原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，其通过高通量测序技术对原发性IgA肾病患者和正常组的肾脏组织总RNA分析处理得到原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA，深入研究这些差异表达的miRNA将有助于进一步阐明原发性IgA肾病的发病机理，为原发性IgA肾病的诊断和治疗提供新途径。上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种原发性IgA肾病差异表达miRNA的图谱模型，获取作为中间结果的原发性IgA肾病的相关信息。
【专利说明】原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肾病研究领域，尤其是涉及一种原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法和应用。
【背景技术】
[0002]原发性IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是以IgA为主的免疫球蛋白弥漫沉积在肾小球系膜区以及毛细血管袢，临床表现和病理改变各异的临床病理综合征。IgAN是世界上最常见的原发性肾小球疾病，亚洲多发，约占我国原发性肾小球肾炎30%~40%，也是导致终末期肾脏病的主要病因之一。迄今为止发病机制不明，具有种族地域差异性、临床表现多样、治疗缺乏靶向性、预后亦相差悬殊，给早期诊断和治疗造成了很大的困难。虽然目前IgAN的发病机制尚不清楚，但普遍认为常由多个微效基因的累加和某些环境因子的共同作用而致病，与遗传因素息息相关。
【发明内容】
[0003]基于此，有必要提供一种从遗传角度出发可应用与研究IgAN发病机制的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法和应用。
[0004]一种原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，包括如下步骤:
[0005]采集原发性IgA肾病患者和正常组的肾脏组织的细胞总RNA，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化出18~30nt长度的小RNA分子，将分离出的小RNA分子经反转录处理后形成cDNA片段，再对形成的cDNA片段的两端加上接头序列，经RT-PCR扩增后形成RNA文库；
[0006]对构建的所述RNA文库进行测序，然后对测序所得的序列进行去接头、去污染处理得到干净的小RNA分子序列并对所得的序列进行长度分布分析，去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA,将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析，获得原发性IgA肾病患者和正常组的已知miRNA的表达量信息；
[0007]将原发性IgA肾病患者和正常组中表达的已知miRNA的表达量归一化到同一量级，归一化公式为:归一化表达量=HiiRNA表达量/样品总表达量*106，使用Audic andClaverie test的统计方法比较原发性IgA肾病患者和正常组的miRNA表达差异,得到所述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA。
[0008]在其中一个实施例中，所述对构建的所述RNA文库进行测序是使用IlluminaHiSeq?2000测序仪对构建的所述RNA文库进行深度测序。
[0009]在其中一个实施例中，所述去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA是使用S0AP2.0软件将得到的所述干净的小RNA序列与repeatmarker、Genebank、Rfam、UCSC和piRNA数据库中的RNA序列进行比对分类处理。
[0010]在其中一个实施例中，所述miRNA数据库是miRBasel8.0。
[0011]在其中一个实施例中，所述使用Audic and Claverie test的统计方法比较原发性IgA肾病患者和正常组的miRNA表达差异过程中，选择对归一化处理后在任一组中表达量不小于10TPM的miRNA，若该miRNA在两组之间的倍比值不小于2且P值小于0.001，则该miRNA在原发性IgA肾病患者和正常组中差异表达。
[0012]上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法通过高通量测序技术对原发性IgA肾病患者和正常组的肾脏组织总RNA分析处理得到原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA，深入研究这些差异表达的miRNA将有助于进一步阐明原发性IgA肾病的发病机理，为原发性IgA肾病的诊断和治疗提供新途径。上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种原发性IgA肾病差异表达miRNA的图谱模型，获取作为中间结果的原发性IgA肾病的相关信息。
[0013]一种高通量测序平台，所述测序平台上固定有上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法得到的所述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA。
[0014]通过上述高通量测序，可以为初步诊断原发性IgA肾病提供中间结果信息，检测过程方便，不需要使用传统的繁杂的检测步骤，但由于原发性IgA肾病往往是一种综合病征，获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是原发性IgA肾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为IgAN组与NC组组织病理切片HE染色结果图，其中，放大倍数为400，A图是IgAN患者肾脏组织；B图是肾癌患者根治术后癌旁未经癌细胞浸润组织；
[0016]图2为显著性差异表达miRNAs靶基因GO生物学功能聚类图。
【具体实施方式】
[0017]下面主要结合附图及具体实施例对原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法及应用做进一步详细的说明。
[0018]一实施方式的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，包括如下步骤:
[0019]步骤SllO:采集原发性IgA肾病患者和正常组的肾脏组织的细胞总RNA，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化出18~30nt长度的小RNA分子，将分离出的小RNA分子经反转录处理后形成cDNA片段，再对形成的cDNA片段的两端加上接头序列，经RT-PCR扩增后形成RNA文库。
[0020]步骤S120:对构建的RNA文库进行测序，然后对测序所得的序列进行去接头、去污染处理得到干净的小RNA分子序列并对所得的序列进行长度分布分析，去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA,将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析，获得原发性IgA肾病患者和正常组的已知miRNA的表达量信息。
[0021]其中，对构建的RNA文库进行测序是使用Illumina HiSeq?2000测序仪对构建的RNA文库进行深度测序。去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA是使用S0AP2.0软件将得到的干净的小RNA序列与repeatmarker、Genebank、Rfam(10.1)、UCSC和piRNA数据库中的RNA序列进行比对分类处理。
[0022]miRNA 数据库是 miRBasel8.0。
[0023]步骤S130:将原发性IgA肾病患者和正常组中表达的已知miRNA的表达量归一化到同一量级，归一化公式为:归一化表达量=HiiRNA表达量/样品总表达量*106，使用Audicand Claverie test的统计方法比较原发性IgA肾病患者和正常组的miRNA表达差异,得到原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA。
[0024]其中，使用Audic and Claverie test的统计方法比较原发性IgA肾病患者和正常组的miRNA表达差异过程中，选择对归一化处理后在任一组中表达量不小于10TPM的miRNA,若该miRNA在两组之间的倍比值不小于2且P值小于0.001，则该miRNA在原发性IgA肾病患者和正常组中差异表达。
[0025]上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法通过高通量测序技术对原发性IgA肾病患者和正常组的肾脏组织总RNA分析处理得到原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA，深入研究这些差异表达的miRNA将有助于进一步阐明原发性IgA肾病的发病机理，为原发性IgA肾病的诊断和治疗提供新途径。上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种原发性IgA肾病差异表达miRNA的图谱模型，获取作为中间结果的原发性IgA肾病的相关信息。
[0026]此外，本实施方式还涉及一种高通量测序平台，测序平台上固定有上述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法得到的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA。
[0027]通过上述高通量测序，可以为初步诊断原发性IgA肾病提供中间结果信息，检测过程方便，不需要使用传统的繁杂的检测步骤，但由于原发性IgA肾病往往是一种综合病征，获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是原发性IgA肾病。
[0028]以下为具体实施例部分:
[0029]1、材料与方法
[0030]1.1研究对象
[0031 ] 本实施例选取6例(3男3女)原发性IgAN肾脏组织标本作为研究对象(IgAN组)，均由深圳市人民医院提供，所有标本经实验室检查综合确诊，并排除由过敏性紫癜、乙型肝炎病毒感染、肝硬化、肾移植术后等引起的继发性IgAN。所有标本需在光学显微镜下确认绝大部分组织为肾皮质且至少含有5个肾小球。
[0032]正常对照组(NC组)选自在深圳市人民医院行肾癌根治术的患者，选取病理检查正常的肾脏癌旁(距肉眼癌团> 3cm)正常组织6例(3男3女)肾皮质组织。
[0033]图1是IgAN组与NC组组织病理切片HE染色结果图。
[0034]本研究经深圳市人民医院伦理委员会批准，且征得所有患者知情同意。
[0035]1.2样本处理
[0036]样本获取后用无RNA酶的0.9%NaCl冲洗，用2ml的冻存管储存，在离体30min内经液氮速冻30min后再转入-80°C冰箱长久保存、备用。
[0037]1.3 总 RNA 提取
[0038]常温下解冻样本,按Trizol试剂盒(Invitrogen公司产品)说明书提取总RNA。经Agilent2000B1analyzer 分析仪检测合格后(RIN ≥ 8.0 且 28S/18S>1.5)，用于小 RNA 建库Illumina测序分析。
[0039]1.4小RNA文库制备和Illumina测序
[0040]分别将IgAN组和NC组样本同组等量混合(总量≤10 μ g),用于制备小RNA文库。首先用15%PAGE (聚丙烯酰胺凝胶)电泳在RNA混合样本中分离纯化出18~30nt长的小RNA分子，将切取出的小RNA片段经反转录等一系列处理后形成cDNA片段，再将接头连接到片段的两端，经RT-PCR扩增后制成小RNA文库。然后运用Illumina HiSeqTM2000测序仪进行深度测序。小RNA文库的制备和测序均在深圳华大基因研究院的协助下完成。
[0041]1.5小RNA数据处理和注释
[0042]首先对Illumina测序所得序列进行去接头、去低质量、去污染等处理，获得干净的小RNA分子序列并对其进行长度分布分析；然后运用SOAP (2.0)软件将干净序列与相关数据库(repeatmarker、Genbank、Rfam (10.1)、UCSC和piRNA数据库)进行序列比对分类注释，尽可能去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA、piRNA等非编码RNA序列；再将余下序列与miRNA数据库(miRBasel8.0)中人miRNA序列进行比对,获取两样本已知miRNA的含量、表达丰度等信息。
[0043]1.6两样本miRNA表达差异比较
[0044]对两个样本中表达的已知miRNA进行统计，判断在两样本之间的表达量是否存在显著性差异。首先将两样本miRNA表达量归一化到同一个量级(公式:归一化表达量(TPM)=miRNA表达量/样品总表达量*106);再使用Audic and Claverie test的统计方法比较两组样本miRNA的表达差异，并计算P值和倍比值。选择归一化后在任一组样本中表达量不小于10TPM的miRNA纳入研究，若该miRNA在两样本间的倍比值≤2且P〈0.001，则该miRNA在两样本间的表达差异显著。
[0045]2 结果
[0046]2.1小RNA序列分布和两组样品间小RNA共有及特有序列分析
[0047]运用Illumina高通量测序技术对两组样本进行深度测序，IgAN组和NC组测序所得总量分别为10492663条和14307074条，经去接头、去低质量、去污染等处理后，各得到干净序列10070601条和11796085条，所占比例分别为96.37%和94.85%。一般小RNA的长度区间为18~30nt，其中IgAN组的干净序列长度主要集中在20~24nt之间，占长度分布频率的92.44% ;而NC组主要集中在19~25nt之间，占长度分布频率的87.32%，如表1所示。
[0048]表1IgAN组与NC组的测序结果序列长度分布表
[0049]
【权利要求】
1.一种原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，其特征在于，包括如下步骤: 采集原发性IgA肾病患者和正常组的肾脏组织的细胞总RNA，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化出18~30nt长度的小RNA分子，将分离出的小RNA分子经反转录处理后形成cDNA片段，再对形成的cDNA片段的两端加上接头序列，经RT-PCR扩增后形成RNA文库； 对构建的所述RNA文库进行测序，然后对测序所得的序列进行去接头、去污染处理得到干净的小RNA分子序列并对所得的序列进行长度分布分析，去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA,将剩余的序列与miRNA数据库中人miRNA序列进行比对分析，获得原发性IgA肾病患者和正常组的已知miRNA的表达量信息；以及将原发性IgA肾病患者和正常组中表达的已知miRNA的表达量归一化到同一量级，归一化公式为:归一化表达量=miRNA表达量/样品总表达量*106,使用Audic and Claverie test的统计方法比较原发性IgA肾病患者和正常组的miRNA表达差异，得到所述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA。
2.如权利要求1所述的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，其特征在于，所述对构建的所述RNA文库进行测序是使用Illumina HiSeq?2000测序仪对构建的所述RNA文库进行深度测序。
3.如权利要求1所述的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，其特征在于，所述去除重复序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA是使用S0AP2.0软件将得到的所述干净的小RNA序列与repeatmarker、Genebank、Rfam、UCSC和PiRNA数据库中的RNA序列进行比对分类处理。
4.如权利要求1所述的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，其特征在于，所述miRNA数据库是miRBasel8.0。
5.如权利要求1所述的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法，其特征在于，所述使用Audic and Claverie test的统计方法比较原发性IgA肾病患者和正常组的miRNA表达差异过程中，选择对归一化处理后在任一组中表达量不小于1TPM的miRNA，若该miRNA在两组之间的倍比值不小于2且P值小于0.001，则该miRNA在原发性IgA肾病患者和正常组中差异表达。
6.一种高通量测序平台，其特征在于，所述测序平台上固定有如权利要求1-5中任一项所述的原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA的分析方法得到的所述原发性IgA肾病肾脏组织差异表达miRNA。
【文档编号】C12M1/00GK104046679SQ201310076687
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月11日 优先权日:2013年3月11日
【发明者】戴勇, 谭奎璧 申请人:戴勇, 谭奎璧