专利名称：放线菌启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及与编码存在于链霉菌(StreptomycesCarbophilus)中P-450细胞色素的基因相关的一种新形式的转录启动子，包含该启动子的载体，该载体在蛋白质尤其是P-450sca-2表达中的应用，包含该载体的宿主细胞，包含这种细胞的表达系统，以及这种蛋白质和表达系统的用途。本发明进一步涉及使用这种启动子进行有用蛋白质的工业化生产。发明背景近年来基因工程领域的进展已使在各种微生物中诱导并表达外来基因成为可能。发展的一个特别领域是关于大肠杆菌(E.Coli)作为宿主用于生产重组蛋白质，该技术已投入工业进行商业化应用。更近几年在酵母作为E.Coli工业替代物方面的研究已取得令人著目的进展。
放线菌属(特别是链霉菌属)是抗生素生产中常用的原核微生物。应用Hopwood等在八十年代开发的宿主一载体系统通常将异源DNA引入放线菌属中[参考Hopwood，D.A.，等，(1987)，“Methods in Enzymology”，153；116-166，Academic Press，New York]。这项技术使得相当多的研究和开发可以转到放线菌属的表达载体系统中。用于放线菌属表达载体中的转录启动子的例子是tipA，一种可被抗菌硫链丝菌肽诱导的启动子[参考Murakami，T.，等，(1989)，J.Bacteriol，171，1459]。
用于治疗高血脂的普伐他汀钠具有能降低血清胆固醇的有用的药学效果[参见Arai，等，(1988)，Ann.Rep.Sankyo Res.Lab.，40，1-38]。普伐他汀钠最初由ML-236B钠的微生物羟基化作用而生产，该ML-236B钠由线性真菌柑青霉产生。该羟基化作用一般在放线菌Streptomyces Carbophilus存在下进行。已证明引起羟基化作用活性的试剂是P-450sca类型的细胞色素(下文缩写成“P-450sca”)[参考Serizawa，等，(1990)，Biochemicaet Biophy SicaActa，1084，35-40]。
Matsuoka等从链霉菌(StreptomycesCarbophilus)中纯化了能催化ML-236B钠在6位的羟基化作用的P-450sca细胞素。该P-450 sca被表征为以三种形式存在，P-450sca-1，P-450sca.-2，和P-450sca-3[参见Matsuoka等，(1989)，Eur. J.Biochem，184，707-713和EP-A-0281245]，虽然还没有证实这些是否代表同种型，或不同基因的产物。
Serizawa等从链霉菌中克隆并表达了编码P-450sca-2的DNA[参见日本专利Kokai No.平6-70780和Watanabe，I等(1995)，Gene，163，81-85]。该DNA与P-450sca-2基因5’-非编码区的1KbP部分一起被克隆到多拷贝质粒PIJ702中，并用来转化变青链霉菌TK21(Streptomyces lividans TK21)。被转化的变青链霉菌TK21比链霉菌(S.carbophilus)更快地将ML-236B转变成普伐他汀钠，从而证明1Kbp片段具有强启动子活性。没有测定1Kbp5′-非编码区序列。
同时也证实P-450sca的表达受转录的底物诱导，即发现ML-236B和苯巴比妥将P-450的表达增强了30倍。这被RNA印迹所证明，RNA印迹发现在不存在ML-236B时无转录作用，但当ML-236B钠存在时发现三种转录物。底物存在时，转录水平经过六小时的时间增至最大速率。
编码P-450sca-2的DNA长度为1233bp，而启动子区非常接近该长度，长度为l013bp，这使转化作用比如果只有可读框(ORF)被用于转录时相对更困难。然而减小这样一个复合物的长度，底物诱导启动子则极可能使启动子变得无用。另外已成功地进行了用包含ORF和1kbp区的载体对宿主的转化，因此可以看出不需要缩短ORF或5′-非编码区。
但时间延迟六个小时才能达到P-450的最大产生始终是一个问题，时滞是工业应用的一个主要问题。发明目的因此，本发明的一个目的是提供在放线菌中表达的蛋白质的转录启动子，其使蛋白质在合适的表达系统中显著地表达，而没有必须由蛋白质底物诱导的转录。
本发明进一步的目的是提供在链霉菌中表达的蛋白质的转录启动子，其使蛋白质在合适的表达系统中显著地表达，而不需要启动子底物诱导。
本发明进一步目的是提供在放线菌中表达的蛋白质的转录启动子，其使蛋白质在合适的表达系统中进行组成型表达，而不需要启动子底物诱导。
本发明进一步目的是提供这种启动子全部或部分DNA序列；具有全部或部分这种启动子活性的DNA；包含这样启动子的载体；被这些载体转化的宿主细胞；用这样的宿主细胞生产重组蛋白质的方法。
本发明的一个特别目的是提供一种通过使用宿主表达的重组P-450蛋白质生产普伐他汀钠的方法，其中蛋白质的转录由启动子调控。
本发明其它目的和优点将在下文说明中变得显而易见。发明概述现已发现减小与编码P-450sca-2的基因相关的5’-非编码区的长度不仅出人意料地去除了ML-236B的底物增强作用，而且也提高了启动子的效用。
因此，一方面，本发明提供了具有转录启动子活性的DNA，所述DNA对应于部分而非全部链霉菌Streptonycescafbophilugs可读框紧邻的1kbp5’-非编码区，所述可读框编码P-450细胞色素。
该DNA尤其优选在至少一个链霉菌(Streptomyecscarbophilus)菌种中和/或在至少一个变青链霉菌(S.Lividans)菌株中具有转录启动子活性。附图简要说明
图1是包含P-450sca-2基团5’-非编码区的428bp的质粒pSCA1013-△(1013/428)的构建方案；图2是包含从P-450sca-2基团的5’-非编码区3’末端获得的本发明的320，158，101和74bp启动子的质粒[分别是pSCA10l3-△(1013/320)，pSCA10l3-△(1013/158)，pSCA1013-△(1013/101)和pSCA1013-△(1013/74)]的构建方案；图3是图1中得到的质粒pSCA1013-△(1013/428)的限制性酶切图；图4是包含部分P-450sca-2基因和1kpb5′启动子的质粒pSCA101的限制性酶切图；图5是包含1kbp5’启动子和P-450sca-2ORF的质粒pSCA205的构建方案。本发明详细说明本申请发明人已证实减小与链霉菌(S.carbophilus)P-450基因相关的5’-非编码区，特别是与P-450sca-2基因相关的5’-非编码区的大小对转录启动的最大速率影响极小或没有影响，大小的减小也能有利地消除底物诱导的需要。底物诱导的效应是正效应，因此期望去除该效应以剩下仅启动基础水平的转录的启动子。相反，缩短的启动子区作用明显比与1kbp启动子相关的基础水平更好。即使长度短至74bp，其与1kbp启动子相比仍具有有利的活性。
而且，减小长度的启动子的转录速率看来是必要的，这样可立即获得转录的高速率，而不是在暴露于ML-236B或另外合适的底物后不得不为产生表达的最大速率再等六小时的时间。这在工业上特别重要。
具有转录启动子活性并与P-450 ORF紧邻的1kbp5’-非编码区在这里也认为是5’-启动子。特别地我们优选与链霉菌(S.Carbophilus)的P-450 sca-2基因相关的启动子。
尽管5′-启动子被认为长度是1kbp，这只是5′从ORF转录起始区(tsr)延伸的区的大约的长度。tsr位于大约SEQ.ID.NO.1的384位，ATG起始密码子紧接着428位。包含5′启动子的区域的末端是位于ORF上游1013bp的SacI位点。该区域的SacI位点是Watanabe等(上文)公开的，但他没有测定5′启动子的长度。为了便于参考，在这里5′启动子被认为是1kbp长度，而不是1013bp，因为这实际上是很正确的，不构成本发明的必要特征，这在下文中将变得更明显。在任何情况下，本发明启动子必须比5′启动子全长1013bp短。
与P-450sca-2基因相邻的1kbp5′区不必需包含该基因的全部启动子区，但该区大小暗示其是包含的。事实上，根据我们已证明长度如74bp一样短的区仍具有类似的或者比原1kbp5′启动子更好的活性，因此本发明启动子看来没有占用完全定义的区。而且也有这种情况，即当长度超过大约160bp，优选300bp或更多时，本发明启动子具有显著更好的启动子活性。
本发明DNA的启动子，这里也认作是本发明启动子，相当于1kbp5’启动子，前提是它们比5′启动子的1kbp长度更短。减短长度可以用任何合适的方法进行，如用限制性内切酶的方法去除一些部分，或者通过设计特异性的较短序列，或者从该序列的3′末端或5′末端进行酶解作用，所述方法包括上述方法的结合。
应该懂得为表现启动子活性，本发明启动子通常一般是双链(ds)，虽然应该理解本发明也设想任意一条组成本发明启动子的互补链。本发明进一步涉及本发明启动子的各部分或者最终被用来构建本发明启动子的互补链中的一条或两条的各部分。
我们特别发现5′酶解作用得到极好的结果，因此即使位于启动子序列3′末端的74bp部分也具有极高的活性。因此在一优选实例中，本发明DNA相当于被按5′→3′方面部分酶解的5′启动子。只要DNA仍具有所需的启动子活性，则不存在启动子DNA的最小长度。
尽管小于100bp长度的启动子可具有好的启动子活性，尤其是在3′末端，但在158和320bp之间的长度显示出了活性的明显提高。320bp片段具有比158bp片段大5倍左右的启动子活性。两个片段都是1kbp5′启动子3′末端片段。启动子活性的这种差异对于本发明并不重要，因为152bp(两个长度上的差别)的长度对转化或表达产生最小的影响。
如果本领域熟练技术人员希望鉴定较大和较小活性之间发生转变的启动子的精确长度，则所需方法完全简单明了并且对本领域熟练技术人员是显而易见的。但是鉴定这样一长度没有什么用途，因为在用158bp和320bp作为启动子序列之间没有实际的差别或优点。
应该明白通常优选使用具有明显高活性而不是较低活性的启动子，这样可实现最大转录，但是也可能使用具有较高活性的启动子的转录速率是不期望地高，在蛋白质生产中耗尽了太多的宿主源。在这种情况下，则期望较小活性的启动子。
我们还证明存在一个为428bp和全部1kbp之间长度的启动子，其中失去了对底物诱导的依赖。尽管通过5′末端酶解获得428bp特定长度，但完全有可能整个1kbp序列中任何428bp序列或相似序列均可同样作为启动子。
如上所述，丧失对底物诱导的依赖是非常有利的。同时，发生这种情况的精确长度是不重要的。我们证实在底物诱导至少1小时后，428bp长度的启动子的活性相等于或者略高于5′启动子的全部活性。因此，小于原启动子一半长度的启动子运作得至少和原启动子一样好，而不需要底物诱导。这意谓着立即被促进了其中表达速率是一个因素的任何过程。大于428bp的长度增加了操纵控制的难度，不利于使用者。此外，在某一点上，较长启动子又变得再次受底物诱导的支配，从而显现不出任何由本发明较短启动子带来的好处。
因此本发明DNA优选这样一个长度其证实启动子活性基本上相当于或较大于5′启动子的320和/或428bp3′片段的启动子活性。具体地，我们优选没有长至受底物诱导支配的启动子的长度。
术语“底物诱导”是本领域公知的。实质上，当存在它们可作用的底物时，自然界通常只需要一些表达产物。在所述底物不存在时，生物体将通过表达产物而耗掉原料。因此在自然界形成了各种系统，而使得产物的表达只在底物存在下发生。
在P-450sca-2情况下，这通过底物如ML-236B的启动子位点作用诱导mRNA转录而达到。毫无疑问ML-236B是P-450sca细胞色素的天然底物。如果与可以诱导5′启动子的ML-236B不同，也可为其它底物，包括指定底物的那些。诱导5′启动子的适宜底物的另外的例子是上文所述的苯巴比妥。不管怎样，5′启动子诱导物的准确特性对于本发明并不重要，这里也将不再讨论。
尽管本发明并不被理论约束，但出人意料地，似乎很可能是P-450sca-2细胞色素的底物的诱导以某种方式克服了转录上的一个阻碍。尤其是通过启动子5′末端的酶解的1kbp启动子区大小的减小，看来是用来去除这个阻碍。因为这个原因我们相信不存在一个重新开始底物诱导的启动子的特殊长度，在某一点后，启动子活性随增长的长度而降低，因为又生成了转录启动阻碍。底物诱导可能以直接与转录启动阻碍再生成正比的方式开始起作用，或者在一旦达到一定长度时才可能。在任何情况下，优选由于增加长度超过500bp而未减小活性的启动子。换句话说，长度超过大约500bp，更尤其是超过428bp，且活性降低的启动子不是优选的。
本发明DNA相当于5′启动子的一部分或几部分。术语“相当”是指本发明DNA具有与5′启动子相似类型的启动子活性，这样它可启动P-450sca细胞色素ORF的转录。这种启动发生的水平不是本发明的必要特征，本文说明了本发明启动子的启动子活性水平。如本文所述，应该明白本发明启动子具有至少在某些方面比5′启动子更好的活性。
本发明启动子可以完全相当于5′启动子的一部分或几部分。在一简单的实例中，5′启动子可被从5′末端消化，这样所得本发明启动子具有与5′启动子剩下的3′部分相同的序列。如果5′启动子被从5′末端酶解，并且还通过内切酶酶解和连接去除一部分，则所得本发明启动子完全相当于5′启动子的有关的两部分。在这两个实施例中，所得启动子具有与5′启动子一部分或几部分相同的序列。
本发明启动子一般具有一个或几个与5′启动子序列相似或相同的序列。但是本发明启动子的核苷酸序列不需要完全相当于5′启动子的核苷酸序列。尽管一般优选的是本发明启动子与它们相关的5′启动子相关部分具有非常本质的序列同源性，但这不是最重要的。只要求显示必需的启动子活性。
本发明启动子可变化为从原始5′启动子而来，前提是所得启动子仍显示出必需的启动子活性。通常，变化该序列并没有获得多大好处，并且不能保证改变碱基序列而不会破坏或减小启动子活性。但是，碱基序列的一定量修饰不可能具有明显的效果，特别是当它不被碱基序列需要用于编码蛋白质时。
碱基序列的修饰一般发生在转化过程中，或者为了方便，例如引入一个限制性酶切位点。因此本发明通过例如缺失，倒位，插入或取代设计不同于与它们相关的5′启动子序列一部分或几部分的启动子。自然发生的5′启动子序列的变化也可以发生在自然界。也设计了以这样的变异体为基础的本发明启动子。
序列中的其它不同和变化以及产生它们的方法对本领域熟练技术人员是显而易见的，本发明设计了所有这些情况。以这种方式而不是以自然变异方式变化的本发明启动子在这里也认为是突变体，这样设计了突变体和变异体两种。但是应该明白，“相当于紧邻链霉菌(Streptomy CesCarbophilus)可读框的1kbp 5′非编码区的一部分但不是全部，所述可读框编码P-450细胞色素”的表述包括这些突变体和变体。
通常，在60℃ 6×SSC中，合适的突变体和变异体能与具有序列表中SEQ ID NO.1中的核苷酸序列1至428的DNA杂交。突变体和变异体与之杂交的DNA可能或没有可能形成较长序列的一部分。
正如已经讨论的，本发明启动子具有比1kbp5′启动子更高的活性。这不一定意味着受本发明启动子启动支配的ORF转录水平比底物诱导的1kbp5′启动子启动的水平高。相反经常是这种的情况，本发明启动子进行的组成型启动(constitutive promotion)作用是保证蛋白质活性水平在一小时后仍然比例如底物诱导1小时后用5′启动子获得的那些还高，这种结构生产比慢合成要优选得多，例如，其接着达到超过被需要或有用的水平。
尽管本发明DNA对于P-450sca细胞色素是有用的，但应明白它们可以与在任何合适的原核宿主中表达的任何合适的序列结合使用。尤其是，本发明启动子可被用在合适的放线菌宿主，尤其是链霉菌中。本发明启动子相当于来自链霉菌(S.Carbophilus)的启动子的一部分或几部分，因此如果本发明启动子能启动P-450sca细胞色素ORF的转录，则证明其具有所需的启动子活性。
从上述讨论也应明白，当被操作性地连接至适宜ORF中时，进一步提供了本发明的启动子。还提供了载体，如包含本发明启动子的质粒，尤其当启动子操作性地与ORF相关时，和包含这些体的宿主。
载体不一定必须是表达载体。其它载体可以用来增殖本发明启动子，或用来提供易于得到的文库。但是优选表达载体，特别优选包括本发明宿主和表达载体的表达系统。
在放线菌被用作宿主细胞用于异源DNA产物的表达时，一般优选使用变青链霉菌。在P-450sca细胞色素，特别是P-450sca-2的情况下，变青链霉菌还表达必需的电子转移系统来允许细胞色素参与ML-236B羟基化作用。然而任何其它合适的蛋白质或表达产物也可以通过包含本发明启动子的表达系统表达。
一般不优选在原核生物如变青链霉菌中表达真核DNA，因为在真核生物中自然发生的一些翻译后的过程不在原核生物中发生，例如糖基化作用。但这并不阻止真核产物在本发明系统中表达，前提是应明白除非被提供必要条件，否则任何不在表达系统中自然发生的所需翻译后修饰都将不发生。
本发明表达系统尤其有用于大量表达原核表达产物。如果多拷贝质粒如pIJ702被用在表达系统中，则表达产物可以更大量生产。
本发明表达系统尤其特别有用于正常情况下只是在底物诱导之后表达的产物的表达。这种表达系统可以用在一些物质如抗生素的生产过程中。例如当表达产物具有将底物转化或终产物或转化成较后期的中间产物甚至断裂底物的活性时，这样的方法是可能的。该方法可以包括，如果合适的话，将表达系统与生产将要被作用的底物的系统一起培养。
在本发明表达系统的产物是底物正常诱导的情况下，与产生表达系统的底物的共同培养一般将受时滞支配，因此必需等待表达系统生产足够的表达产物。使用本发明表达系统，这将不再成为问题，因为产物是系统自动合成的，不需要底物诱导，因此减小了时滞因素。
应该明白本发明表达系统特别适用于P-450细胞色素，尤其是P-450sca细胞色素，更特别是P-450sca-2细胞色素的表达。如上所述，P-450sca-2由链霉菌(S.Car bophilus)表达。在普伐他汀钠的生产中，将链霉菌(S.Carbophilus)与柑桔青霉有益地共培养。在该系统中，P-450sca-2用于将柑桔青霉表达的底物ML-236B羟基化，但只是在ML-236B诱导P-450sca-2转录的一段延迟后。使用本发明表达系统，在普伐他汀钠的生产中不再需要一时滞期。这时普伐他汀钠的工业化生产产生了很大益处。
下面是本发明的一些优选实施例。
本发明优选启动子与具有SEQ ID NO.1核苷酸序列1至428或1至320的DNA杂交。
优选具有SEQ ID NO.1核苷酸序列1至428的启动子。也优选具有SEQ ID NO.1核苷酸序列1至320的启动子。本发明进一步提供这些启动子的突变体和变异体。
也提供了包括本发明启动子的重组DNA载体，特别地，这些载体进一步包括在启动子调控下编码所需多肽的DNA，其中载体能在合适宿主细胞中表达多肽。优选多肽为细胞色素P-450sca-2。
本发明也提供了被这些载体转化的宿主细胞。优选的宿主细胞是放线菌，特别是变青链霉菌。特别优选的是变青链霉菌SANK62795(FERMBP-5299)。
本发明进一步提供生产如上所定义的所需多肽的方法，该方法包括在允许生产多肽的条件下培养如上定义的转化宿主细胞来生产多肽，并回收多肽。
本发明进一步提供生产普伐他汀钠的方法，包括在含有ML-236B钠的培养基中，在允许产生细胞色素P-450sca-2，并允许ML-236B钠在被转化细胞中通过本文产生的细胞色素P-450sca-2的催化作用转化成普伐他汀钠的条件下，培养被编码P-450sca-2的本发明表达载体转化的变青链霉菌菌株TK21。然后从所述转化物和/或所述培养基中回收普伐他汀钠。被转化菌株优选为变青链霉菌SANK 62795(FERM BP-5299)。也优选由与所述菌株共培养的柑桔青霉生产的ML-236B。
5′启动子与任何已知的来自放线菌或任何其它来源的启动子是不同源的。一般对于其它启动子，本发明启动子导致编码蛋白质或多肽的DNA转录成RNA的开始。这是蛋白质或多肽(这些名词在本文可以互换)的细胞内生物合成的第一部分。因此本发明启动子是转录启动子，这一功能被称为转录启动子活性。5′启动子，以及具有SEQ ID.NO.1的428，320，158.101和74bP的序列的启动子均具有这种活性。
应该明白本发明启动子可以具有一个或多个在上游和/或下游串联连接的另外的碱基对。这些另外的序列最好被限制，因为基本量的底物诱导将不会被再引入，还因为有用量的启动子活性应该被保留。
本发明启动子调控下的多肽可以如上文所述。应该明白它们可以具有任何氨基酸序列，如，例如天然，变异体或聚合物形式的新的或已知蛋白质；两种或多种不同蛋白质的融合形式；或新设计的多肽。如上所述，优选的多肽是细胞色素P-450sca-2。
关于载体，应该明白要被转化的载体应该是在合适的宿主细胞中能自我复制的载体。因此，该载体应该包含自我复制序列或复制子。在为放线菌情况下，优选载体是pIJ702。
关于宿主，除适合于被选择的载体外没有特别限定。通常，可以使用任何宿主细胞，如野生收集的，或者可通过购买或转让得到的宿主细胞。优选的宿主细胞是放线菌，优选放线菌(StreptomycesCarbophilus)或变青链霉菌，更优选变青链霉菌菌株TK21。
在如上所述的制备普伐他汀钠的方法中，包括在ML-236B钠存在下培养被转化的变青链霉菌菌株，用已知方法回收所得普伐他汀钠。
在一简单的实例中，本发明启动子可以通过利用Watana be等[Gene，(1995)，163，81-85]的方法克隆来自链霉菌(Streptomyces Carbophilus)的DNA而获得。优选的本发明启动子能从其中克隆的链霉菌Streptomycescarbophilus菌株是链霉菌Sereptomycescarbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145)。
在本发明实例中，可用例如PUC18(由Takara ShuzoLtd.，Japan获得)作为克隆载体，从链霉菌(Streptomyces Carbophilus)的整个基因组DNA制备基因组文库。应该明白这些文库和载体构成本发明的一部分。然后可以例如预测的P-450sca-2 N-末端氨基酸顺序为基础合成寡核苷酸探针。然后该核苷酸探针可被用来识别来自编码至少一部分P-450sca的文库的克隆。因为蛋白质N-末端由ORF 5′末端编码，因此很可能用该方法识别的任何克隆也将具有明显量的5′未翻译和非编码区，5′启动子就位于该区。使用该文库和寡核苷酸探针的合适的筛选方法是菌落杂交方法[参见Maniatis，T等，(1982)，“Molecular Cloning-ALaboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，New York-本文涉及的不能通过任何特定参考书获得的任何方法将被一般性地描述在“Molecalar Cloning-A LaboratoryManual”中。
即使被该方法或任何其它方法识别的克隆只包含本发明启动子的一部分，仍可以获得全克隆。标记探针可以从只包含一部分所需DNA的克隆制备。然后该标记探针可被用作进一步筛选基因组文库的模板，以识别和分离包含至少与所需的一样多的5′启动子的克隆。
应该明白本发明设计分离了包含整个或只有部分5′启动子的克隆。为了获得本发明启动子，如果得到了整个序列，那么这可通过例如亚克隆而被进一步加工。如果得到部分序列，则也可以象对整个序列一样对其进行进一步加工，或者在序列没有任何实质性变化时，其可足以作为本发明启动子。
应该进一步明白，上面建议的克隆和制备本发明启动子的方法不是可以使用的唯一方法，其它合适的方法对于本领域熟练技术人员是显而易见的。可以改变任何步骤，或者甚至整个方法。例如可以使用由5′启动子3′末端制备的探针而不是使用相当于P-450sca-2N-末端序列的探针。载体没有特别限定，可以使用任何合适的克隆载体，如其它商业上可得到的载体，包括pBR322。
根据本发明，还应该明白可以使用SEQ.ID NO.1给出的信息，化学合成本发明启动子。如果本发明启动子是要化学合成的话，则可以通过例如亚磷酸三酯的方法进行[参考Hunkapillar，M等，(1984)，Nature，310，105-111]。也可使用半合成方法，例如使用克隆技术和使用本文给出信息的基因工程方法的结合。这种半合成的适宜的方法是本领域公知的。
回到原来说明的通过筛选文库获得本发明启动子的方法，启动子DNA能用本领域熟练人员公知的方法从含有所需序列的克隆中得到[参考Maniatis T等，(1982)，上文]。例如，例如通过使用一种或几种限制性酶可以分离质粒DNA部分，并从可质粒DNA中分离启动子。
用作5′启动子来源的优选菌株是变青链霉菌SANK62795。根据微生物保藏的布达佩斯条约，该菌株于1995年11月21日保藏于National Institute of Bioscienceand Human Technology Agency ofIndustrial Science and Technology，保藏登记号为FERM BP-5299。变青链霉菌SANK62795是包含重组DNA载体pSCA1013-△(1013/428)的放线菌，所述载体反过来包含具有转录启动子活性的DNA，并且由序列表中SEQID NO.1的核苷酸序列1至428与编码细胞色素P-450sca-2的DNA一同组成。所述质粒能在放线菌细胞中通过428bp启动子的活性生产蛋白质。
在所附序列表中，SEQ.ID.NO.1的来源是登记号为FERMBP-1145的链霉素(S.Carbophilus)SANK62585。这是本发明较短的启动子对应的1kbp 5′启动子的初始来源，并根据微生物保藏的布达佩斯条约于1985年9月5日保藏在Fermentation Research InstituteAgency of Industrial Science andTechnology。
变青链霉菌62795和链霉菌(S.Carbophilus)62585分别是变青链霉菌和链霉菌(S.Carbophilus)的典型例子，可以按照Hopwood，D.A.等，(1985)，“GeneticManipulation of StfeptomycesALaboratory Manual”，The John InnesFoundation，Norwich，UK中说明的方法培养，该文献也描述了这些菌株的典型的物理属性。这两菌株由于抗硫链丝菌肽而被选择。
根据本发明优选实例，通过培养变青链霉菌SANK62795，接着从细胞中回收PSCA1013-△(1013/428)，并用限制性酶酶解质粒来分离具有序列表中SEQ.ID.NO.1核苷酸序列1至428的转录启动子。
如果需要，可以通过例如Maxam-Gilbert化学修饰方法[参考Maxam，A.M.，和Gilbert，W.(1980)，Methods in Enzymology，65，499-599]或者使用M13噬菌体的双脱氧链终止方法[参考Messing，J.，和Vieira，J.，(1982)，Gene，19，269-276]测定任何克隆的DNA的核苷酸顺序。
如果想要确定一个特定的DNA序列是否与包含序列表SEQ IDNO1的核苷酸序列1-428的全部或部分的DNA杂交，则可以按下述方法测定。
具体地，必需首先将要测试的DNA在琼脂糖凝胶上电泳，然后将其印迹在硝酸纤维素或尼龙膜，接着通过热处理或紫外照射将吸附的DNA固定在膜上。然后使用探针。该探针具有SEQ.ID.NO.1核苷酸序列1至428的所期望的长度，并用例如放射性元素如32P，生物素，洋地黄毒苷或酶标记，而且一般根据随机引物方法[参考Feinberg，A.P.等，(1983)]，Anal.Biochem.，132，6-13]或切口平移方法[参考Maniatis T，等，(1982)，上文]制备。
将硝基纤维素或尼龙膜浸在含有探针的杂交溶液中，然后在合适的预定温度下，如60℃ ，保温。保温后冲洗膜，并用适于所用标记的方法检测探针。
杂交溶液通常含有SSC(柠檬酸钠水溶液，含有0.15M氯化钠和15mM柠檬酸钠去离子水溶液的1×SSC)。杂交溶液中SSC的浓度优选4-8×SSC，更优选6×SSC。保温温度优选30至70℃，更优选60℃。
与具有序列表SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列1至428的全部或部分杂交的DNA可以用公开的方法从各种基因组文库中克隆。应该明白本发明多数启支子与具有428序列而不是320或其它更短序列的DNA杂交，但选择用于杂交实验的序列的长度可由本领域熟练技术人员利用本文所给的信息容易地选择。
如上所述，本方法得到的DNA可以用本领域公知的方法人为修饰，如通过例如位点特异性突变[参考Mark，D.F，等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662-5666]在所需位点取代，缺失或插入一个或多个核苷酸。应该明白本发明延伸到这种DNA，前提是其具有需的转录启动子活性。
为了证明按上述方法获得的DNA具有转录启动子活性，构建包含与ORF串联连接的DNA的载体并在合适宿主中表达。首先(i)构建重组DNA载体，其中编码合适蛋白质的DNA被操作性地与推断启动子DNA连接，并插入到合适的载体如放线菌质粒pIJ702中[参考Katz，E，等，(1983)，J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714]，然后，(ii)将允许载体稳定复制的合适宿主细胞，如在由pIJ702构建的载体情况下为变青链霉菌，用载体转化，然后确定由编码DNA编码的蛋白质的表达水平。
在上述技术中，当转化物是例如链霉菌时，可以根据Hopwood等[参考Hopwood，D.A.，等，(1985)，“GeneticManipulation of StreptomycesALaboratory Manual”，The John InnesFoundation，Norwich，UK]的方法进行转化。应该明白，用来测定启动子活性的基因在转化之前，一般不应在宿主中存在或表达。
转录的水平可以通过例如RNA印迹法容易地被确定。在RNA印迹法或RNA杂交中[参考Maniatis，T，等，上文］，转化后将宿主细胞培养。然后从细胞中提取并纯化RNA，并进行琼脂糖凝胶电脉，然后将RNA印迹到例如硝基纤维素或尼龙膜上。探针(DNA，RNA或合成的寡核苷酸)可以用放射同位素，如32P，生物素，洋地黄毒苷或用特异性检测蛋白质基因的酶标记。然后通过杂交，用该探针检测从该基团转录的mRNA。
转录水平也可用RNA-PCR[Polymerase ChainReaction，参考Innis，M.A.等，(1990)，“PCR PROTOCOLS”，Academic Press，NewYork]容易地测定。首先用类似于RNA杂交的方法制备RNA。然后用逆转录酶从作为模板的mRNA合成cDNA。逆转录可以使用趋于非特异性的寡(dT)，或具有与编码表达蛋白质的基因的一部分同源的序列的寡核苷酸作为模板。使用该c DNA为模板，可以通过使用两个寡核苷酸引物来进行聚合酶链反应。这些引物与ORF反链是互补的，并且与它们互补的位点在基因中具有不同的位置，因此由PCR产生的链能够相互杂交。反应进行至给定时间后，将所得ds DNA进行电泳并在硝基纤维素膜上检测，例如，以存在或不存在期望长度的电泳带为基础，测定所需DNA的转录水平。
通过测定产生的蛋白质的生理活性可以确定产物表达的水平。因此例如可以制备重组DNA载体，其中将编码具有指定活性的蛋白质，例如酶的DNA如通过连接操作性地连到推断启动子的3’-末端。与推断启动子相连的ORF的表达水平可接着用宜于产物表达的方式来测定。
在这种质粒编码细胞色素P450 sca-2，并且质粒与变青链霉菌相容的情况下，那么可将质粒引入不产生P-450 sca-2的变青链霉菌菌株中，接着在ML-236B钠存在下培养该转化体。产生的普伐他汀钠的量是由推断启动子启动的P-450 sca-2表达水平表征。
应该理解表达产物的分析方法可特异性地设计来适合相关的产物。例如推断启动子可被操作性地连接到抗药基因上，如乙酰氯霉素转移酶基因[c.f.Gorman，C.M.，et al.，(1982)，MOL.Cell.Biol.，2，1044-1051]，或荧光素酶基因[c.f.dewet. J.R.，etal.，(1987)，Mol. Cell.Biol.，7，725-737]，这些基因可通过本领域熟知的方法测定。还可采用借助于表达产物的活性的其它分析表达的方法。
测定表达的另一方法是例如通过使用适宜的抗体来识别产物，再次制备包含操作性连接到ORF上的推断启动子的表达载体，转化到适宜的宿主中，并在适于表达的条件下培养。
将培养基或转化细胞的匀浆暴露在抗体中，测定抗原-抗体复合物的量。适宜的测定技术包括放射免疫分析法[C.f.Berson，R.s.，etal，(1973)，“Methods in Investigativeand Diagnostic Endocrinology”，Vol.2A，2B，North-Holl and Publishing Co.，Amsterdam]，酶免疫测定法[C.f.Engvall，E.，(1980)，Method in Enzymology，70(A)，419-439]，Western印渍[c.f.Harlow，E.，et al.，(1988)，“Antibodies -ALaboratory Manual”，P.471，ColdSpring Harbor Laboratory，New York]和免疫沉淀[C.f.Ressler，S.W.，et al.，(1981)，“Methods in Enzymology”，73(B)，442-459]，它取决于希望如何来测定相互作用和抗体或抗原是否以任一方标记。在任何情况下，应该理解现在讨论的这些方法并不是包罗无遗的，对于本领域的技术人员来讲，其它方法也将是显而易见的。
还应该理解，对于本领域的技术人员来讲，本发明推断或实际启动子的转录启动子活性的许多其它测定方法都是易于获得和显而易见的，本发明包括所有这些方法。例如，需表达的蛋白质具有除活性或抗原性外的特征特性，还可用通过这样一种特性的测定方法直接或间接测定，例如活性。
一旦已确定将要用作本发明启动子的DNA具有启动子的必需活性，那么它可被采用来构建任何适宜的所需蛋白质的表达载体。任何适宜的宿主可被用于此目的，该宿主可与用来确定DNA是否确实具有启动子活性的宿主相同或不同。蛋白质不局限于它的序列，可具有任何氨基酸序列。如上所述，该序列可选自，但不局限于新的或已知蛋白质(或肽)的天然，变体或聚合物形式；两种或多种不同蛋白质(或肽)的融合形式；或新设计的多肽。如前面提到的，细胞色素P-450sca-2是优选的表达产物，适宜载体为pSCA1013-△(1013/428)，该载体从变青链霉菌(Streptomyces Lividans)SANK 62795(FERM BP-5299)中分离。
应该理解术语“表达产物”，“蛋白质”和“多肽”通常可以互换，在本文被以这种意义使用。在某些情况下，从原始DNA转译而来的多肽不是最终产物，只是最终产物的中间形式，需要转译后修饰来获得所需产物。在P-450sca-2的情况下，需要将铁结合到蛋白质中的血红素环中以产生最终的表达产物。因此，虽然在本文中同义地使用术语“表达产物”，“蛋白质”和“多肽”，但本领域技术人员可以认识到在相应的上下文中的这些术语之间的差别。
除放线菌外，本发明启动子的适宜宿主的实例包括原核生物，如大肠杆菌和枯草杆菌。
在非放线菌菌株被用作宿主，或选择的放线菌菌株不适合于载体类型时，应该理解为载体应包括适于讨论菌株的复制子，例如起源于与宿主相容的种类的复制子。需要包含适宜于宿主的复制起点和调节序列的质粒载体。在本发明的启动子不能在特殊宿主中工作，甚至在存在其它适宜控制序列的情况下，也不能容易地被本领域技术人员修饰而使其工作的情况下，那么这种情况可能具有被限定的用途。例如，这种情况可能在倍增启动子中有用。应该理解，在这种修饰和/或适宜的控制序列易于被本领域技术人员获得和/或识别时，这种情况则被本发明所包括。
虽然除指定宿主中的表达所需的那些外本发明的表达载体，不需要任何其它特性，但应该理解固定的选择标准能是有用的。这些标准包括质粒借此将特性如表达和转化的选择性授予宿主，从而使表型被修饰的那些。
适宜的使用放线菌的转化方法包括使用溶菌酶使放线菌培养物形成原生质球。为了将载体引入宿主细胞，接着加入含有重组DNA载体和聚乙二醇的缓冲溶液，例如通过Thompson或Hopwood的方法[C．f．Thompson，C．J.，et al.，(1982)，J．Bactefiol.，151，668-677或Hopwood，D.A.，et al.，(1985)，“GeneticManipulation of StreptomycesALaboratory Manual”，The John InnesFoundation，Norwich]。抗硫链丝菌肽基团通常作为转化质粒中的选择性标记[C.F.Hopwood，D.A.，et al.，(1987)，“Methods in Enzymology”153，116，Academic Press，New York]，但本发明不限于此。
如果为了在控制本发明启动子的条件下表达产物而需要转化大肠杆菌，那么通常适宜的方法是将相关的重组DNA载体加入到感受态细胞中。通常在盐，如氯化钙，氯化镁和氯化铷存在的情况下制备感受态细胞[C.F.Hanahan，D.，(1983)，J.Mol.Biol.166557-580]。另一种方法包括电穿孔，它包括将高压脉冲用于包含宿主E.Coli和表达载体的悬浮液中，从而致使载体掺入到细胞中[C.f.ElectroporationDower，W.J.，et al.，(1988)，Nucleic Acid Res.，16，6127和Calvin，N.M.et al.，(1988)，J.Bacteriol.，170，2796]。
适宜的选择性标记，即在宿主上授予特定表型的那些，包括抗药标记基团，如授予抗青霉素或四环素抗性的那些标记。然而，对于本领域技术人员来讲，许多都是显而易见的，本发明作为提供特定实施例的所有其它情况不因此而被限制。
在枯草杆菌被打算作为宿主细胞的情况下，适宜的方法是使用溶菌酶让宿主细胞成为原生质体。接着含有重组DNA载体如聚乙二醇的缓冲溶液加入到原生质体中，再通过电穿孔(上文)将载体掺入宿主细胞中[C.f.Cheng.S.，et al.，(1979)，Mol. Gen. Genet.，168，111]。在一优选实例中，一种抗药标记，和抗氯霉素的标记被用作转化细胞系的选择性标记，但应明白也可以使用很多其它的选择性标记。
与宿主无关，可使用本领域技术人员熟知的方法使用由培养物通过细胞内或细胞外或两种情况而产生的所需多肽培养所需转化体。培养所用的培养基可适当地选自通常用于相关宿主细胞的各种类型的培养基。一般来说，对于特定宿主正常情况下可接受的那些培养条件也可用于所需多肽的表达，例如由多肽的性质所要求的任何修饰而决定。
例如典型的放线菌的营养包括用作碳源的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、淀粉浆、糖浆、豆油。作为氮源、豆粉、小麦胚、肉膏、胨、玉米浸泡液、干酵母和硫酸铵是适宜的。除上面外，无机盐如氯化钠、氯化钾、碳酸钙或磷酸钙以及如果需要也可以适宜地结合使用用于促进微生物生长或促使所需多肽产生的添加剂。
而且，普遍适宜于讨论宿主的培养方法也适用于转化微生物，包括适合于工业化生产的如液体培养的深层培养方法。
除非本文另外一般性的相反说明或特指，我们优选的培养条件包括20-37℃之间的温度，优选26-28°之间。
在控制本发明启动子的条件下，表达产物通常在细胞内或细胞外，偶尔在两种情况下产生。可通过本领域技术人员熟知的各种方法，尤其是根据多肽物理或化学性质的那些方法分离，纯化和回收产物。在外表达多肽的情况下，可通过离心培养基，例如除去细胞，从产生的上清液分离，纯化和回收多肽。
为了分离和纯化积累在细胞内的多肽，首先将细胞悬浮于含有蛋白酶抑制剂的溶液中，接着用如本领域技术人员共知的方法，例如超声匀浆器来匀浆。
虽然一般不需要解释本发明，但应该理解所需蛋白质的分离，纯化和收集的具体方法的实例包括蛋白质沉淀，超滤，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析、离子交换层析、亲和层析、各种适宜类型的液相色谱，包括高效液相色谱(HPLC)，透析以及它们的结合方法。
在任何情况下，应该理解利用本发明可容易地在工业规模上，高产量，高纯度地制备所需化合物。
还应该理解，可通过使用未纯化或部分纯化的制备样品分析本发明转化宿主细胞产生的多肽的活性。P-450sca-2可以上述方式从变青链霉菌获得，并直接用在例如普伐他汀钠的产生中。必需的电子运输系统存在于变青链霉菌细胞中，因此相对直接获得催化ML-236B钠的6位上的羟基化作用的转化宿主微生物。
在本发明的具体例中，启动子一般用来帮助细胞色素的表达，但这还可用于产生例如普伐他汀钠。通过该方法产生的任何普伐他汀钠可接着通过Serizawa，et al.，的方法回收[C.f.Serizawa，N.，et al.，(1983)，J.Antibiotics，36，608].变青链霉菌SANK 62795(FERM BP-5299)可以这种方式使用。
现将参考下面实施例对本发明作进一步的描述，实施例只是说明，而不对本发明进行约束。没有特定说明的任何方法，制剂，溶液等等均可在“Molecular Cloning-A LaboratoryHandbook”(上文)中找到。所有溶液均为含水的，除非另有说明。
在下面实施例中，我们证实了使用本发明的启动子可在宿主微生物中产生所需多肽。实施例1
分离P-450 sca-2启动子和构建表达的细胞色素P-450sca-2的质粒载体(1-1)构建质粒pSCA101和pSCA108通过克隆包含P-450sca-2基因和启动子的区的不同片段构建质粒pSCA101和pSCAl08，这些片段用根据Watanabe和他的同事描述的方法从Stfeptomyces cafbophilus的基团因组DNA衍生而来[C.f.Watanabe，I.，et al.，(1995)，Gene，163，81-85和日本专利
发明者渡边一郎, 芹泽伸记 申请人:三共株式会社