专利名称：一种利用地衣芽孢杆菌制取饲料添加剂的方法
技术领域：
本发明涉及饲用饲料添加剂领域，具体涉及利用地衣芽孢杆菌制备饲料添加剂的方法。
背景技术：
养殖户在养殖家禽家畜时为了达到预防疾病的目的，往往在饲料中添加大量抗生素，其结果是不可避免的造成抗生素滥用，在动物体内产生药物残留，最终通过食物链在人类身体中蓄积，严重威胁人类健康。研究表明地衣芽孢杆菌均是一类益生菌，用其制成的制剂添加到饲料中可起到如下作用:①芽孢杆菌为一种需氧有益菌，其在不利环境中能形成孢子，耐高温、耐酸碱和温度变化，进入肠道后能迅速复活；且能通过与致病菌争夺有限的营养物质，迅速消耗环境中有限氧气，有利于维持肠内菌群平衡起着重要作用，从而抑制肠道致病菌生长，达到预防治疗畜禽肠道疾病的作用芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收，从而促进消化和提高饲料利用率，降低饲养成本；③芽孢杆菌能促进动物肠道相关淋巴组织处于高度的“免疫准备状态”，同时使免疫器官发育加快，免疫系统成熟快而早，T、B淋巴细胞数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等，参与动物机体新陈代谢，为机体提供营养物质。由于芽孢杆菌制剂具有上述重要优良特征，因此吸引了众多国内外学者对其进行深入研究，研究内容主要集中于:芽孢杆菌的筛选(杨晓斌，谢拥葵，韦燕鹏等，益生菌纳豆芽孢杆菌的筛选，广州食品工业科技，2003年增刊)、制备纤溶酶(余功保，郭爱玲，秦巧玲等，一株高产纳豆激酶菌株的筛选及其发酵条件的优化，食品科学，2007年第4期)、液体深层发酵工艺(朱健辉，杜连祥，路福平，纳豆激酶液态发酵工艺优化，食品与发酵工业，2005年第8期)、粉剂制备工艺(钟青萍，王发祥，刘家畅，纳豆菌活菌干燥制剂的研制，食品工业科技，2005年第8期)等方面，而具体的固体发酵工艺未见报道。固体发酵法相比液体发酵最大的优点就是生产成本低、原材料简单、产品产酶活性高、产品的耐高温、耐酸碱、耐挤压等耐受能力强。但是固体发酵技术难度大，不容易生产出高质量的芽孢杆菌制剂。目前的芽孢杆菌制剂的生产工艺和发酵培养基配方所生产的制剂活菌含量不高，制剂有效期短，使得产品难以达到理想的疾病预防和生长促进效果。
发明内容
本发明的内容在于，针对现有技术不足，提供一种利用地衣芽孢杆菌制备饲料添加剂的固体发酵培养方法，该方法制得的饲料添加剂活菌含量高，杂菌率低，芽胞活性强，稳定性强,生产成本不高。本发明采用的技术方案是，一种利用地衣芽孢杆菌制取饲料添加剂的方法，其特征在于包括如下步骤:
(I)囷种制备与活化 把购得的地衣芽孢杆菌的菌种制成悬浮液，加入无菌水稀释到浓度为10_8时，在固体平板培养基上对其进行涂布分离或划线分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定；经反复筛选，确定出经发酵产生的芽孢活性强、活菌数高的菌株代替原来的菌株。(2)斜面菌种制作
按配方要求配置斜面培养基，斜面培养基的各组份重量份为:牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，琼脂粉20-25 g，加水定容至1000 mL ；pH控制在7.2-7.4 ；
将斜面培养基加热使各组分充分溶解，调好PH，然后分装于若干支试管中，密封试管；将试管于121°C灭菌30 min,取出摆斜面，冷却后备用；
将上述斜面培养基置于干燥箱或培养箱中放置24-48h接入步骤(I)中制备的菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为试管中混合物总重量的1%，在37°C条件下培养24h，制成斜面菌种。(3)三角瓶液体菌种制作
按配方要求配置液体培养基，液体培养基的各组份重量份为:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氢钾0.4 g、磷酸氢二钾0.5 g、鹿糖20 g,加水定容至IOOOmL ;pH控制在7.0-7.2 ;分装于若干个500mL的三角瓶中，每支三角瓶装量为220mL ;密封后在121°C温度下灭菌30min，冷却后备用；
在无菌条件下，每个三角瓶中的液体培养基接入步骤(2)制得的斜面菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为三角瓶中混合物总重量的10%，对三角瓶进行摇床培养，温度控制在37°C，转速为180-200 r/min ;摇床培养24h后制得三角瓶液体菌种，备用。(4)罐头瓶固体发酵
按配方要求配置固体发酵培养基，固体发酵培养基的各组份重量份为:红糖0.5%、石灰0.5 %，无菌水45%，其余为麸皮；
将固体发酵培养基混和均匀后分装入若干罐头瓶中，瓶口用报纸盖住，用线系紧；在121°C的温度下对上述罐头瓶灭菌60 min ;冷却后，接入步骤(3)制取的液体菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为混合物总重量的5% ;放入37°C的培养间中培养60 h，当芽孢形成率达到90%以上发酵结束，出料后制得成品。进一步，所述步骤(2 )中的密封是指在试管上盖上棉塞，将棉塞和试管口部分包上报纸，用线系紧。进一步，在步骤(I)中每支试管中斜面培养基的装量为试管总容量的1/3-1/2。进一步，在步骤(4)中还包括将制得的成品进一步在发酵瓷盘中发酵的步骤，发酵温度控制在37°C，培养时间为60 h。所述发酵瓷盘为普通的瓷盘，在发酵瓷盘进一步发酵，起到扩大培养的作用，可以提高产量。本发明的有益效果是:主要利用麸皮这种廉价的介质作为主要培养底物，有效降低了生产成本。国内许多学者对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行研究，但所用培养基为实验室常用的葡萄糖、酵母浸膏、尿素等，工业生产成本很高。采用固体发酵方法，固体发酵具有节水、节能的独特优势，生产成本低，耐高温、耐酸碱、耐挤压，饲料加工过程中受损小，添加量小、饲喂效果更明显，属于清洁生产技术，具有大规模操作的潜能。采用罐头瓶这种价格低廉的发酵容器，设备投资低。由于各个罐头瓶的发酵空间相互独立，便于进行底物特性检测，便于检验发酵效果，便于试验和控制发酵参数，便于运用单因素和多因素正交试验对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行优化，从而得到最佳温度和PH，便于分析接种量对发酵周期的影响；可以灵活的制定避免染菌的对策，便于对水活度、通风与传质、传热及PH等进行控制；各个发酵容器内的杂菌不容易相互影响。环境比较控制，摇晃均匀，温度均匀。在罐头瓶这个小环境下，菌种通过自然选择，产生的菌株活性高，便于扩大培养。发酵效果好。采用本工艺，地衣芽孢杆菌的固体发酵活菌数达到5.0XIOki cfu/g,有效地提高了地衣芽孢杆菌产量。保持活菌率>90%，保留大约85%生物活性成分。卫生指标符合微生物饲料添加剂地衣芽孢杆菌卫生指标。生产成本低。利用固体发酵方法，以麸皮作为培养底物生产的地衣芽孢杆菌具有生产成本增加较少，单位饲料添加量明显减少的特点，以每吨全价饲料添加100 g地衣芽孢杆菌计算，每吨饲料节约5元成本。在应用方面,提高了动物的生产性能,减少疾病的发生，可以替代部分抗生素的用量，在水质改良方面，有效分解水中有机质，降低水中氨氮的含量，为水产动物提供良好的生长环境，为畜牧业的发展提供有利保障。本发明采用了独特的固体发酵培养基和固态发酵技术，加快了菌种繁殖速度，缩短了发酵周期，降低了生产成本，提高了产品的芽胞形成率。
具体实施例方式下面通过实施例作进一步描述。实施例1。利用地衣芽孢杆菌制备饲料添加剂，包括如下步骤:
(I)囷种制备与活化
把购得的地衣芽孢杆菌的菌种制成悬浮液，加入无菌水稀释到浓度为10_8时，在固体平板培养基上对其进行涂布分离或划线分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定；经反复筛选，确定出经发酵产生的芽孢活性强、活菌数高的菌株代替原来的菌株。地衣芽孢杆菌菌种从中国农业微生物菌种保藏管理中心购得。(2)斜面菌种制作
按配方要求配置斜面培养基，斜面培养基的各组份重量份为:牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，琼脂粉20 g，加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ；
将斜面培养基加热使各组分充分溶解，加热温度控制在50-60°C，调好pH，然后分装于若干支试管中，每支试管中斜面培养基的装量为试管总容量的1/3 ;在试管上盖上棉塞，将棉塞和试管口部分包上报纸，用线系紧；将试管于121°C灭菌30 min，取出摆斜面，冷却后备用;
将上述斜面培养基置于干燥箱或培养箱中放置24 h接入步骤(I)中制备的菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为试管中混合物总重量的1% ;在37°C条件下培养24 h，制成斜面菌种。(3)三角瓶液体菌种制作
按配方要求配置液体培养基，液体培养基的各组份重量份为:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氢钾0.4 g、磷酸氢二钾0.5 g、鹿糖20 g、加水定至1000mL ；pH控制在7.0 ;分装于若干个500mL的三角瓶中，每支三角瓶装量为220 mL ;密封后在121 °C温度下灭菌30 min，冷却后备用；
在无菌条件下，每个三角瓶中的液体培养基接入步骤(2)制得的斜面菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为三角瓶中混合物总重量的10% ;对三角瓶进行摇床培养，温度控制在37°C，转速为180-200 r/min;摇床培养24 h后制得三角瓶液体菌种，备用。(4)罐头瓶固体发酵
按配方要求配置固体发酵培养基，固体发酵培养基的各组份重量份为:红糖0.5%、石灰0.5 %，无菌水45%，其余为麸皮；
将固体发酵培养基混和均匀后分装入若干罐头瓶中，瓶口用报纸盖住，用线系紧；在121 °C的温度下对上述罐头瓶灭菌60 min ；
冷却后，接入步骤(3)制取的液体菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为总重量的5% ;放入37°C的培养间中培养60 h，当芽孢形成率达到90%以上发酵结束，出料后制得成品。实施例2。利用地衣芽孢杆菌制备饲料添加剂，包括如下步骤:
(I)囷种制备与活化
把购得的地衣芽孢杆菌的菌种制成悬浮液，加入无菌水稀释到浓度为10_8时，在固体平板培养基上对其进行划线分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定；经反复筛选，确定出经发酵产生的芽孢活性强、活菌数高的菌株代替原来的菌株。(2)斜面菌种制作
按配方要求配置斜面培养基，斜面培养基的各组份重量份为:牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，琼脂粉20 g，加水定容至止1000 mL ；pH控制在7.4 ；
将斜面培养基加热使各组分充分溶解，调好PH值，然后分装于若干支试管中，每支试管中斜面培养基的装量为试管总容量的1/2 ;在试管上盖上棉塞，将棉塞和试管口部分包上报纸，用线系紧；将试管于121°C灭菌30 min,取出摆斜面，冷却后备用；
将上述斜面培养基置于干燥箱或培养箱中放置48h接入步骤(I)中筛选的活力高的的菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为试管中混合物总重量的1% ;在37°C条件下培养24 h，制成斜面菌种。(3)三角瓶液体菌种制作
按配方要求配置液体培养基，液体培养基的各组份重量份为:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氢钾0.4 g、磷酸氢二钾0.5 g、鹿糖20 g、加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ;分装于若干个500 mL的三角瓶中，每支三角瓶装量为220 ml ;密封后在121°C温度下灭菌30 min，冷却后备用；
在无菌条件下，每个三角瓶中的液体培养基接入步骤(2)制得的斜面菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为三角瓶中混合物总重量的10% ;对三角瓶进行摇床培养，温度控制在37°C，转速为180-200 r/min;摇床培养24 h后制得三角瓶液体菌种，备用。(4)罐头瓶固体发酵
按配方要求配置固体发酵培养基，固体发酵培养基的各组份重量份为:红糖0.5%、石灰0.5 %，无菌水45%，其余为麸皮；
将固体发酵培养基混和均匀后分装入若干罐头瓶中，瓶口用报纸盖住，用线系紧；在121 °C的温度下对上述罐头瓶灭菌60 min ；
冷却后，接入步骤(3)制取的液体菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为总重量的5% ;放入37°C的培养间中培养60 h，当芽孢形成率达到90%以上发酵结束，出料后制得成品。经过上述步骤生产饲料添加剂活菌含量高，经检测活菌总数大于5.0X 101° cfu/g，也能保持活菌率>90%，保留大约85%生物活性成分。该复合饲料添加剂具有耐高温、耐酸碱、耐胆汁的特点，并具有较好的贮存稳定性。实施例3。利用地衣芽孢杆菌制备饲料添加剂，包括如下步骤:
(I)囷种制备与活化
把购得的地衣芽孢杆菌的菌种制成悬浮液，加入无菌水稀释到浓度为10_8时，在固体平板培养基上对其进行涂布分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定；经反复筛选，确定出经发酵产生的芽孢活性强、活菌数高的菌株代替原来的菌株。所述芽孢活性强、活菌数高的菌株是指经过试产，对其产量进行比较，选出的菌株。(2)斜面菌种制作
按配方要求配置斜面培养基，斜面培养基的各组份重量份为:牛肉膏5 g，蛋白胨10
g,NaCl 5 g，琼脂粉20 g，加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ;
将斜面培养基加热使各组分充分溶解，调好PH值，然后分装于若干支试管中，每支试管中斜面培养基的装量为试管总容量的1/3 ;在试管上盖上棉塞，将棉塞和试管口部分包上报纸，用线系紧；将试管于121°C灭菌30 min,取出摆斜面，冷却后备用；
将上述斜面培养基置于干燥箱或培养箱中放置48h接入步骤(I)中制备的菌种，每个试管中地衣芽孢杆菌接种量为试管中混合物总重量的1% ;在37°C条件下培养24 h，制成斜面菌种。(3)三角瓶液体菌种制作
按配方要求配置液体培养基，液体培养基的各组份重量份为:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氢钾0.4 g、磷酸氢二钾0.5 g、鹿糖20 g、加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ;分装于若干个500mL的三角瓶中，每支三角瓶装量为220 ml ;密封后在121°C温度下灭菌30 min，冷却后备用；
在无菌条件下，每个三角瓶中的液体培养基接入步骤(2)制得的斜面菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为三角瓶中混合物总重量的10% ;对三角瓶进行摇床培养，温度控制在37°C，转速为180-200 r/min;摇床培养24 h后制得三角瓶液体菌种，备用。(4)罐头瓶固体发酵
按配方要求配置固体发酵培养基，固体发酵培养基的各组份重量份为:红糖0.5%、石灰0.5 %，无菌水45%，其余为麸皮；
将固体发酵培养基混和均匀后分装入若干罐头瓶中，瓶口用报纸盖住，用线系紧；在121 °C的温度下对上述罐头瓶灭菌60 min ；
冷却后，接入步骤(3)制取的液体菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为总重量的5% ;放入37°C的培养间中培养60 h，当芽孢形成率达到90%以上发酵结束，出料制得成品；
将步骤4制得的成品进一步在发酵瓷盘中发酵，发酵温度控制在37°C，培养时间为60
h。经过进一步发酵，提高成品产量。由于罐头瓶的容量有限，在发酵瓷盘中进一步发酵，起到了扩大培养的作用。在发酵瓷盘中发酵，便于搅动物料，使其发酵均匀。经过上述步骤生产饲料添加剂活菌含量高，经农业部饲料质量监督检验测试中心检测活菌总数大于5.0 X 101° cfu/g,保持活菌率>90%，保留大约85%生物活性成分。该复合饲料添加剂具有耐高温、耐酸碱、耐胆汁的特点，并具有较好的贮存稳定性。实验例I。根据在山东金铭实业有限公司实验，选差两个月出栏长白猪共12头，分为对照组和试验组，每组各6头。对照组选用丰润大猪配合饲料305，不添加任何其他东西喂食。试验组同样选用丰润大猪配合饲料305，同时按1000g/t的比例添加本发明制得的饲料添加剂，试验期均为2个月。结果如下:
表I 0.1%本饲料添加剂对差两个月出栏长白猪体重增重情况
权利要求
1.一种利用地衣芽孢杆菌制取饲料添加剂的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)囷种制备与活化 把购得的地衣芽孢杆菌的菌种制成悬浮液，加入无菌水稀释到浓度为10_8时，在固体平板培养基上对其进行涂布分离或划线分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定；经反复筛选，确定出经发酵产生的芽孢活性强、活菌数高的菌株代替原来的菌株； (2)斜面菌种制作 按配方要求配置斜面培养基，斜面培养基的各组份重量份为:牛肉膏5 g，蛋白胨10g,NaCl 5 g，琼脂粉20-25 g，加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2-7.4 ; 将斜面培养基加热使各组分充分溶解，调好PH，然后分装于若干支试管中，密封试管；将试管于121°C灭菌30 min,取出摆斜面，冷却后备用； 将上述斜面培养基置于干燥箱或培养箱中放置24-48h接入步骤(I)中制备的菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为试管中混合物总重量的1%，在37°C条件下培养24h，制成斜面菌种； (3)三角瓶液体菌种制作 按配方要求配置液体培养基，液体培养基的各组份重量份为:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氢钾0.4 g、磷酸氢二钾0.5 g、鹿糖20 g,加水定容至IOOOmL ;pH控制在7.0-7.2 ;分装于若干个500mL的三角瓶中，每支三角瓶装量为220mL ;密封后在121°C温度下灭菌30min，冷却后备用； 在无菌条件下，每个三角瓶中的液体培养基接入步骤(2)制得的斜面菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为三角瓶中混合物总重量的10%，对三角瓶进行摇床培养，温度控制在37°C，转速为180-200 r/min ;摇床培养24h后制得三角瓶液体菌种，备用； (4)罐头瓶固体发酵 按配方要求配置固体发酵培养基，固体发酵培养基的各组份重量份为:红糖0.5%、石灰0.5 %，无菌水45%，其余为麸皮； 将固体发酵培养基混和均匀后分装入若干罐头瓶中，瓶口用报纸盖住，用线系紧；在121 °C的温度下对上述罐头瓶灭菌60 min； 冷却后，接入步骤(3)制取的液体菌种，其中地衣芽孢杆菌接种量为混合物总重量的5% ;放入37°C的培养间中培养60 h，当芽孢形成率达到90%以上发酵结束，出料后制得成品O
2.如权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌制取饲料添加剂的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的密封是指在试管上盖上棉塞，将棉塞和试管口部分包上报纸，用线系紧。
3.如权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌制取饲料添加剂的方法，其特征在于:在步骤(2)中每支试管中斜面培养基的装量为试管总容量的1/3-1/2。
4.如权利要求1到3任意一权利要求所述的一种利用地衣芽孢杆菌制取饲料添加剂的方法，其特征在于:步骤(4)中还包括将制得的成品进一步在发酵瓷盘中发酵的步骤，发酵温度控制在37 °C，培养时间为60 h。
全文摘要
本发明提供了一种利用地衣芽孢杆菌制备饲料添加剂的方法。该方法通过菌种制备与活化、斜面菌种制作、三角瓶液体菌种制作、罐头瓶固体发酵等步骤，得到饲料添加剂。本发明采用了独特的培养基和固态发酵技术，加快了菌种繁殖速度，缩短了发酵周期，降低了生产成本，提高了产品的芽胞形成率。主要利用麸皮这种廉价的介质作为主要培养底物，有效降低了生产成本。生产工艺具有节水、节能、副产物少、环保的独特优势，生产成本低，产品耐高温、耐酸碱、耐挤压，饲料加工过程中受损小，添加量小、饲喂效果更明显，属于清洁生产技术，具有大规模推广应用的价值。
文档编号C12N1/20GK103109981SQ201310083068
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者郝志刚, 罗明, 王奎明 申请人:高唐华农生物工程有限公司