专利名称：米曲霉菌株及其在发酵生产低聚果糖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及低聚果糖制备技术领域，特别涉及一种米曲霉菌株，还涉及所述米曲霉菌株在发酵生产低聚果糖中的应用。
背景技术：
低聚果糖是指2 8个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基一果糖连接键为主体骨架连结形成的功能性低聚糖。低聚果糖是一种能激活人体益生菌群增殖，促进人体微生态平衡的益生元，被公认具有调节胃肠道功能、降低血酯、调节机体平衡、提高免疫力等健康作用，也是一种典型的水溶性的膳食纤维，已被广泛用作功能性配料或者直接服用。目前，国内外工业化生产的方法主要是通过选出高活性菌种后破碎菌体、菌体和酶分离制备液体酶制剂或固定化酶制剂，进行低聚果糖的生产，工艺路线较长，设备多，而且通常制备的低聚果糖产品外观色泽差或呈褐色，产品应用范围受到限制。CN 101659924 B公开了一种土壤中筛选得到的黑曲霉经过诱变后得到的黑曲霉菌种，其在厌氧发酵制备低聚果糖中有很好的应用效果。
发明内容
为了解决以上低聚果糖生产中工艺路线较长，设备多，制备的低聚果糖产品外观色泽差或呈褐色，产品应用范围受到限制的问题，本发明提供了一种可以缩短低聚果糖生产工艺路线、减少设备投入、降低成本的米曲霉菌株。本发明还提供了所述米曲霉菌株在发酵生产低聚果糖中的应用。本发明是通过以下措施实现的:
一种米曲霉菌株，所述米曲霉菌株oryzae)BLB_27已于2013年03月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.7311。从土壤中分离得米曲霉菌株，操作方法如下:
称取IOg 土壤，加入90mL无菌水中，震荡摇匀，酒精擦拭后移入超净工作台。准备6支装有9mL无菌水的试管,编号I一6。用移液枪移取1000 μ L悬池液置于I号试管,再移取IOOOuL I号试管悬浊液置于2号试管，依次做六个试管梯度稀释。用移液枪分别取4、5、6号试管溶液各200 μ L (每个试管取2— 4份)置于合适的培养基平板，用涂抹棒均匀涂抹，培养至平板长出成熟菌落，分离纯化米曲霉菌落，将单菌落接种斜面，并接种摇瓶，初筛测定产低聚果糖的转化率。根据摇瓶培养酶活力大小选出优良斜面出发菌株一米曲霉。分离培养基中含有蔗糖3 %，土豆汁3 %，硫酸镁0.3%，硝酸钠0.3%，磷酸氢二钾
0.1%，琼脂粉1.5%，pH为6.0 — 6.5，121 °C湿热灭菌20分钟。种子扩大培养基中含有蔗糖5 %，麸皮3 %，酵母膏2 %，硫酸镁0.3%，磷酸氢二钾
0.1%，pH为6.0 — 6.5，121 °C湿热灭菌20分钟，培养温度28 — 30°C。将筛选得到的米曲霉菌株进行产低 聚果糖的含量测定，筛选确定得到优良的米曲霉菌株，编号为BLB-27,用于混合厌氧发酵生产低聚果糖。
低聚果糖产率测定方法:以40%蔗糖溶液为底物，加入适量制备的混合厌氧发酵菌体溶液，在40°C，糖化反应6 — 36小时，取出于85°C水浴IOmin将菌体灭活，微滤膜去除菌体，取上层清液，用HPLC法测定低聚果糖含量。具体筛选过程如下:
(O实验方法
1)细胞菌悬液的制备
称取IOg 土壤，加入90mL无菌水中，震荡摇匀，酒精擦拭后移入超净工作台。准备6支装有9mL无菌水的试管,编号I一6。用移液枪移取1000 μ L悬池液置于I号试管,再移取1000 μ L I号试管悬池液置于2号试管,依次做六个试管梯度稀释。2)平板制作
将分离培养基熔化后冷至45°C左右倒平板，凝固后待用。3)菌种筛选
用移液枪分别取4、5、6号试管溶液各200 μ L (每个试管取2— 4份)置于合适的培养基平板，用涂抹棒均匀涂抹，25 - 30°C培养2 — 5天，培养至平板长出成熟菌落。4)菌种斜面培养
挑取单菌落接种于斜面培养基，25 - 30°C培养2 — 5天。5)菌种扩大培养和发酵
在25ml/500mL摇瓶种子培养基中接种，30°C，200r/min培养24小时。6)混合厌氧发酵实验:
在厌氧条件下，将米曲霉按接种量1-50%移种于蔗糖溶液中，蔗糖溶液pH值4 7，反应温度30 60°C，厌氧转化6 36h，发酵完成后通过微滤膜去除菌体蛋白，然后进行脱色处理，精制、浓缩，得到低聚果糖液。
筛选菌株实验结果 表1筛选菌株实验结果
权利要求
1.一种米曲霉菌株，其特征是所述米曲霉菌株(J1SpergiJJw1S oryzae) BLB-27已于2013年03月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCN0.7311。
2.—种权利要求1所述的米曲霉菌株在发酵生产低聚果糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于在厌氧条件下，将米曲霉菌株转入转化罐内，加入蔗糖和水得到蔗糖溶液，调节pH值4 7，反应温度30 60°C，厌氧转化6 36h，经过去除菌体、脱色、精制、浓缩，得到低聚果糖液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将低聚果糖液经过干燥得到低聚果糖粉体。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将低聚果糖液经过色谱分离、浓缩得到高低聚果糖含量的低聚果糖液。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于米曲霉菌株为经过扩大培养的菌种溶液，蔗糖溶液质量浓度为10 60%，菌种溶液加入量为蔗糖溶液重量的1-50%。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于使用活性炭进行脱色，脱色温度60 90°C，脱色10 30分钟。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于得到的低聚果糖液透光率大于98%。
全文摘要
本发明涉及低聚果糖制备技术领域，特别涉及一种米曲霉菌株，米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)BLB-27已于2013年03月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.7311。所述的米曲霉菌株在发酵生产低聚果糖中的应用。采用本发明的米曲霉菌株混合厌氧发酵转化技术生产低聚果糖，可以节省掉菌体破碎机和离心机以及配套设施投资，节省占地空间，同时减少大量的能源消耗；得到的反应液中低聚果糖含量高，透光率高，反应液经过微滤膜除菌、脱色、精制、色谱分离、浓缩、干燥即可得到低聚果糖系列产品。
文档编号C12P19/04GK103205364SQ20131008316
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者刘宗利, 王乃强, 栾庆民, 杜倩, 熊小兰, 张莉 申请人:保龄宝生物股份有限公司