专利名称：一种检测n-酰基高丝氨酸内酯的双标记微生物细胞传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种响应环境中N-酰基高丝氨酸内酯的双标记微生物细胞传感器的构建及使用。
背景技术：
近年来，人们发现许多细菌在细胞密度达到一定的阈值时可通过对化学信号分子的产生，释放，感知和反应来调控相关基因的表达从而改变细菌的行为使其适应环境变化，这一现象被称为“群体感应”(QS:quorum sensing)。群体感应调控许多细菌行为包括:细菌运动、抗生素产生、毒力的产生、细菌结合、孢子的生成、生物膜的生成和环境适应性等。群体感应这些作用的发生依赖于信号分子。目前有三类公认的信号分子:革兰氏阳性菌的主要信号分子小肽；革兰氏阴性菌的主要信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHL);革兰氏阳性菌和阴性菌间都有的autoinducer-2 (A1-2)。因N-酰基高丝氨酸内酯参与调控的细菌行为的广泛性和结构特性，对其的检测是研究AHL介导的QS行为的基础。检测AHL有两种方法:一种是物理化学方法，如高效液相色谱法(HPLC)，薄层层析法(TLC)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在不足，如需要对样品进行分离提纯，对样品量造成损失并且不能进行环境原位检测；另一种方法是基于生物有机体和荧光蛋白的生物传感 器，其优势是不需对样品进行提纯可直接进行原位检测。微生物细胞具有易操作，繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高的特点，以微生物细胞为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。AHL微生物细胞传感器已成为检测AHL的重要工具。目前检测AHL的传感器主要有两种:一种是AHL启动子基因和同源调控蛋白基因以及报告基因组成的重组质粒。当环境中有AHL时，AHL与重组质粒编码的转录调控蛋白结合形成复合物，这一复合物再与启动子相互作用启动报告基因表达，产生可检测的信号，但其缺点是不能表征菌的生长情况，因为菌的生长情况可能影响到包括报告基因蛋白在内的蛋白表达情况，从而影响AHL检测；另一种是AHL启动子、报告基因和组成型表达荧光蛋白基因组成的重组质粒。此种质粒无AHL调控蛋白，只能转化到菌体本身含有AHL调控系统的菌中才能发挥作用，不能对不含AHL调控系统的菌做出表征。
发明内容
本发明的目的在于针对现有AHL传感器有的不能表征菌的生长情况，有的不能表征不含AHL系统的菌的问题，利用三部分元件:一是以丁香假单胞菌丁香致病变菌B728aAHL合成酶启动子ahll为启动子，樱桃红色荧光蛋白基因mcherry为报告基因，构建出的响应AHL的检测元件Pahll:mcherry, 二是以新霉素磷酸转移酶启动子nptll作启动子,绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因，构建出表征宿主生长情况的组成型表达绿色荧光蛋白元件PnptI1:gfp，三是利用丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a的AHL调控蛋白基因ahlR元件，可检测AHL对不含AHL系统的菌的影响情况，构建出既能检测AHL又能表征菌的生长情况的双色荧光标记的微生物细胞传感器。构建该细胞传感器的具体操作步骤为:1.组成型表达绿色突光蛋白元件Pnptll: gfp的构建以质粒载体pBQ9为模板，PCR扩增得到绿色荧光蛋白基因gfp片段，PCR产物和PUC19质粒载体分别用SphI和PstI双酶切并纯化酶切产物，将gfp片段连入酶切后的PUC19形成载体VI’。以质粒载体pTS为模板，PCR扩增得到新霉素磷酸转移酶启动子片段Pnptno PCR产物和载体VI’分别用SalI和PstI双酶切并纯化酶切产物，将Pnptn连入VI’形成载体VI。2.响应 AHL 元件 Pahll: mcherry 的构建以质粒载体pBQ9为模板，PCR扩增得到丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a AHL合成酶启动子ahll和绿色荧光蛋白基 因gfp片段ahl1-gfp，PCR产物和pUC19质粒载体分别用XbaI和XmaI双酶切并纯化酶切产物，将ahll-gfp连入酶切后的pUC19质粒形成载体V2’。以pAN583为模板，PCR扩增得到AHL报告基因樱桃红色荧光蛋白基因片段mcherry。基因片段mcherry和载体V2’分别用NdeI和HpaI双酶切并纯化酶切产物，将mcherry连入酶切后的载体V2’。片段Pahll: mcherry和质粒载体pUC19分别用XbaI和XmaI双酶切并纯化酶切产物，将Pahll: mcherry连入酶切后的pUC19形成载体V2。3.载体V2中的基因片段Pahll: mcherry连入载体Vl中Pnptn: gfp片段上游分别用XbaI和XmaI双酶切载体Vl和V2，将酶切后载体V2的小片段Pahll:mcherry连入酶切后的载体Vl的Pnptll: gfp上游，形成载体V3。4.将AHL调控蛋白基因片段ahlR连入载体V3形成载体V4丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a AHL调控蛋白基因片段通过PCR的方法获得。丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a在KB液体培养基中(Rif (DMS0溶):200 mg.^),28°C, 200 r.rniiT1条件下培养约48小时，收集菌体，提取基因组。以丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a基因组为模版，PCR扩增ahlR基因。PCR产物和载体V3分别用SalI和XalI双酶切并纯化酶切产物，将前者连入后者形成载体V4。5.载体V4基因片段Pahll: mcherry两端加入串联终止子形成目标质粒载体V5以质粒载体P丽1009为模板，PCR扩增终止子基因的4个串联片段1\_4，PCR产物和载体V4分别用XbaI酶切，将前者连入后者形成载体V5’。IV4 PCR产物和载体V5’分别用XmaI酶切，将前者连入后者形成载体V5。6.目标质粒载体V5的表达能力验证将目标质粒载体转化不产AHL的大肠杆菌细胞，加入100 nmol/L溶解于乙腈的30C6-HSL溶液，采用Varioskan Flash全波长扫描多功能酶标仪检测其绿色荧光在488 nm和樱桃红色荧光在543 nm处的发射光谱以验证传感器细胞对报告基因的表达能力。7目标传感器细胞的搭建完成利用商业化宿主感受态细胞DH5 α为宿主，将目标质粒载体V5进行转化，得到既可组成型表达绿色荧光蛋白又能在AHL诱导下表达樱桃红色荧光蛋白的响应AHL的双标记微生物传感器细胞。
具体实施例方式以下实施例将对本发明作进一步的说明第一步:接种传感器细胞单菌落于20 mL三角瓶中，添加氨苄青霉素至终浓度为50 μ g/mL,37°C,200 r.mirT1 过夜培养；第二步:取2 mL的上述菌液到18 mL的新鲜LB培养基中，添加氨苄青霉素至终浓度为 50 μ g/mL，37°C，200 r.mirT1 培养至 OD6tltl=0.6 ；第三步:将溶解于乙腈的30C6-HSL溶液加入第二步培养物中，使其终浓度分别为
0、10、50、100、1000 nmol/L, 37°C, 200 r.mirT1 继续诱导培养；第四步:24小时的诱导时间内每隔3小时取第三步的培养物180μ L至96孔板，采用Varioskan Flash全波长扫描多功能酶标仪分别检测其绿色突光在488 nm激发光下在510 nm处的发射光强和楼桃红色突光在543 nm激发光下在610 nm处的发射光强。第五步:根据30C6-HSL溶液诱导下传感器细胞的荧光发光情况可判断传感器在6小时内可检测外源AHL浓度为彡50 nmol/L，并能不受AHL影响组成型的表达绿色荧光以此来表征宿主菌。附录新霉素磷酸转移酶启动子nptll序列:GTCAGGCTGTAACAGCTCAGAGAAAGCTTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGAT绿色突光蛋白基因gfp序列: ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTGACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAG大肠杆菌IV4终止子序列:GGCCGCAATTCCCAATTCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGAATTAATTCCCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGAATTAATTCCCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGC
AGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGAATTAATTCCCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGG
CCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTT
GCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGAATTGGGGATCGGAAGCTTGCAT丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a的AHL合成酶启动子ahll序列:CTCTGATCCTGGTGCGTGTGGGCATCGGCCAGATTGAAGCGGGTCTTGAGGGCAGAAATTTCGTGTTGGGTAATATCGTCCAGAACAGGAACTGCGTTCAAGGTGTCGATACCGGCATACAGACTATTCATACCATTATCCCTGTGGCGTCATTATTGTTTGGGAAGCCGCCGTCCTGGATATCCAGAACGCCGGAGCAGATTTCCTTATTTTCGGCGCCAATAACACTGTACCTAAGTGCAAACAGCAGGGCGTTAGTGTTTCAGCGTGTTGACCTGTTCTTAAGTACAGTAGATTTGCCTATTTAAATAAGTAATGCTTCACGCTGGTGACGCCGGGTGG GTTTTAGAATG楼桃红色突光蛋白基因mcherry序列ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAA CGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGG GCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAGATCTTAA丁香假单胞菌丁香致病变菌B728a的AHL调节蛋白基因ahlR序列:CCACGCAGCGCAAGCCCCGTGACCGCCTGAATCTTGTCCATGCAGGCCAACGCCGCGAACCGGGTCTGGGGTGCCAACGAATGACTGTTTGCGCTGTTCATCACTACTCCTTGCTGTCGGACAAGCATCCTTGCACCTTGATGGAACCAAGAATATGATTGCAATCGCAATAAAAATCACTGACACGCCTCATCGCAGCGCGATGGCCAGTCCCCGAACATGCGTGCGCTCGCAACTCGGCAGGTCGATGAGCGTATTATTTTCAACGGCTAAGCCCTTGTTCAAAGACAAAAGACACACGCAGTCCATGTTTTCATGTACTGCGGAAAATACAAATGAGGATAATGAAGACGGCCAGGCCGCAAACAAACAATAGACAAGGTATTACATGGAGGTTCGTACCGTGCACACCCAACTTGACTGCCCGCCCCTCAAGATCAACGCAGCCCCTGCTCCGCTGCGTCAATTGATTGAAGACTTCGAAAACGATCTGCATCGTATTGGCGATTTCACCTATGCCTACTTTTCCAGCCCAAAGACACGCACTGTCAAACCGGTCATCCTGTCCAACTATCCTGATTCCTGGCTGAAGTCGTATATTGCCTCCAACTATCACCTTATCGATCCCATCATCAAACATGCCTGGCATAGCATTACGCCATTTTTCTGGAGAGAGGCCCGGCATGCCATTCAGGGCGTCGAGACCGATGACTTCCTGAAGCGCTCGGCCAAATACCAGCTGTCCTCCGGGGCCACTTTCACCCTGCACGATGCAAGCGGGCTTTTTGCCGCTCTGAGTCTTTGCAATGCCAGGCAACAGACTGACTTCGATCAGCGAATCCGCGACAAGGCCGCTGATATCCAGATGAGCCTCATCCGCTTTCATGACCGTTTGACCAAGACACAGGCGCCCCACGAACTCTTCCCGCAGCCCACCCGATGCAAATTATCCAGCCGCGAAATAGGCGTGCTGAAATGGGTAGCCATGGGCAAGGCCTACAGCGAAATCGCCGAGATATTTTCCATTTCGGAACGCACCGTGAAATTTCACATGTCCAACGTTTCCAGCAAACTCGAAGTGCGCACTGCCAAACAGGCCGTGTACAAAGCCATTAATATGGGCATGGTCTGACTCAGGCT。
权利要求
1.一种微生物细胞传感器，由细菌作基本材料，通过基因工程手段构建，用来检测环境中N-酰基高丝氨酸内酯并表征宿主菌。
2.根据权利要求1所述的微生物细胞传感器，其特征在于:不产AHL的大肠杆菌为宿主菌。
3.根据权利要求1所述的微生物细胞传感器，其特征在于:高灵敏度的樱桃红色荧光蛋白基因为检测酰基高丝氨酸内酯的报告基因，绿色荧光蛋白基因为表征宿主菌的报告基因。·
全文摘要
本发明涉及一种检测N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的双标记微生物细胞传感器，适用于环境中AHL的检测和宿主细胞的表征。所述细胞传感器包括大肠杆菌，大肠杆菌作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒，重组质粒为含有响应AHL的ahlI启动子、樱桃红色荧光蛋白报告基因mcherry、AHL调节蛋白基因ahlR；表征宿主菌的新霉素磷酸转移酶启动子基因nptII、绿色荧光蛋白报告基因gfp以及四个终止子rrnb串联序列T1-4的pUC19质粒。本传感器可组成型的表达绿色荧光蛋白来表征宿主菌，对AHL的响应时间为6小时，对AHL的最低检测浓度为50 nmol/L，具有灵敏度高，响应速度快，成本低，操作简单的特点，可广泛运用于环境中AHL的检测和对宿主的表征。
文档编号C12Q1/02GK103215214SQ20131008635
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者庄国强, 邓雪梅, 马安周 申请人:中国科学院生态环境研究中心