专利名称：CEACAMl蛋白磁粒的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人癌胚抗原相关细胞黏附分子l(CEACAMl)细胞外特定结构域融合蛋白的表达、纯化的方法和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。
背景技术：
癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1，NCBI GenBank:NM_001712)是广泛表达于中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞及淋巴细胞表面的跨膜糖蛋白，属癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族粘附分子，其生物学功能包括促进血管的形成，调节血管的重塑，参与细胞凋亡的调控、促进腺体管腔的形成及调控胰岛素的清除以维持细胞对胰岛素的敏感性，同时CEACAM1也是致病微生物的粘着受体。淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides, NM)通过其细胞膜表面的Opa(colonyopacity-associated)蛋白与粘膜上皮和内皮细胞的CEACAM1受体结合，使其粘附并侵入细胞，以利于吞噬细胞吞噬。Opa蛋白是存在于NG和NM细胞壁上的膜蛋白，是这两种致病微生物的主要侵袭蛋白。微纳米磁粒是通过化学反应产生的以Fe304为核心的超磁性颗粒，其大小为200ηπΓ μ m，具有无磁记忆性，表面积大的特点，可在其表面包裹自由羧基、羟基等基团，再通过偶联剂与蛋白质等生物大分子结合，目前被用于核酸、蛋白质、细胞的分离纯化，肿瘤的定向靶诊断与治疗。目前的研究已经克隆表达了CEACAM1细胞外的部分结构域，并获得纯度较高的蛋白，但还没有相应制备CEACAM1蛋白磁粒复合物，用于淋病奈瑟氏菌的快速分离，以提高临床诊断的敏感性和特异性的相关技术报道，也没有CEACAM1与水体蓝藻相互作用的报道。
微纳米磁粒是后基因组时代生物大分子和细胞分离纯化的有力武器，具有快速、特异性高、无毒、无污染、有利于机械自动化大样本处理的新技术材料，可在其表面包被带正电荷的娃、金属镍、及不同的蛋白质如蛋白A等,可应用于DNA、RNA> mRNA、抗体、蛋白质、细胞、病毒和细菌的分离纯化1-3。但该技术仅国外少数几个公司(如挪威的Dynabeads)拥有且保密，售价很高，普及受限。CEACAM1属I型膜蛋白，广泛存在于白细胞、内皮细胞和上皮细胞的细胞膜上4_6，该蛋白具有许多重要的生物学功能，如能抑制肿瘤及上皮细胞的生长和增殖7’8，抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性效应9’1(1，延迟粒细胞和单核细胞的凋亡n，通过调控胰岛素的清除而维持细胞对胰岛素的敏感性12’13。该蛋白分子量51KDa，由细胞外、跨膜区、胞质内三个结构域组成，胞外结构域与细胞间的同质粘附(homotypic adhesion)和异质粘附(heterotypic adhesion)有关1446,该结构域通过剪切可激活caspase-Ι和_3参与细胞凋亡的调控17。胞内结构域由C端的12 14个氨基酸组成，与细胞生长和信号传导有关18。CEACAM1在表达时有不同的剪切体，它们的差异主要在胞内结构域，据此分为长短两型，而胞外结构域是较保守的19’2°。奈瑟氏菌常寄生于动物粘膜表层，Opa是这该类革蓝氏染色阴性细菌细胞壁上的粘附蛋白，在细菌粘着及侵入粘膜上皮和内皮细胞中起重要作用，同时它也是中性粒细胞、巨噬细胞及⑶4+T淋巴细胞的免疫调节剂9’14，是该类细菌的主要抗原。Opa蛋白虽然像其它细菌抗原一样，为逃避宿主免疫，其基因和氨基酸序列会发生突变，但在体外的研究中发现，在绝大部分突变体中，Opa蛋白仍能与CEACAM1结合21_24，其突变区域与其它受体的结合有关，这说明Opa蛋白具有与宿主细胞膜多种受体结合的潜力，但无论怎样突变，它仍然保持其与CEACAM1结合的最基本的功能。淋病奈瑟氏菌是性传播疾病淋病的主要病原体。淋病在我国各种法定传染病中发病率仅次于疟疾和肝炎居第3位25。大多起病急，传染性强，近年来其感染率略有下降，但在很多地区仍是优势病种，及时、准确的诊断，对于淋病的防治具有重要意义。目前临床对淋病奈瑟氏菌实验室检测方法有四种，革兰氏染色镜检；PCR检测法；细菌培养；试纸法。其中最具临床价值的是细菌培养，是淋病诊断的“金标准”，但需要2-3天，阳性率20-30%，并且仅在较少部分医院开展，采用传统的取样涂片方法其敏感性仅为10%左右，PCR检测法虽然敏感性较高，但特异性较低26'27。本发明拟采用自行研发的CEACAM1蛋白磁粒复合物开展淋病奈瑟氏菌的快速分离检测方法的研究，具有较高的临床应用及研究价值。 蓝藻(bluealgae)又名蓝细菌(Cyanobacteria)、蓝绿藻(blue-green algae),主要特征是是原核，不具载色体，色素主要为叶绿素a，贮藏物质主要是蓝藻淀粉，细胞壁主要成分为粘肽，革兰氏阴性，能进行产氧性光合作用。滇池是云南高原上面积最大的淡水湖泊，素有“高原明珠”之称。但自20世纪80年代以来，入湖污染物不断增力口，导致湖内蓝藻大量繁殖，在藻类生长的高峰季节，会形成严重的蓝藻“水华”现象，现已属重富营养化水体。2002年的一项调查中共鉴定出浮游植物106种及变种，隶属于绿藻门(Chlorophyta)、娃藻门(Bacillariophyta)、蓝藻门(Cyanophata)、隐藻门(Cryptophyta)、甲藻门(Pyrrophyta)和裸藻门(Euglenophyta)等6个门。在浮游植物数量上占绝对优势的是蓝藻门的微囊藻属(Mi crocystis Kutz.),尤以铜绿微囊藻(M. aerginosaKutz.)最多，其次是惠氏微囊藻(M. weissenbergi i (Kom.)Kom.1n Kondr.)28 目前，国内外去除蓝藻的方法主要有生物法、化学法和物理法三种29。生物法除藻具有综合效益，但见效慢、周期长。化学药剂法除藻工艺简单，操作方便，但是会造成二次污染，现已较少使用。物理法除藻主要有机械清除、人工打捞、活性炭吸附等方法。其中，机械清除法除藻效果好、处理量大，但成本高；人工打捞、超声波和电磁波除藻处理量小，只适合小范围除藻；活性炭吸附对藻类的去除效果很好，但活性炭再生比较困难，因此，处理成本很闻。
发明内容
本发明的目的是提供一种CEACAM1蛋白磁粒复合物，并成功用此复合物对淋病奈瑟氏菌及水体蓝藻进行了分离，为淋病奈瑟氏菌的临床检测及水体蓝藻的分离去除提供一种高效、快捷无污染的方法。本发明的技术方案是以人体肝细胞cDNA文库为模板，扩增目的基因人体CEACAM1，通过异源表达技术在大肠杆菌(E. coli BL21)中表达CEACAM1细胞外特定结构域蛋白；通过对该蛋白质进行变复性及凝胶过滤层析，得到可溶的CEACAM1融合蛋白；以Fe3O4为载体，经硅酸包衣，在酸性环境中与硅烷反应、在碱性环境中与戌二酸酐反应，制成CEACAM1蛋白磁粒。本发明的具体技术步骤为以人体肝细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增目的基因人体 CEACAM1，所用的一对弓丨物序列为 Ceacaml-F: 5’ -AAAGGATCCATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3’ ， Ceacaml-R:5’-GAAACTCGAGTTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3’ ，将经 BamHI/XhoI 处理过的人体CEACAM1编码区序列和pET-28a(+)连接构建表达载体；把构建好的表达载体转化E. coli BL21 (DE3)，经IPTG诱导后，E. coliBL21 (DE3)大量表达包涵体形式的人体CEACAM1 ;包涵体洗涤及重悬浮后，依次经过变性、凝胶过滤层析、复性和二次凝胶过滤层析，获得可溶的人体CEACAM1 ；以Fe3O4为载体，经硅酸包衣后，先后在酸性环境中与硅烷反应、在碱性环境中与戌二酸酐反应，制成表面带有活性羧基的磁性微球；羧化磁珠经结合液清洗并重悬后，加入CEACAM1融合蛋白及偶联剂，室温振摇2(Γ24小时，即成为CEACAM1蛋白磁粒复合物。通过此方法制备的CEACAM1蛋白磁粒复合物，核心部分为表面带有活性羧基的磁性微球，外层为以共价键与羧基结合的CEACAM1融合蛋白，整个复合物表面直径约200nm lumo通过此方法制备的CEACAM1蛋白磁粒复合物可应用于制备分离检测淋病奈瑟氏菌的复合物中。通过此方法制备的CEACAM1蛋白磁粒复合物可应用于制备分离检测水体蓝藻的复合物中。 本发明的有益技术效果是制备出的CEACAM1蛋白磁粒复合物是表面包被有CEACAM1融合蛋白的磁性微粒，直径约200nnTlum，具有较大的比表面积，增加了与微生物的结合能力，特异性高，可高效、特异、快速、方便地应用于淋病奈瑟氏菌及蓝藻的微生物分离。该方法的技术优点有；构建的pET_28a(+)CEACAMl表达质粒在大肠杆菌中以包涵体的形式表达目的蛋白，经过尿素变复性、凝胶过滤层析可获得电泳纯的有功能的目的蛋白，产量高，生产成本低；CEACAM1蛋白磁粒的制备方法简单，生产成本较低，对环境无污染。应用CEACAM1蛋白磁粒分离淋病奈瑟氏菌及蓝藻，方法高效、特异、快速、方便，所使用的化学试剂均无毒，并且对环境无污染；CEACAM1蛋白磁粒可再生使用。
具体实施例方式以人体肝细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增目的基因人体CEACAMI (NCBIAccessionNo. :NM_001712)，所用引物序列为 Ceacaml-F:5，-GAAAGGATCC ATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3，，Ceacaml-R:5，-GAAACTCGAG TTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3’。将经BamHI/XhoI处理过的人体CEACAMI编码区序列和pET_28a(+)连接构建表达载体。把构建好的表达载体转化E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，E. coli BL21(DE3)大量表达包涵体形式的人体CEACAMI。包涵体洗涤及重悬浮后，依次经过变性、凝胶过滤层析、复性和二次凝胶过滤层析，获得较高纯度的人体CEACAMI。以Fe3O4为载体，经硅酸包衣后，先后在高温酸性环境中与硅烷反应、在常温碱性环境中与戌二酸酐反应，制成表面带有活性羧基的磁性微球。羧化磁珠经结合液清洗并重悬后，加入CEACAMI融合蛋白及偶联剂，室温振摇20~24小时，即成为CEACAMI蛋白磁粒复合物。往悬浮于结合液中的CEACAMI蛋白磁粒复合物中加入样本(人体尿道分泌物或者富营养化污水)，室温下轻轻振摇1(Γ15分钟，磁力吸附2分钟后，弃上清，洗脱液重悬磁粒，取上清检测。具体步骤如下1.人体CEACAMI编码区序列的获得I) PCR扩增体系在PCR反应管中按下列组成配制反应液
权利要求
1.一种CEACAM1蛋白磁粒的制备方法，其特征是以人体肝细胞cDNA文库为模板，扩增目的基因人体CEACAM1，通过异源表达技术在大肠杆菌(E. coli BL21)中表达CEACAM1细胞外特定结构域蛋白；通过对该蛋白质进行变复性及凝胶过滤层析，得到可溶的CEACAM1融合蛋白；以Fe3O4为载体，经硅酸包衣，在酸性环境中与硅烷反应、在碱性环境中与戌二酸酐反应，制成CEACAM1蛋白磁粒。
2.按权利要求1所述的CEACAM1蛋白磁粒的制备方法，其特征及具体步骤为以人体肝细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增目的基因人体CEACAM1，所用的一对引物序列为Ceacaml-F:5’-AAAGGATCCATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3’ ， Ceacaml-R:5’- GAAACTCGAGTTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3’，将经BamHI/XhoI处理过的人体CEACAM1编码区序列和pET_28a(+)连接构建表达载体；把构建好的表达载体转化万.coli BL21 (DE3)，经IPTG诱导后，E. coliBL21 (DE3)大量表达包涵体形式的人体CEACAM1 ;包涵体洗涤及重悬浮后，依次经过变性、凝胶过滤层析、复性和二次凝胶过滤层析，获得可溶的人体CEACAM1 ；以Fe3O4为载体，经硅酸包衣后，先后在酸性环境中与硅烷反应、在碱性环境中与戌二酸酐反应，制成表面带有活性羧基的磁性微球；羧化磁珠经结合液清洗并重悬后，加入CEACAM1融合蛋白及偶联剂，室温振摇20 24小时，即成为CEACAM1蛋白磁粒复合物。
3.按权利要求1所述的CEACAM1蛋白磁粒的制备方法，其特征是通过此方法制备的CEACAM1蛋白磁粒复合物，核心部分为表面带有活性羧基的磁性微球，外层为以共价键与羧基结合的CEACAM1融合蛋白，整个复合物表面直径约200nm lum。
4.一种权利要求1、2或3所述的方法在制备分离检测淋病奈瑟氏菌的CEACAM1蛋白磁粒复合物中的应用。
5.一种权利要求1、2或3所述的方法在制备分离检测水体蓝藻的CEACAM1蛋白磁粒复合物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种人癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAMl)细胞外特定结构域融合蛋白的表达、纯化的方法和应用。本发明以人体肝细胞cDNA文库为模板，扩增目的基因人体CEACAM1，通过异源表达技术在大肠杆菌(E.coliBL21)中表达CEACAM1细胞外特定结构域蛋白；通过对该蛋白质进行变复性及凝胶过滤层析，得到可溶的CEACAMl融合蛋白；以Fe3O4为载体，经硅酸包衣，在酸性环境中与硅烷反应、在碱性环境中与戌二酸酐反应，制成CEACAMl蛋白磁粒。本发明能大量生产较高纯度的人癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAMl)细胞外特定结构域，并且以其为基本成分制备了一种微纳米磁粒-CEACAM1复合物。现阶段研究表明，该复合物可以用于淋病奈瑟氏菌和蓝藻的快速分离检测，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/89GK103060361SQ201310030348
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者孟照辉, 谢月辉, 李玉叶, 叶秋芳 申请人:昆明医科大学第一附属医院