专利名称：一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染的贝类监测方法
一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染的贝类监测方法技术领域
本发明属于生物监测环境技术领域，具体涉及一种海洋溢油污染的贝类监测方法。
背景技术：
21世纪是“海洋的世纪”。如何有效地保护海洋环境，维护近海海域生态平衡己成为各国制定本国可持续发展战略的重要组成部分。引起海洋污染的途径很多，其中海洋溢油被认为是最严重、最广泛的海洋污染类型之一，已引起当前世界各国的普遍关注。近年来，世界各地油田漏油、油船泄露等重大溢油事故频发，如2010年墨西哥湾溢油事件，2011年渤海的“蓬莱19-3”溢油事件等。我国海洋环境质量监测表明，石油类是我国海洋环境中三种主要超标污染物中唯一的有机污染物；部份站位沉积物中的石油类含量劣于第三类海洋沉积物质量标准；受石油烃等的影响，12%监测站位的生物质量劣于第三类海洋生物质量标准。石油污染不仅会影响海洋生物的生长、发育和繁殖，而且会通过食物链进入人体对人类健康造成潜在威胁。严重的溢油事故会对局部海域的生态系统造成毁灭性破坏。因此，加强海洋溢油污染的有效监测体系的建设，深入研究石油污染的生物累积效应及毒性影响，对于保护海洋渔业资源的健康和可持续发展具有重要的意义。
目前，对海洋溢油污染进行监测，主要采用物理化学分析的方法。但是低剂量的石油污染化学方法常常无法检出，并且理化监测只能代表取样期间的石油污染情况，而生物监测更加敏感，可以将长期的污染状况反映出来。石油烃污染进入水生生物体内后经过生物转化，在氧化还原循环中产生大量活性氧自由基(ROS)，这些ROS具有很高的活性，可攻击各种生物大分子，造成酶失活、蛋白质变性、脂质过氧化、DNA损伤等氧化损伤。而抗氧化酶在ROS的产生和消除过程中起着重要的作用，而且对于这些可能产生ROS的污染物的暴露，既可由于适应性反应而被诱导，也可由于中毒反应而受到抑制。因此抗氧化系统可以作为监测海洋溢油污染的生物标志物。
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase, S0D)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione pe`roxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽转硫酶(Glutathiones-transferase, GST)和过氧化物酶(Peroxidase, POD)是生物体重要的抗氧化酶，能够控制机体代谢的活性氧，在防御过氧化损害方面起到重要作用，能较全面地反映机体受氧化胁迫和生物的应激响应程度。这些抗氧化酶活性在石油污染条件下，既有抑制，又有诱导，而且各种酶在生物毒性暴露响应的不同步性，表明不同的酶对污染物刺激的敏感程度有所差异，若将各种酶活性用于海洋环境监测还不能很好地定量评价污染状况，我们发现应该将这几种酶结合起来分析，才能较准确客观的评估海洋环境的污染状况。因此，建立一种方法将一系列不同量纲的生物标志物进行整合，反映污染的综合效应，以此来比较不同污染状况间的差异。
Beliaeff 和Burgeot(Beliaeff B,Burgeot T.1ntegrated biomarker response:A useful tool for ecological risk assessment.Environmental Toxicology andChemistry,2002,21 (6):1316-1322)将所测定的所有生物标志物整合为统一的参数——整合生物标志物响应指数(IBR)。IBR的大小能够直接指示一定暴露状况下多个生物标志物的综合响应。该方法最近已经开始用于河流海域生物效应评价。但是基于IBR法进行海洋溢油污染评价的贝类生物监测方法尚未见报道。海洋双壳贝类，栖息在在沿海或河口地区，移动能力差，活动范围小，容易暴露于各种海洋污染物中，并且由于其独特的滤食习性，对污染物的富集能力更强和敏感性更高，在世界范围内被广泛用作海洋和河口污染的指示生物。所以，合适指示生物的选择和先进监测方法的建立是本发明的关键所在。
发明内容
本发明的 目的是在于克服已有技术使用化学分析方法对海洋溢油污染进行检测时精确度不高，尤其是低剂量长期石油污染常常无法检出，不能真实全面的反映海洋溢油对海洋环境的污染状况，同时单一生物分子指标与石油污染的剂量-效应关系不理想等问题，从而提供一种先进全面准确的海洋溢油污染的生物监测方法，使用我国典型双壳贝类如菲律宾蛤仔、栉孔扇贝，测定贝类内脏团抗氧化酶活性，并将这些酶活进行整合形成整合生物标志物响应指数(IBR)，建立IBR与石油浓度之间的剂量-效应关系，采用一维方差分析法(ANOVA)进行显著差异性分析，确定石油污染对生物的胁迫程度，最终判定海洋溢油的污染水平。本发明的目的是由如下技术方案实现的:一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法，其特征在于包括如下步骤:(I)贝类生物培养:受试生物贝类实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱中暂养5 7d备用；(2)石油烃暴露实验:配置一定浓度梯度的石油烃试验液，采用半静水接触染毒法，将暂养过的贝类分成7组，其中I组为对照组，另外6组为试验组，同时每组设定3个平行组，分别放入玻璃缸中，在整个实验过程中持续充气，每隔24h换相同浓度的新鲜试验液，于第15d取样；(3)抗氧化酶活性的测定:将贝类活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水中，冰浴匀浆后于4°C条件下3000r/min离心lOmin，然后取上清用生理盐水配成体积比10%组织匀浆，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶和过氧化物酶活性的测定，然后分别稀释成体积比5%组织匀浆用于谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定；1%组织匀浆用于蛋白含量的测定；(4)整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系:将超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性进行整合，形成整合生物标志物响应指数IBR:计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X ；数据标准化:X标准化得到Y, Y = (X-m) /s,其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；
当生物标志物的响应为受活化时，Z = Y ;当生物标志物的响应为受抑制时，Z=-Y；对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min，将其绝对值与Z相加得到得分S，S = Z+|Min|，S彡O;利用星状图表示生物标志物的结果，星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S ;以Si和Si+Ι代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分，η为半径的数目，也就是测定的生物标志物的个数;Ai为第i个和
第i+Ι个半径相连形成的面积，可通过下式计算:
权利要求
1.一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法，其特征在于包括如下步骤: (1)贝类生物培养:受试生物贝类实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱中暂养5 7d备用； (2)石油烃暴露实验:配置一定浓度梯度的石油烃试验液，采用半静水接触染毒法，将暂养过的贝类分成7组，其中I组为对照组，另外6组为试验组，同时每组设定3个平行组，分别放入玻璃缸中，在整个实验过程中持续充气，每隔24h换相同浓度的新鲜试验液，于第15d取样； (3)抗氧化酶活性的测定:将贝类活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水中，冰浴匀浆后于4°C条件下3000r/min离心lOmin，然后取上清用生理盐水配成体积比10%组织匀浆，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶和过氧化物酶活性的测定，然后分别稀释成体积比5%组织匀浆用于谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定；1%组织匀浆用于蛋白含量的测定； (4)整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系:将超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性进行整合，形成整合生物标志物响应指数IBR: 计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X ； 数据标准化:X标准化得到Y, Y = (X_m)/s,其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；当生物标志物的响应为受活化时，Z = Y ;当生物标志物的响应为受抑制时，Z = -Y5对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min，将其绝对值与Z相加得到得分S，S = Z+|Min|，S彡O;利用星状图表示生物标志物的结果，星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S ;以Si和Si+Ι代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分，η为半径的数目，也就是测定的生物标志物的个数;Ai为第i个和第i+Ι个半径相连形成的面积，可通过下式计算:A =Cos^ + Si+1 sinβ);其中 ^ S sina 、β = Arctan -~~一 , α =2π/η, Sn+1 = S1 ;总面积即为整合生物标志物响应(IBR)， ~Λ +1 COS^JIBR = YjAi ’.i=l 绘制IBR与石油烃含量的剂量-效应关系，结果呈现出显著的线性关系； (5)海洋溢油污染贝类监测评价:海洋溢油事故发生后，根据溢油扩散的范围设置一定数量的站位SI，S2，....St,同时在清洁海域设定对照站位S0，将已经暂养驯化的贝类转移至溢油海域的站位SI，S2，....St和对照站位S0，放置15d后取出，迅速测定溢油海域站位SI，S2，....St和对照站位SO贝类生物体超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，并将这些抗氧化酶整合形成IBR，进行方差分析，并用均值多重比较分析法分析对照组SO与溢油站位SI，S2，....St贝类IBR的差异显著性，当P > 0.05为差异不显著，表明溢油污染对贝类没有产生明显胁迫，基本没有石油污染；当P < 0.05为差异显著，表明溢油污染对贝类中度胁迫，石油污染程度较重；当P<0.0l为差异极显著，表明溢油污染对贝类重度胁迫，石油污染程度严重。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(I)实验用水为沿海自然海水，经砂滤处理，盐度为29.08±0.18，pH为7.85±0.03，温度为21.05±0.43°C，暂养期间连续充气，每24h换水一次；投喂小球藻2次/日。
3.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于步骤(3)中谷胱甘肽过氧化物酶活性定义每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低Iμ mol/L为一个酶活性单位；谷胱甘肽转硫酶活性定义每毫克组织蛋白在37°C反应I分钟扣除非酶促反应，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低I μ mol/L为一个酶活性单位；超氧化物歧化酶活性定义每毫克组织蛋白在ImL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50%时所对应的超氧化物歧化酶量为一个酶活性单位；过氧化氢酶活性定义每毫克组织蛋白每秒钟分解Ipmol的H2O2的量为一个酶活性单位；过氧化物酶活性定义37°C条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生I μ g的底 物的酶量为一个酶活性单位。
全文摘要
本发明属于生物监测环境技术领域，具体涉及一种海洋溢油污染的贝类监测方法，使用我国典型双壳贝类如菲律宾蛤仔、栉孔扇贝，测定贝类内脏团抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性等，并将这些酶活进行整合形成整合生物标志物响应指数(IBR)，建立IBR与石油浓度之间的剂量-效应关系，采用一维方差分析法(ANOVA)进行显著差异性分析，确定石油污染对生物的胁迫程度，最终判定海洋溢油的污染水平。
文档编号C12Q1/30GK103146805SQ20131008917
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者夏斌, 陈碧鹃, 辛福言, 孙雪梅, 崔毅 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所