一株临床分离的放线菌样菌种及其培养方法
【专利摘要】本发明公开一株临床分离的放线菌样菌种，是从一名男性肺炎患者的痰中分离到的，该菌株为IFM10348，在中国典型培养物保藏中心保藏的菌株保藏号：CCTCC?NO:M?2011245，于2011年7月10日保藏。培养方法是将分纯的放线菌样菌株IFM10348以分区划线法接种于培养基平板上，置于温箱中需氧培养；之后取培养物涂片，分别进行革兰染色和抗酸染色；再将菌株点种于凹玻片的培养基内，覆盖盖玻片，置湿盒内于温箱中需氧培养；待菌体生长后，取出盖玻片，经固定、脱水、干燥后在盖玻片上喷金；又将菌株接种于培养基平板上进行需氧培养。本发明菌株的培养方法从而为加深对临床病原放线菌的认识，为将来更好地预防和治疗相关疾病提供依据。
【专利说明】一株临床分离的放线菌样菌种及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物，具体而言，涉及放线菌样菌种。
【背景技术】
[0002]放线菌是原核生物的一个类群。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5~Iy m。放线菌因菌落呈放线状而的得名，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。经检索，涉及放线菌的中国专利申请件很多，如93112750.5 号《制备马杜拉放线菌属新菌株的方法》、200410026093.1号《放线菌素D的类似物》、 200510011057.2号《一种筛选抗烟草黑胫病放线菌的方法》、200710156833.7号《一株生防放线菌-淀粉酶产色链霉菌D》、200810123930.0号《产生抗肿瘤活性物质的极地海洋放线菌AFN1007》、201110007054.7号《一种防治油茶病害的生防放线菌菌株及其应用》、 201110261599.0号《一株海洋放线菌L131及其代谢物、代谢物的制法及应用》等，但迄今为止未见涉及从病人痰中临床分离出的放线菌相关的专利申请件。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株临床分离的放线菌样新型菌种，以便对其进行生物学与
基因鉴定。
[0004]本发明的又一目的是提供该菌株的培养方法。
[0005]发明人提供的菌株为一临床分离株，是2002年从日本的一名48岁男性肺炎患者的痰中分离到的。从该患者的痰中分离得到的这株放线菌，编号为IFM10211，经过一系列的鉴定，已于2006年确定IFM10211为戈登氏菌属的一个新种，并在IJSEM上发表文章，命名为Gordonia araiim。该患者经过长期使用左氧氟沙星治疗之后,发现患者表现对左氧氟沙星耐药，从该患者的痰中重新分离得到一株菌，经培养，在中国典型培养物保藏中心保藏的菌株保藏号:CCTCC N0:M2011245，于2011年7月10日保藏，保藏单位的地址为:中国湖北省武汉市武昌洛珈山武汉大学保藏中心。保藏的培养物命名为`Gort/oflia iterum IFM10348。
[0006]发明人提供的放线菌样菌种的培养方法是:将分离得到纯的放线菌样菌株 IFM10348以分区划线法接种于脑心浸液琼脂平板上，置于37°C温箱中需氧培养2~4d，观察IFM10348菌落的形成及特征；之后取培养物涂片，分别进行革兰染色和抗酸染色；再将 IFM10348点种于凹玻片凹窝的脑心浸液培养基内，覆盖盖玻片，置湿盒内，于37 °C温箱中需氧培养；待菌体长在盖玻片上后，取出盖玻片，经固定、脱水、干燥后在盖玻片上喷金，用扫描电镜观察、拍照；将IFM10348接种于脑心浸液琼脂平板上，分别置于5°C、15°C、20°C、 25 °C、40°C、45 V需氧培养，观察生长现象。
[0007]发明人通过碳源利用试验及API细菌数值鉴定对IFM10348进行生化反应鉴定。 采用气相色谱分析法对IFM10348进行脂肪酸分析，以了解其脂肪酸组成及含量；通过药物敏感性试验，观察IFM10348对不同药物的敏感性；通过研究IFM10348的形态、染色、培养特性、生化反应、脂肪酸组成，药物敏感性，对IFM10348进行生物学特性的鉴定；通过对IFM10348的16S rRNA、和Md I基因序列进行测定及分析，对其进行基因鉴定；将IFM10348的生化反应及脂肪酸分析结果与其亲缘关系最近菌种的模式菌株的实验结果进行比较，进一步探讨IFM10348的分类学地位。
[0008]结果是:菌株IFM10348在脑心浸液琼脂平板上经37°C需氧培养2d后，肉眼可见形成直径1.5~3_的淡黄色、边缘不整齐的粗糙菌落。革兰染色阳性，抗酸染色阴性。扫描电镜观察到菌体为杆状或短棒状，未发现鞭毛。IFM10348在脑心浸液琼脂平板上经5°C、45°C需氧培养8d均未见生长。经15°C、20°C需氧培养5-7d，25、40°C需氧培养2-3d，形成同37°C培养的菌落特征。IFM10348可利用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、蛋氨酸、3-甲基戊二酸、D-葡糖酸、α -酮戊二酸、3-甲基-己二酸、亚氨基二乙酰乙酸、4甲基伞形酮基-磷酸盐、对硝基苯基-a -D-葡糖苷、对硝基苯基-磷酸盐、胸腺嘧啶脱氧核苷、粘菌素、D-果糖作为碳源。可还原硝酸盐、发酵葡萄糖，可与吡嗪酰胺、焦谷氨酸-萘胺、2-萘基-磷酸盐、2-萘基-a D-吡喃型葡萄糖苷发生反应，触酶试验阳性。IFM10348主要含C16:(l和c18:1两种脂肪酸，此外还有c16:1、c18:0, c18:2、C1813脂肪酸。药物敏感性试验显示IFM10348对妥布霉素、卡那霉素、复方新诺明敏感，对左氧氟沙星、环丙沙星耐药。16S rRNA基因序列测定结果在Genebank上比对发现，分离菌株IFM10348属于放线菌戈登氏菌属。在系统发育树上可见分离菌IFM10348与该菌属的模式菌株hirsuta DSM 44140τ和Gmalaquae IMMIB WWCC-22T亲缘关系最近。经Genetyx软件分析，分离菌IFM10348与G.hirsuta DSM 44140τ 和 malaquae IMMIB WWCC-22T 的 16S rRNA 基因序列相似度最高，分别为96.982%和97.402%。IFM10348的生化反应及脂肪酸分析结果与G.hirsuta DSM441401和61 malaquae IMMIB WWCC-22T 均有明显差别。
[0009]根据国内外的相关研究以及本文的研究结果，发明人认为:
1.通过生物学特性及16S rRNA基因鉴定，临床分离的放线菌样菌株IFM10348属于戈登氏菌属的放线菌。
[0010]2.通过对分离菌株IFM10348的基因鉴定发现，IFM10348与戈登氏菌属各有效发表种的16S rRNA、和Md 2基因序列有一定的差异。其生物学特性与其亲缘关系最近菌种的模式菌株也不完全相同，根据其在16S rRNA系统进化发育树的位置分析，拟考虑为戈登氏菌属的一个新菌种类型。对于菌种的最终确定还需通过国际论文发表来落实。
[0011]3.戈登氏菌属中的大部分菌种属于人类的条件致病菌，而且多与肺部感染有关。该菌株从肺部感染患者分离，提示可能与呼吸道感染有关。
[0012]发明人提供的放线菌样菌种的培养方法培养结果是:菌株IFM10348在脑心浸液琼脂平板上经37°C需氧培养2d后，肉眼可见形成直径1.5~3mm的淡黄色、边缘不整齐的粗糙菌落；革兰染色阳性，抗酸染色阴性；扫描电镜观察到菌体为杆状或短棒状，未发现鞭毛；IFM10348在脑心浸液琼脂平板上经5°C、45°C需氧培养8d均未见生长。经15°C、20°C需氧培养5~7d，25、40°C需氧培养2~3d，形成同37°C培养的菌落特征。IFM10348可利用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、蛋氨酸、3-甲基戊二酸、D-葡糖酸、α -酮戊二酸、3_甲基-己二酸、亚氨基二乙酰乙酸、4甲基伞形酮基-磷酸盐、对硝基苯基-a -D-葡糖苷、对硝基苯基-磷酸盐、胸腺嘧啶脱氧核苷、粘菌素、D-果糖作为碳源，可还原硝酸盐、发酵葡萄糖，可与吡嗪酰胺、焦谷氨酸-P -萘胺、2-萘基-磷酸盐、2-萘基-a D-吡喃型葡萄糖苷发生反应，触酶试验阳性。IFM10348主要含C16:Q和C18:1两种脂肪酸，此外还有C16:1、C18:Q、C18:2、 〇18:3脂肪酸。药物敏感性试验显示IFM10348对妥布霉素、卡那霉素、复方新诺明敏感，对左氧氟沙星、环丙沙星耐药。16S rRNA基因序列测定结果在Genebank上比对发现，分离菌株 IFM10348属于放线菌戈登氏菌属。在系统发育树上可见分离菌IFM10348与该菌属的模式菌株hirsuta DSM 441401 和malaquae IMMIB WWCC-221'亲缘关系最近。经 Genetyx 软件分析，分离菌 IFM10348 与 hirsuta DSM 441401^6 malaquae IMMIB WWCC-22T 的 16S rRNA基因序列相似度最高，分别为96.982%和97.402%。IFM10348的生化反应及脂肪酸分析结果与 G hirsuta DSM 441401 和 G malaquae IMMIB WWCC-22T 均有明显差别。
[0013]通过培养的结果分析以及生物学特性及16S rRNA基因鉴定，临床分离的放线菌样菌株IFM10348属于戈登氏菌属的放线菌；通过对分离菌株IFM10348的基因鉴定发现， IFM10348与戈登氏菌属各有效发表种的16S rRNA、^F_r5和Md 2基因序列有一定的差异。 其生物学特性与其亲缘关系最近菌种的模式菌株也不完全相同；戈登氏菌属中的大部分菌种属于人类的条件致病菌，而且多与肺部感染有关。该菌株从肺部感染患者分离，提示可能与呼吸道感染有关。
[0014]本发明提供一株临床分离的放线菌样菌种IFM10348，对该菌株进行了生物学特性及16S rRNA基因等鉴定，为其研究提供了基础，了解其生理和化学分类学特征，本发明的培养方法从而为加深对临床病原放线菌的认识，为将来更好地预防和治疗相关疾病提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为脑心浸液琼脂平板上IFM 10348的菌落；图2为菌株IFM10348的革兰染色结果(放大1000倍)，图3为菌株IFM 10348的扫描电镜照片(放大5000倍)，图4为菌株 IFM 10348在16S rRNA系统发育进化树上的位置，从图4可知其与已知发现的戈登氏菌种之间存在着明显的差异，属于一株戈登氏新种。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。
[0017]实施例
按照以下方法培养IFM10348放线菌，并进行生物学特性:
`I菌种与试剂
(I)菌种临床分离株:IFM10348 ;模式菌株 'G.hirsuta DSM 441401、G.malaquae MMIB WWCC-22T，来自日本千叶大学真菌研究所；药敏试验质控菌株:金黄色葡萄球菌 ATCC25923,大肠埃希菌 ATCC25922。
[0018](2)染色液革兰染色液,抗酸染色液。
[0019](3)培养基脑心浸液琼脂(Difco? Brain Heart Infusion agar),日本和光纯药工业株式会社提供，批号8198572 ;水解酪蛋白琼脂(MH琼脂)，杭州微生物试剂有限公司提供，批号20100716-00。
[0020](4) 棒状杆菌鉴定试剂盒(API Coryne) 德国梅里埃公司提供，批号864773301。内有API Coryne试条、GP培养基、悬浮培养基、麦氏管、培养盒。
[0021](5)药敏纸片杭州微生物试剂有限公司提供。妥布霉素，批号110221;卡那霉素，批号110310 ;左氧氟沙星，110210 ;环丙沙星，110223 ;复方新诺明，110126。
[0022](6)聚合酶链反应(PCR)试剂DNA提取试剂盒，日本NIPPON GENE公司提供的ISOPLANT II kit试剂盒。PCR反应体系,英国GE Healthcare公司提供的Ready - To-GoPCR beads。PCR反应引物，由美国英杰生命技术公司合成。
[0023](7) DNA Marker北京天根生化科技有限公司提供。
[0024]2培养与鉴定方法
(I)IFM10348的形态与培养特性
形态及染色性:将已分纯的IFM10348以分区划线法接种于脑心浸液琼脂平板上，置于37°C温箱中需氧培养2-4d，肉眼观察培养基上IFM10348的菌落形成及其菌落形态、大小、颜色、表面性状、边缘等特征。取培养物涂片后分别进行革兰染色和抗酸染色；
扫描电镜观察:用无菌吸管取融化的脑心浸液培养基，加I滴于无菌凹玻片的凹窝中。待其凝固后，以无菌操作法用接种针取IFM10348培养物，点种于凹窝的培养基中心，覆盖无菌盖玻片，置湿盒内，同法接种多份，于37°C温箱中需氧培养。每日取出一块盖玻片，肉眼观察培养物在盖玻片上的生长情况。将盖玻片上的培养物用接种环加入到生理盐水中，制作涂片后进行革兰染色，观察其形态。待菌体生长在盖玻片上后，将盖玻片及培养物送本院电镜室拍摄扫描电镜。经固定、脱水及干燥后，直接在盖玻片上喷金，用扫描电镜观察，拍照。
培养特性:将IFM10348接种于脑心浸液琼脂平板上，分别置于5°C、15°C、20°C、25°C、40°C、45°C温箱中需氧培养，肉眼观察培养基上IFM10348的菌落形成及特征至8d。
[0025](2) IFM10348的生化反应鉴定
碳源利用试验:根据已知方法配制基础培养基:0.1% NH4NO3,0.1% KH2PO4, 0.05%MgSO4.7H20, 0.02% KCl, ρΗ7.2。加入0.5%底物；底物滤过除菌；将在脑心浸液琼脂平板上37°C培养2d的IFM10348加入到无菌生理盐水中制成菌悬液，用麦氏管调整菌浓度为3个麦氏单位；用无菌吸管将菌悬液滴入准备好的基础培养基试管内，每管一滴；以不加底物的培养基作阴性对照；将所有试管置于37°C温箱中静置培养Iw后，将各试管内的液体摇匀，观察各试管内液体的浑浊度。可以利用相应碳源的试管内液体较对照管明显浑浊，即为阳性。
[0026]API细菌数值鉴定:根据棒状杆菌鉴定试剂盒说明书方法，将在脑心浸液琼脂平板上37°C培养2d的IFM10348加入悬浮培养基中制成菌悬液，用麦氏管调整菌浓度为6个麦氏单位；将配制好的菌悬液用移液器加入试条的前11个试验(NIT到GEL)管内；将余下的菌悬液倒入API GP培养基中，混匀；将新制的菌悬液加入试条后9个试验(O到GLYG)管内；在有下划线的试验的杯中(URE和(^IjGLYG)加入矿物油，形成新月状凸起；将试条置湿盒内，于36°C ±2°C培养24h;培养之后分别加试剂，等待IOmin后根据说明书上的结果判读表判读结果。
[0027](3)脂肪酸分析:将IFM10348接种于大量脑心浸液琼脂平板上，于37°C培养2~3d后，将培养好的菌苔用接种环刮取后装于离心管，加入5mL无菌蒸馏水，于3000r / min离心15 min，倒去上清液，菌体沉淀用蒸馏水洗涤3次，真空干燥。收集一个青瓶量的菌干粉送贵州师范大学分析测试中心采用气相色谱分析法进行脂肪酸分析。
[0028](4)药物敏感性试验；以金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株，根据抗微生物药物敏感性试验的执行标准CLSI M100-S20,对培养基及药敏纸片进行监测；将在脑心浸液琼脂平板上37°C培养2d的IFM10348加入到无菌生理盐水中，制成菌悬液，用麦氏管调整菌浓度为0.5个麦氏单位；用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液，涂布整个MH琼脂平板表面，反复3次，每次将平板旋转60°，保证涂布均匀； 将药敏纸片贴于平板上，置于37°C温箱中培养48h，取出测量抑菌圈；参考CLSI 执行标准判断IFM10348对不同药物的敏感性。
【权利要求】
1.一株临床分离的放线菌样菌种，其特征在于是2002年从日本的一名48岁男性肺炎患者的痰中分离到的，该菌株为IFM10348，在中国典型培养物保藏中心保藏的菌株保藏号:CCTCC N0:M2011245，于2011年7月10日保藏，保藏单位的地址为:中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
2.如权利要求1所述放线菌样菌种的培养方法，其特征是:将分离得到纯的放线菌样菌株IFM10348以分区划线法接种于脑心浸液琼脂平板上，置于37°C温箱中需氧培养2~4d，观察IFM10348菌落的形成及特征；之后取培养物涂片，分别进行革兰染色和抗酸染色；再将IFM10348点种于凹玻片凹窝的脑心浸液培养基内，覆盖盖玻片，置湿盒内，于37°C温箱中需氧培养；待菌体长在盖玻片上后，取出盖玻片，经固定、脱水、干燥后在盖玻片上喷金，用扫描电镜观察、拍照；又将IFM10348接种于脑心浸液琼脂平板上，分别置于5°C、15°C、20°C、25°C、4(TC、45°C需氧培养，观察生长现象；培养结果是:菌株IFM10348在脑心浸液琼脂平板上经37°C需氧培养2d后，肉眼可见形成直径1.5~3mm的淡黄色、边缘不整齐的粗糙菌落；革兰染色阳性，抗酸染色阴性；扫描电镜观察到菌体为杆状或短棒状，未发现鞭毛；IFM10348在脑 心浸液琼脂平板上经5°C、45°C需氧培养8d均未见生长。
【文档编号】C12R1/01GK103525716SQ201310087202
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】康颖倩 申请人:康颖倩