专利名称：黄瓜乙烯信号转导途径ctr1基因及其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，特别涉及一种黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因及其编码的蛋白。
背景技术：
黄瓜(Cucumissativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(cucumis) —年蔓生的草本植物。特别是黄瓜花性型分化多样，常见的黄瓜品种是雌雄花独立着生的异花同株型(monoecious);不过某些品种也会出现两性花(hermaphrodite),在大量的生理学和遗传学的基础上，黄瓜已逐渐成为研究植物性型分化的模式材料。
乙烯作为一种植物激素对植物的正常发育和胁迫反应起着很重要的作用。在正常发育过程中，乙烯调控种子萌发种苗生长、叶片和花的脱落、果实成熟、器官衰老、花性别决定等生理过程。此外，当植物受到外界刺激包括伤害、病原侵入、干旱等，乙烯的生物合成增力口，促进防卫化合物的生成，表明乙烯在应对生物和非生物胁迫中起着重要作用。
在乙烯生物合成途径上，已做了大量的研究。而黄瓜乙烯信号转导途径研究较为缓慢，途径中一些重要的组分还未得到分离和鉴定。
CTRl基因是一个乙烯信号转导途径中的负调控基因，也是第一个被克隆的乙烯信号转导途径基因[Kieber JJ et al.CTRl, a negative regulator of the ethyleneresponse pathway in Arabidopsis， encodes a member of the Raf family of proteinkinases.Cell，1993，72 (3):427-441.]。遗传和生化研究发现，无跨膜功能域或膜附着结构的CTRl的氨基端可与内质网上的乙烯受体羧基端相互作用，从而间接结合到内质网上形成 ETR1/CTR1 复合体进而负调控乙烯反应[Gao Z et al.Localization of the Raf-1ikekinase CTRlto the endoplasmic reticulum of Arabidopsis through participationin ethylene receptor signaling complexes.The Journal of Biological Chemistry,2003,278:34725-34732.]目前，CTR l基因作为乙烯信号转导途径中的关键组分，已从拟南芥、西葫芦、甜瓜、番茄、小麦、飞燕草、月季、猕猴桃等物种中分离。因此，分离和鉴定黄瓜CTRl基因为研究CTRl的转录和表达提供了可能，同时也为功能性研究CTRl在乙烯调控黄瓜生长发育过程中的作用奠定了基础。发明内容
本发明的目的，是为了进一步研究黄瓜乙烯信号转导途径相关基因的功能及应用，以及乙烯信号转导途径基因与黄瓜性型之间的相关性，提供一种黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因及其编码的蛋白。
本发明所采取的技术方案如下:
一种黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，命名为CsCTRl，其DNA序列如SEQID N0.1所示。
黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因编码的蛋白，其氨基酸残基序列如SEQID N0.2所示。
上述黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，其中，所述CsCTRl含有一个2559bp的开放阅读框，该开放阅读框为第I位至第2559位核苷酸。
上述黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，其中，所述的开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。
上述黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因编码的蛋白，其中，将SEQID N0.2所示的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失或添加，得到具有与所述蛋白相同活性的衍生蛋白。
上述黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，其中，该基因的全长由以下引物对扩增得到:
一条引物的核苷酸序列如SEQID N0.3所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。
含有上述基 因的重组载体，是将所述基因插入表达载体pBI121CaMV35S启动子和终止子nos之间获得。
含有上述基因的拟南芥转化纯株系。
上述黄瓜乙烯信号转导途径基因CsCTRl及其编码蛋白的获得，是利用拟南芥CTRl基因的氨基酸序列(GenBank accession N0.NP_850760)为信息探针，通过黄瓜基因组网站(http://cucumber, genomics, org.cn)中的BlastP程序,获得与信息探针一致性为67%的csa011978，其位于6号染色体。利用csa011978序列设计扩增ORF序列的引物，从黄瓜S52品系的成熟叶片提取总RNA，经过反转录，用常规PCR法扩增CsCTRl的0RF，测序得出CsCTRl基因的0RF2559bp，推导编码852个氨基酸，起始密码子位ATG，终止密码子为TGA0蛋白预测大小为94.521KDa，等电点为5.77。通过黄瓜基因组网站(http://cucumber.genomics, org.cn)中的BlastP程序发现，CsCTRl在黄瓜基因组中为单拷贝。黄瓜基因组序列表明该基因包含15个外显子、14个内含子。
用Genscan(http://genes, mit.edu/GENSCAN.html)对 CsCTRl 的 ORF 进行分析，通过BLASTP (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)获得其他物种的相似序列，进行序列比对及系统进化树分析显示CsCTRl与其他植物CTRl基因高度同源，在进化过程中起源于同一祖先，且与南瓜、甜瓜聚类在一簇。蛋白质同源建模结果表明CTRl含有与拟南芥CTRl蛋白激酶结构域高度相似的结构。
本发明公开了黄瓜乙烯信号转导途径当中的CTRl基因序列，不仅为研究黄瓜乙烯信号转导途径中CTRl的转录和表达奠定基础，同时也为研究乙烯信号转导途径基因与黄瓜性型之间的相关性提供基础。此外，也为进一步研究黄瓜CTRl在除花性型分化以外的其他相关生长发育过程中的作用提供条件。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1黄瓜CTRl开放阅读框(ORF)的获得
1.RNA 的提取(RNAisolation)
黄瓜S52为我们收集的华南品种，雌雄异花同株，取其成熟叶片在液氮中研碎，力口A 1.5ml EP管中，用TRIpure Reagent试剂按照说明书提取总RNA(Aidlab, China),之后取Iul RNA利用分光光度计测定其含量。
2.反转录 PCR(RT-PCR)
以黄瓜总RNA为模板，采用ReverTra Ace qPCR RT Kit扩增试剂盒(Τ0Υ0Β0，China)进行反转录cDNA第一链，反转录步骤参照该试剂盒的用户手册。
3.开放阅读框的获得
利用拟南芥CTRl基因的氨基酸序列(GenBank accession N0.NP_850760)为信息探针，通过黄瓜基因组网站(http://cucumber, genomics, org.cn)中的BlastP程序,获得与信息探针一致性为67%的csaOl 1978，其位于6号染色体。利用csa011978序列设计扩增ORF序列的引物(见序列表序列3和4)。
PCR 反应体系:40ng cDNA，0.5 μ M 正反向引物，25 μ 12 XPrimeSTAR Max (TaKaRa,China)，反应体系50 μ I。反应条件:95°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸30s，进行30个循环；最后72°C延伸20min (加Taq酶0.5ul，dNTP3ul)。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收。回收操作按照生工生物有限公司的琼脂凝胶回收试剂盒说明书。
实施例2CsCTRl基因相关蛋白在拟南芥突变株CTRl中进行真核表达及转基因植株的鉴定
1、含目的基因表达载体的构建
利用限制性内切酶XmaI和SacI同时双酶切CsCTRlDNA回收片段和植物双元表达载体pBI121 JfCsCTRl插入表达载体pBI121CaMV35S启动子和终止子nos之间。酶切反应体系如表I所示:
表I
权利要求
1.一种黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，命名为CsCTRl，其DNA序列如SEQID N0.1所示。
2.权利要求1所述的黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因编码的蛋白，其氨基酸残基序列如 SEQID N0.2 所示。
3.根据权利要求1所述的黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，其特征是，所述CsCTRl含有一个2559bp的开放阅读框，该开放阅读框为第I位至第2559位核苷酸。
4.根据权利要求3所述的黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，其特征是，所述的开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。
5.根据权利要求2所述的黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因编码的蛋白，其特征是，将SEQID N0.2所示的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失或添加，得到具有与所述蛋白相同活性的衍生蛋白。
6.根据权利要求1所述的黄瓜乙烯信号转导途径CTRl基因，其特征是，该基因的全长由以下引物对扩增得到: 一条引物的核苷酸序列如SEQID N0.3所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQID N0.4所示。
7.含有权利要求1所述基因的重组载体，其特征在于:将所述基因插入表达载体pBI121CaMV35S启动子和终止子nos之间获得。
8.含有权利要求1所述基 因的拟南芥转化纯株系。
全文摘要
本发明提供了一种黄瓜乙烯信号转导途径CTR1基因，命名为CsCTR1，其DNA序列如SEQID NO.1所示。其编码的蛋白的氨基酸残基序列如SEQID NO.2所示。CsCTR1开放阅读框2559bp，编码852个氨基酸。将其插入表达载体，得到一个过量表达载体。用该表达载体转化拟南芥CTR1突变株进行功能互补，得到CsCTR1转基因纯株系。本发明不仅为研究黄瓜乙烯信号转导途径CTR1的转录和表达奠定了基础，同时也为功能性研究CTR1在乙烯调控黄瓜生长发育过程中的作用提供了基础。
文档编号C12N15/84GK103173463SQ20131008692
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者别蓓蓓, 蔡润, 潘俊松, 何欢乐 申请人:上海交通大学