一种α-淀粉酶高产菌株及其发酵生产淀粉酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种α-淀粉酶高产菌及其筛选方法和应用，属于生物工程【技术领域】。本发明菌种为一株嗜热脂肪芽孢杆菌WSH13-17(Geobacillus?stearothermophilus)WSH13-17，于2013年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO:M2013013，是从淀粉厂土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较α-淀粉酶活性大小而得到。经液体深层发酵可得α-淀粉酶，酶活600U/mL。该α-淀粉酶可用于味精、啤酒、酒精等食品发酵行业。
【专利说明】一种Cl -淀粉酶高产菌株及其发酵生产淀粉酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种a -淀粉酶菌株及其应用，特别是一株高产a _淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]a -淀粉酶又称为液化型淀粉酶。它能从淀粉分子内部任意切开a _1，4键，产生分子量较小的糊精。a -淀粉酶具有相当大的工业应用价值，广泛用于酒精、有机酸、氨基酸及纺织等行业。目前工业生产中，a-淀粉酶一般采用微生物发酵法进行大规模生产，其中以地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌为主。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种a-淀粉酶高产菌株，于2013年I月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013013，系从淀粉厂土壤中分离得到的一株嗜热脂肪芽抱杆菌 WSH13-17 (Geobacillus stearothermophilus) WSH13-17。
[0004]嗜热脂肪芽孢杆菌的筛选方法是从淀粉厂土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较α -淀粉酶活性大小而得到。
[0005]一个α -淀粉酶酶活单位(IU)定义(U/mL) =ImL酶液在ρΗ6.0，温度70°C，Imin液化可溶性淀粉Img所需的酶量称为一个酶活力单位。
[0006]测定方法:准确吸取2mL2%可溶性淀粉溶液，置于IOmL比色管中，加0.5mLpH6.0磷酸缓冲溶液，摇匀，于70°C水浴预热5min，准确加入100 μ L稀释酶液(酶活力为每毫升60~65单位为宜)，立即计时，摇匀，于70°C水浴准确保温酶解反应5min，立即取出ImL反应液，置于含有0.5mL0.lmol/L盐酸溶液中终止酶解反应，加入5mL稀碘液，摇匀。以稀碘液为空白，Icm比色皿，660nm波长下测吸光度(A)。根据吸光度查表(表格详见GB8275-2009)，求得测试酶液的浓度。
[0007]α -淀粉酶酶活计算公式:X=cXnX 16.67
[0008]式中:
[0009]X—样品的酶活力，U/mL ；
[0010]c一测试酶样的浓度，U/mL ；
[0011]η—样品的稀释倍数；
[0012]16.67—根据酶活力定义计算的换算系数。
[0013]原碘液:称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮
存于棕色瓶中。
[0014]稀碘液:吸取原碘液2.0OmL,加20`.0g碘化钾用水溶解并定容至500mL，贮存于棕
色瓶中。
[0015]可溶性淀粉溶液(20g/L):称取2.0OOg可溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓慢加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌并加热至完全透明，冷却定容至lOOmL。溶液现配现用。[0016]磷酸缓冲液(pH=6.0):称取45.23g十二水和磷酸氢二钠和8.07g 一水柠檬酸，用水溶解并定容至1000mL。用pH计校准后使用。
[0017]本发明解决的另一个技术问题是提供一种采用嗜热脂肪芽孢杆菌WSH13-17 (Geobacillus stearothermophi lus) WSH13-17 为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得α-淀粉酶。
[0018]平板分离培养基(g/L):
[0019]蛋白胨10，可溶性淀粉10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20，曲利本蓝0.1，pH7.0。55°C培养箱中培养2-3d，测量D/d(水解圈直径/菌落直径)值，挑选值较大的进行初筛。
[0020]种子培养基(g/L)及培养条件:
[0021]蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7.0，55°C，摇瓶转速200转/分，培养时间为20-24小时。
[0022]发酵培养基(g/L)及发酵条件:
[0023]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，55°C，摇瓶转速200转/分，发酵时间44-48小时。
[0024]微量元素液(g/L):
[0025]ZnCl22, FeS042, H3BO30.065, MoNa2O40.135。
[0026]本发明的有益效果:提出了一种α-淀粉酶高产菌，用该菌株经液体深层发酵可制备α -淀粉酶，酶活达到600U/mL。
【具体实施方式】
[0027]实施案例I
[0028]从淀粉厂附近土壤，按“五点取样法”采取土样10份，从中分离菌株。将少量样品，放入烘箱80°C热处理20min，后称取样品5g加入装有45mL无菌水的小三角瓶中，静置lOmin，上清液取0.1mL梯度稀释(10_5，10_4，10_3)涂布于分离筛选平板上，55°C培养箱中培养2-3天，测量D/d(水解圈直径/菌落直径)值，挑选值较大的进行初筛。挑取单菌落进行3-4次平板划线。之后将筛选得到的几株菌纯化后在55°C进行液体培养。培养44-48h，取培养液离心后收集上清进行酶活测定，选取酶活高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的α-淀粉酶产生菌株。纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4 V保藏，保藏编号为CCTCCN0: Μ2013013，保藏机构为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0029]平板分离培养基(g/L):
[0030]蛋白胨10，可溶性淀粉10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20，曲利本蓝0.1，ρΗ7.0。
[0031]发酵培养基(g/L):
[0032]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，55°C，摇瓶转速200转/分，发酵时间44-48小时。
[0033]微量元素液(g/L):
[0034]ZnCl22，FeS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
[0035]实施案例2[0036]从斜面上刮取一环菌种，置于装有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中进行种子培养。条件为培养时间20-24h，温度55°C，摇床转速200rpm。再以5%接种量接入装有50mL发酵培养基的1OOmL三角瓶中进行发酵培养。条件为培养时间44-48h，温度55°C，摇床转速200rpm。即可得到酶活600U/mL的发酵液。
[0037]种子培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7.0。
[0038]发酵培养基(g/L):可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁
0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，ρΗ7.0。
【权利要求】
1.一种α-淀粉酶高产菌株，分类命名为嗜热脂肪芽孢杆菌WSH13-17 (Geobacillusstearothermophilus)WSH13-17，于2013年I月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC N0:M2013013o
2.权利要求1所述α-淀粉酶高产菌株的筛选方法，其特征是从淀粉厂土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较α -淀粉酶活性大小而得到。
3.应用权利要求1所述α-淀粉酶高产菌株生产α-淀粉酶的方法，其特征是采用嗜热脂肪芽孢杆菌WSH13-17 (G.stearothermophilus) WSH13-17为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得α-淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述种子培养中采用的种子培养基成分为(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7.0 ;培养条件为:培养时间为20-24小时，温度55°C。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述液体深层发酵中，发酵培养基成分为(g/L): 可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，发酵条件为:pH7.0，55°C，摇瓶转速200转/分，发酵时间48小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素液成分为(g/L):
ZnCl22, FeS042, H3BO30.065, MoNa2O40.135。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于所述α-淀粉酶在味精、啤酒、酒精生产加工领域中的应用。
【文档编号】C12N9/28GK103667095SQ201310076922
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2013年3月12日
【发明者】吴敬, 李祝, 吴丹, 陈晟, 陈坚 申请人:江南大学