专利名称：番茄环斑病毒的rt-lamp检测方法
技术领域：
本发明涉及番茄环斑病毒的检测技术，具体涉及番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。
背景技术：
番爺环斑病毒(Jomato ring spot virus, ToRSV)属于5[豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的RNA病毒，为我国对外公布的禁止进境检疫性有害生物，其寄主范围广，据报道可侵染35科105属157种以上的植物。它是侵染百合、葡萄、苹果、玫瑰、唐菖蒲、水仙、大丽花、兰花番茄、菜豆、黄瓜和烟草等经济作物的重要致病病原。目前，国内外针对ToRSV的检测方法，包括鉴别寄主反应(生物学方法)、电镜观察、血清学试验和核酸杂交以及PCR检测等分子生物学手段，PCR检测复杂，检测慢至少要3.5 h，灵敏度较低，检测结果判断较难。由于番茄环斑病毒的症状变化多样，常有隐症现象，均给常 规诊断带来困难，甚至出现漏检，需要更加准确和灵敏的检测方法。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)作为一种新颖的核酸扩增方法，同样具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点；该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6 8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60°C 65°C进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1h 2.5 h，检测周期非常短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其步骤如下:
a、总RNA提取:检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA ;具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；
b、RT-LAMP扩增:20μ L的RT-LAMP扩增反应体系为2 X反应缓冲液10 μ L，浓度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，浓度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，样品总RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量为ddH20，该扩增反应体系中，引物F3和B3的终浓度各为0.2 μ M，引物Loopl和Loop2的终浓度各为0.8 μ M，引物FIP和BIP的终浓度各为1.6μΜ,其中引物F3的核苷酸序列为cagggctcga atggcact,引物B3的核苷酸序列Scctctaaaaa ggaggttgct gc,引物 Loopl 的核苷酸序列为 tggcgcaacg ataataaaag g,引物Loop2的核苷酸序列为attttggctg acggacaagg,引物FIP的核苷酸序列为ctccaatgtgagactcggca tctttttggg acagcactta caacctgttc,引物 BIP 的核昔酸序列为 cgcatatcaaaggccccatt ttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc,反应条件为 60 65°C 的恒温水浴锅中扩增0.5 I h，得到扩增产物；
C、在扩增产物中加入0.1ii L的荧光染料SYBR green I，若呈绿色则样品中感染有番茄环斑病毒，若呈橙红色则样品中无番茄环斑病毒。与现有技术相比，本发明的优点在于番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法，通过样品RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应只需I h 2.5 h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是RT-PCR检测的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可现场实时检测，因此本发明是一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1
1、根据GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中已登录的番爺环斑病毒的外壳蛋白基因序列(D12477)，采用Blast程序进行同源性比较，在序列的保守区，使用PrimerExpress 3.0软件，设计得到F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2共6条引物，其分别识别外壳蛋白编码基因的8个位点；引物F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2由上海英骏生物技术公司合成，引物F3的核苷酸序列为cagggctcga atggcact,引物B3的核苷酸序列为cctctaaaaaggaggttgct gc,引物 Loopl 的核苷酸序列为 tggcgcaacg ataataaaag g,引物 Loop2 的核苷酸序列为 attttggctg acggacaagg,引物 FIP 的核苷酸序列为 ctccaatgtg agactcggcatctttttggg acagcactta caacctgttc,引物 BIP 的核苷酸序列为 cgcatatcaa aggccccattttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc ；
2、RT-LAMP扩增反应体系建立:2X反应缓冲液10 u L，浓度5 U/ y L的Bst DNA聚合酶1.5 ii L，浓度5 U/ ii L的AMV RNA聚合酶I y L，样品总RNAl y L，引物F3和B3终浓度各为0.2 ii M，引物Loopl和Loop2终浓度各为0.8 y M，引物FIP和BIP终浓度各为1.6 y M，ddH20补充至20 ii L ; Bst DNA聚合酶和AMV RNA聚合酶均购于北京美莱博医学科技有限公司；
3、反应条件优化:用上述RT-LAMP扩增反应体系对番茄环斑病毒标准样品(购于美国Agdia公司)进行扩增，扩增反应时间分别设定为:30 min、60 min和90 min，结果都可以看到沉淀，扩增产物加0.1 ii L的荧光染料SYBR green I (购自上海生物工程公司)，都呈绿色，因此选取30 60 min的反应时间；扩增反应水浴温度分别设定为60°C、63°C和65°C，结果都可以看到沉淀，扩增产物加0.1 ii L的荧光染料SYBR green I，扩增产物亮度在三个不同温度之间没有明显的差异，所以扩增反应温度优选较低60°C ；
4、RT-LAMP特异性试验:用上述RT-LAMP扩增反应体系分别对番茄环斑病毒二个样品、烟草环斑病毒一个样品(TbAacco ringspotTRSV)、香石竹环斑病毒一个样品(.Carnation ringspot virus, CRSV)、黄瓜绿斑驳病毒一个样品green mottlemosaic Firw1S, CGMMV)、南 芥菜花叶病毒一个样品 ClraW1S mosaic Firw1S, ArMV)和马铃薯V病毒一个样品virus K, PVV)进行扩增,上述样品均购于美国Agdia公司，反应时间60min，水浴温度为60°C，结果番茄环斑病毒二个样品都可以看到沉淀，扩增产物加0.1 y L的荧光染料SYBR green I，都呈绿色，其它样品无沉淀，SYBR green I染色后为橙红色，说明RT-LAMP扩增反应体系对番茄环斑病毒特异。实施例2
1、2克烟草环斑病毒阳性百合叶样品(样品由上海检验检疫局提供)经约50毫升液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂(购自上海生物工程公司)提取总RNA，得到样品总RNA ;具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；
2,RT-LAMP灵敏性试验:用RT-PCR反应体系和上述RT-LAMP扩增反应体系分别对样品总RNA进行扩增反应，RT-PCR反应体系引物为F3和B3，试剂盒为One-st印RNA PCR kit(购自大连TaKaRa公司)，PCR反应条件如下:50°C cDNA合成30 min，94°C预变性2 min ；94°C变性30 s，58°C复性30 s，72°C延伸I min，35个循环；最后72°C延伸5 min。样品总RNA浓度分别为原液，原 液的10 — \ 10 —2、10 —3、10 —4和10 —5稀释液，RT-LAMP扩增反应时间60min，水浴温度为60°C，结果原液及原液的10 — 1和10 —2稀释液看到沉淀，扩增产物加0.1y L的荧光染料SYBR green I，原液及原液的10 —\ 10 —2、10 —3稀释液都呈绿色；RT-PCR只有原液有荧光反应，因此RT-LAMP扩增灵敏度是RT-PCR的100倍以上，也说明百合叶中感染有番茄环斑病毒。实施例3
上述RT-LAMP扩增反应体系分别对葡萄、苹果、玫瑰、和水仙叶样品进行检测；检测方法同实施例2，只是水浴温度为65°C，结果苹果叶扩增产物有沉淀，0.1 u L的荧光染料SYBRgreen I后呈绿色，水仙叶扩增产物混浊，0.1 u L的荧光染料SYBR green I后呈绿色，葡萄和玫瑰扩增产物无沉淀，0.1 u L的荧光染料SYBR green I后呈橙红色，说明苹果叶和水仙叶中感染有番茄环斑病毒，葡萄和玫瑰叶中未感染番茄环斑病毒。
权利要求
1.茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于步骤如下: a、总RNA提取:检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA，具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行； b、RT-LAMP扩增:20μ L的RT-LAMP扩增反应体系为2 X反应缓冲液10 μ L，浓度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，浓度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，样品总RNAl μ L，弓丨物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量为ddH20，该扩增反应体系中，引物F3和B3的终浓度各为0.2 μ M，引物Loopl和Loop2的终浓度各为0.8 μ M，引物FIP和BIP的终浓度各为1.6μΜ,其中引物F3的核苷酸序列为cagggctcga atggcact,引物B3的核苷酸序列Scctctaaaaa ggaggttgct gc,引物 Loopl 的核苷酸序列为 tggcgcaacg ataataaaag g,引物Loop2的核苷酸序列为attttggctg acggacaagg,引物FIP的核苷酸序列为ctccaatgtgagactcggca tctttttggg acagcactta caacctgttc,引物 BIP 的核昔酸序列为 cgcatatcaaaggccccatt ttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc,反应条件为 60 65°C 的恒温水浴锅中扩增0.5 I h，得到扩增产物； C、在扩增产物中加入0.1 μ L的荧光染料SYBR green I，若呈绿色则样品中感染有番茄环斑病毒，若呈橙红色则样品中无番茄环斑病毒。
全文摘要
本发明公开了番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法，通过样品RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应只需1h～2.5h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是RT-PCR检测的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可现场实时检测，因此本发明是一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。
文档编号C12Q1/68GK103088161SQ20131001218
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者张吉红, 顾建锋, 余澍琼, 闻伟刚 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院