表1到3中的任一者中。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中催化所述一或多种中间物向了二締转化的所述酶 陈列于表1到3中的任一者中。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中了二締经由己酷CoA和丙酷CoA中间物；己豆酷 CoA中间物讯/或甲酸中间物来制造。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包含一或多种编码路径中催化己酷 CoA和丙酷CoA向酬戊酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化酬戊酷CoA 向（时或（巧3-哲基戊酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化（时或（S) 哲基戊酷CoA向2-戊締酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化2-戊締酷 CoA向2-戊締酸转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化2-戊締酸向了二締转化 的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化2-戊締酸向4-戊締酸转化的酶的多核巧酸； 一或多种编码路径中催化4-戊締酸向了二締转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中 催化2-戊締酷CoA向戊-2, 4-二締酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化 戊-2, 4-二締酷CoA向戊-2, 4-二締酸转化的酶的多核巧酸；和/或一或多种编码路径中 催化2, 4-戊締酸向了二締转化的酶的多核巧酸。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包含一或多种编码路径中催化己豆酷 CoA向己豆醇转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化己豆酷CoA向己豆醒转化的 酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化己豆醒向己豆醇转化的酶的多核巧酸；和/或一 或多种编码路径中催化己豆醇向了二締转化的酶的多核巧酸。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包含一或多种编码路径中催化C0 2向 甲酸转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化丙酬酸醋和CoA向己酷CoA和甲酸转 化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化甲酸向甲酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或 多种编码路径中催化2己酷CoA向己酷己酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径 中催化己酷己酷CoA和甲酷CoA向3, 5-酬戊酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码 路径中催化3, 5-酬戊酷CoA向（时或（訂-5-哲基-3-酬戊酷CoA转化的酶的多核巧酸； 一或多种编码路径中催化（时或（S)-5-哲基-3-酬戊酷CoA向（时或（S)-3, 5-二哲基戊 酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化（时或（S)-3, 5-二哲基戊酷CoA向 (时或（巧3-哲基-4-戊締酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化（时或 (S) -3-哲基-4-戊締酷CoA向3-哲基-4-戊締酸转化的酶的多核巧酸；和/或一或多种 编码路径中催化3-哲基-4-戊締酸向了二締转化的酶的多核巧酸。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是选自由W下组成的属的细 菌；伯克霍尔德菌属炬urldiolderia)、丙酸杆菌属（Propionibacterium)、丙酸螺菌 属（Propionispira)、梭菌属（Clostridium)、芽抱杆菌属炬acillus)、埃希氏菌属 巧scherichia)、暗杆菌属（Pelobacter)或乳杆菌属（Lactobacillus)。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是真核生物，是酵母、丝状真菌、原生 动物或藻类。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、运动发酵单胞菌狂ymomonas mobilis)或己斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源是甘庶汁、甘庶糖蜜、水解淀粉、水解木 质纤维素材料、葡萄糖、庶糖、果糖、乳酸醋、乳糖、木糖、丙酬酸醋或甘油，呈其任何形式或 混合物形式。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源是单糖、寡糖或多糖。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述了二締由所述微生物分泌到所述发酵培养 基中。
14. 根据权利要求13所述的方法，其进一步包含从所述发酵培养基回收所述了二締。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物已经遗传修饰，W使所述一或多种编 码在所述了二締制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶的多 核巧酸、和所述一或多种编码路径中催化一或多种中间物向了二締转化的酶的多核巧酸表 达。
16. 根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述可发酵碳源向了二締 的所述转化是ATP阳性，并且当与NADH消耗路径组合时，它可W提供了二締制造的厌氧过 程。
17. -种微生物，其包含一或多种编码在了二締制造路径中路径中催化可发酵碳源向 一或多种中间物转化的酶的多核巧酸、和一或多种编码路径中催化所述一或多种中间物向 了二締转化的酶的多核巧酸。
18. 根据权利要求17所述的微生物，其中在所述了二締制造路径中催化所述可发酵碳 源向一或多种中间物转化的所述酶陈列于表1到3中的任一者中。
19. 根据权利要求17所述的微生物，其中催化所述一或多种中间物向了二締转化的所 述酶陈列于表1到3中的任一者中。
20. 根据权利要求17所述的微生物，其中了二締经由己酷CoA和丙酷CoA中间物；己 豆酷CoA中间物讯/或甲酸中间物来制造。
21. 根据权利要求17所述的微生物，其中所述微生物包含一或多种编码路径中催化 己酷CoA和丙酷CoA向酬戊酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化酬戊酷 CoA向（时或（巧3-哲基戊酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化（时或 (巧哲基戊酷CoA向2-戊締酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化2-戊 締酷CoA向2-戊締酸转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化2-戊締酸向了二締 转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化2-戊締酸向4-戊締酸转化的酶的多核巧 酸；一或多种编码路径中催化4-戊締酸向了二締转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径 中催化2-戊締酷CoA向戊-2, 4-二締酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催 化戊-2, 4-二締酷CoA向戊-2, 4-二締酸转化的酶的多核巧酸；和/或一或多种编码路径 中催化2, 4-戊締酸向了二締转化的酶的多核巧酸。
22. 根据权利要求17所述的微生物，其中所述微生物包含一或多种编码路径中催化己 豆酷CoA向己豆醇转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化己豆酷CoA向己豆醒转 化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化己豆醒向己豆醇转化的酶的多核巧酸；和/ 或一或多种编码路径中催化己豆醇向了二締转化的酶的多核巧酸。
23. 根据权利要求17所述的微生物，其中所述微生物包含一或多种编码路径中催化 (?向甲酸转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化丙酬酸醋和CoA向己酷CoA和甲 酸转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化甲酸向甲酷CoA转化的酶的多核巧酸； 一或多种编码路径中催化2己酷CoA向己酷己酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码 路径中催化己酷己酷CoA和甲酷CoA向3, 5-酬戊酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编 码路径中催化3, 5-酬戊酷CoA向（时或（S)-5-哲基-3-酬戊酷CoA转化的酶的多核巧酸； 一或多种编码路径中催化（时或（S)-5-哲基-3-酬戊酷CoA向（时或（S)-3, 5-二哲基戊 酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化（时或（S)-3, 5-二哲基戊酷CoA向 (时或（巧3-哲基-4-戊締酷CoA转化的酶的多核巧酸；一或多种编码路径中催化（时或 (S) -3-哲基-4-戊締酷CoA向3-哲基-4-戊締酸转化的酶的多核巧酸；和/或一或多种 编码路径中催化3-哲基-4-戊締酸向了二締转化的酶的多核巧酸。
24. 根据权利要求17所述的微生物，其中所述微生物是选自由W下组成的属的细菌： 伯克霍尔德菌属、丙酸杆菌属、丙酸螺菌属、梭菌属、芽抱杆菌属、埃希氏菌属、暗杆菌属或 乳杆菌属。
25. 根据权利要求17所述的微生物，其中所述微生物是真核生物，是酵母、丝状真菌、 原生动物或藻类。
26. 根据权利要求25所述的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母、运动发酵单胞菌或己 斯德毕赤酵母。
27. 根据权利要求17所述的微生物，其中所述微生物已经遗传修饰，W使所述一或多 种编码在所述了二締制造路径中路径中催化所述可发酵碳源向一或多种中间物转化的酶 的多核巧酸、和所述一或多种编码路径中催化一或多种中间物向了二締转化的酶的多核巧 酸表达。
【文档编号】C12P5/02GK104471068SQ201280069265
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2011年12月16日
【发明者】马特乌斯·施莱纳·加尔赛斯罗佩斯, 阿芙拉姆·迈克尔·斯洛维奇, 尤里·埃斯特拉达·戈维亚, 约翰纳·林科内斯·佩雷斯, 卢卡斯·彭德森·帕里奇 申请人:布拉斯科南美公司(巴西)