专利名称：一种烟草野火病病菌分离方法
技术领域：
本发明属于农业微生物分离技术领域，具体涉及一种操作简便、快捷，适合于田间作业条件下采集病菌的烟草野火病病菌分离方法。
背景技术：
烟草野火病(tobacco wild fire)是世界烟草生产中危害较严重的细菌病害之一，也是我国烟草的主要病害之一。野火病主要为害叶片，也能侵害花、蒴果和种子。叶上症状初为水溃状圆形褪色的小斑点，后来斑点扩大，中心变成褐色，周围有一圈很宽的黄绿色晕环，于幼苗期或气候潮湿时最为明显，直径可达f 2厘米。烟草受害后，一般发病率1(Γ30%，严重地块发病率7(Γ100%，能够导致绝收。要实现烟草野火病抗病品种选育、病害的控制都与病菌小种的分化、群体遗传的多样性密切相关，因此烟草野火病病菌分离是最基本的工作。目前，烟草野火病的分离多采用组织破碎法进行，选取病组织表面消毒后，破碎组织，稀释涂布或划线分离。这种方法在有效去除病组织表面腐生微生物的同时，也杀灭了大量的目标病菌，致使大量的病样难以分离到病菌，分离效率比较低下，浪费了大量标本。为此，开发一种操作简便、快捷，适合于田间作业条件下采集病菌的烟草野火病病菌分离方法，对于烟草野火病防治工作是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种操作简便、快捷，适合于田间作业条件下采集病菌的烟草野火病病菌分离方法。本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤:
Α、选择病斑:选典型烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；
B、收集喷菌液:将病斑的中心点切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3 1/2处；在凹槽中滴加15(Γ300μ 无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；
C、分离扩繁:在无菌条件下将喷菌液5倍或10倍倍比梯度稀释，取稀释53~5或103~5倍的稀释液10(Γ200 μ L涂布于KMB培养基平板，在24 28°C下培养48 72h ；
D、菌落选取:取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的1(Γ15个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成1(T 107CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，每株接种7、个点，每个点接种0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度大于80%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。
本发明根据烟草野火病病菌能局限于发病死体组织中的特性，以叶片上的病斑作为分离烟草野火病病菌的基础材料，不经过表面消毒，利用细菌的喷菌现象，病菌从完整的病组织释放，以收集到喷菌液实现分离扩繁。本发明收集喷菌液可以在田间采样时进行，不必回到实验室，能够减少杂菌污染，也提高了工作效率；本发明的分离效率高、病样用量少，与普通组织破碎法分离比较，可以节约3(Γ50%的病样标本；本发明的分离的纯度高，病菌在喷菌液中处于优势，分离纯化一步到位，减少了转代的次数，保持了病菌野生型特性，特别是对保持病菌的致病力有利。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限定，任何基于本发明的技术思路的等同替换，均落入本发明的保护范围。本发明所述的方法包括以下步骤:
Α、选择病斑:选典型烟 草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；
B、收集喷菌液:将病斑的中心点切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3 1/2处；在凹槽中滴加15(Γ300μ 无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；
C、分离扩繁:在无菌条件下将喷菌液5倍或10倍倍比梯度稀释，取稀释53~5或103~5倍的稀释液10(Γ200 μ L涂布于KMB培养基平板，在24 28°C下培养48 72h ；
D、菌落选取:取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的1(Γ15个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成1(T 107CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，每株接种7、个点，每个点接种0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度大于80%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。C步骤所述的KMB培养基按以下配比制备:怿蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁1.5g或硫酸镁0.738g、甘油10ml、琼脂17 20g，加蒸馏水至1000ml，调整pH值至
7.0 7.2。D步骤所述的烟草样本植株为易感病品种K326、G28、红花大金元或云烟85生长至6 7片真叶时的植株。D步骤所述的接种点选择于侧脉之间，接种点间距为1.(Tl.5cm。所述的烟草野火病菌分离方法还包括目标菌落保存操作，取D步骤确定的目标菌落放入保存液中，配制成10卜107CFU/mL的菌悬液，在-2(T-70°C下保存；所述的保存液为15^40%的甘油蒸馏水溶液。本发明的工作原理:
本发明根据烟草野火病病菌能局限于发病死体组织中的特性，以叶片上的病斑作为分离烟草野火病病菌的基础材料，不经过表面消毒，利用细菌的喷菌现象，病菌从完整的病组织释放，以收集到喷菌液实现分离扩繁。实施例1
按怿蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁1.5g、甘油10ml、琼脂17g配比,加蒸懼水至1000ml，调整pH值至7.0,制备KMB培养基。
实施例2
按怿蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸镁0.738g、甘油10ml、琼脂20g配比，加蒸馏水至1000ml，调整pH值至7.2，制备KMB培养基。实施例3
按怿蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁1.5g、甘油10ml、琼脂19g配比,加蒸懼水至1000ml，调整pH值至7.1，制备KMB培养基。实施例4
选典型烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；将病斑的中心点切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3处；在凹槽中滴加150 μ L无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；在无菌条件下将喷菌液5倍倍比梯度稀释，取稀释53倍的稀释液100 μ L涂布于实施例1制备的KMB培养基平板上，在24 28°C下培养48h ;取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的10个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成IO6 107CFU/mL的菌悬液 ；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本K326植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，接种点选择于侧脉之间，间距1.(Tl.5cm，每株接种7个点，每点接种0.1mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度82%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。实施例5
选典型是烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；将病斑的中心点切成“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/2处；在凹槽中滴加300 μ L无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；在无菌条件下将喷菌液10倍倍比梯度稀释，取稀释IO3倍的稀释液200 μ L涂布于实施例2制备的KMB培养基平板上，在24 28°C下培养72h ;取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的15个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成IO6 107CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本云烟85植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，选择侧脉间距1.(Tl.5厘米的位点，每株接种9个点，每点接种0.2mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度83%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。实施例6
选典型是烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；将病斑的中心点切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3处；在凹槽中滴加200 μ L无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；在无菌条件下将喷菌液5倍倍比梯度稀释，取稀释55倍的稀释液150 μ L涂布于实施例3制备的KMB培养基平板上，在24 28°C下培养60h ;取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的12个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成IO6 107CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本G28植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，选择侧脉间距1.(Tl.5厘米的位点，每株接种8个点，每点接种0.15mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度84%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。
实施例7
选典型是烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；将病斑的中心点切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/2处；在凹槽中滴加250 μ L无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；在无菌条件下将喷菌液10倍倍比梯度稀释，取稀释IO5倍的稀释液180 μ L涂布于实施例2制备的KMB培养基平板上，在24 28°C下培养54h ;取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的11个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成106^107CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本红花大金元植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，选择侧脉间距1.(Tl.5厘米的位点，每株接种7个点，每点接种0.2mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度81%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。实施例8
将实施例4选择的目标菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌悬液，在_20°C下保存，保存液为15%的甘油蒸馏水溶液。实施例9
将实施例5选择的目标菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌悬液，在_70°C下保存，保存液为40%的甘油蒸馏水溶液。实施例10
将实施例7选择的目标菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌悬液，在_45°C下保存，保存液为30%的甘油蒸馏水溶液。实施例11
将实施例4选择的目标菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌悬液，在_30°C下保存，保存液为15%的甘油蒸馏水溶液。实施例12
将实施例6选择的目标菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌悬液，在_60°C下保存，保存液为35%的甘油蒸馏水溶液。
权利要求
1.一种烟草野火病病菌分离方法，其特征在于包括以下步骤: A、选择病斑:选典型烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下； B、收集喷菌液:将病斑的中心点切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3 1/2处；在凹槽中滴加15(Γ300μ 无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液； C、分离扩繁:在无菌条件下将喷菌液5倍或10倍倍比梯度稀释，取稀释53~5或103~5倍的稀释液10(Γ200 μ L涂布于KMB培养基平板，在24 28°C下培养48 72h ； D、菌落选取:取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的1(Γ15个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成1(T 107CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，每株接种7、个点，每个点接种0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度大于80%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。
2.根据权利要求1所述的烟草野火病病菌分离方法，其特征在于C步骤所述的KMB培养基按以下配比制备:怿蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁1.5g或硫酸镁0.738g、甘油10ml、琼脂17 20g，加蒸馏水至1000ml，调整pH值至7.0 7.2。
3.根据权利要求1所述的烟草野火病病菌分离方法，其特征在于D步骤所述的烟草样本植株为易感病品种K326、G28、红花大金元或云烟85生长至6 7片真叶时的植株。
4.根据权利要求1所述的烟草野火病病菌分离方法，其特征在于D步骤所述的接种点选择于侧脉之间，接种点间距为1.(Tl.5cm。
5.根据权利要求1所述的烟草野火病病菌分离方法，其特征在于还包括目标菌落保存操作，取D步骤确定的目标菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌悬液，在-2(T-70°C下保存；所述的保存液为15 40%的甘油蒸馏水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种烟草野火病菌分离方法，选典型烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；将病斑的中心点切成“+”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3~1/2处；在凹槽中滴加150~300μL无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；在无菌条件下将喷菌液5倍或10倍倍比梯度稀释，取稀释53~5或103~5倍的稀释液100~200μL涂布于KMB培养基平板，在24~28℃下培养48~72h；在紫外光下选择有绿色荧光的单菌落，经致病力测定，形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。本发明集分离、纯化、鉴定为一体，分离病菌效率高、准确性强，适用于田间采样的及时分离，分离病菌的纯度高，保持了病菌野生型特性。
文档编号C12N1/20GK103173393SQ201310087788
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者方敦煌, 陈学军, 李永平, 肖炳光, 秦西云 申请人:云南省烟草农业科学研究院