专利名称：检测或辅助检测高丹草国审品种方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测或辅助检测高丹草国审品种方法。
背景技术：
自2006年，农业部连续组织开展草种质量监督抽查工作，发现一些不法商家在利益驱动下，更换草种名称，假冒国内优良品种，或用国产草种假冒进口草种，扰乱了草种市场秩序，损害了育种家的权益和农牧民的利益。由于缺少草种真实性快速鉴定技术标准，质量监管过程中无法出具科学鉴定结果，不法商贩得不到应有的惩罚，牧草品种拥有者的权益得不到保护，草种打假工作难见成效。因此，迫切需要研究准确可靠、快速简便的品种鉴定技术。高丹草是根据杂种优势原理，用高粱和苏丹草杂交而成，由第三届全国牧草品种审定委员会最新审定通过的新牧草。高丹草综合了高粱茎粗、叶宽和苏丹草分蘖力、再生力强的优点，杂种优势非常明显。干草中含有粗蛋白，含糖量较高，适宜青贮。可以用来养牛、羊、兔、鹅和鱼等畜禽。生产上表现优质高产，效益明显，是一种在生产中很重要的牧草。目前国审品种一共有七个，分别是皖草2号(育成品种)、天农青饲I号(育成品种)、乐食(引进品种)、皖草3号(育成品种)、天农2号(育成品种)、冀草2号(育成品种)、晋牧I号(育成品种)。SSR (Simple sequence repeat)也叫微卫星 DNA,是一类由几个(多为 1-δ 个)碱基组成的串联重复DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。由于SSR序列的两端一般为保守序列，因此可以通过保守序列设计扩增SSR序列，扩增出的SSR序列形成长短不一的图谱，从而能够区分出不同的材料。SSR指纹技术重复性好，简单易于操作，且是共显性标记，广泛应用于品种鉴定和纯度分析。在一些主要农作物如玉米、大豆、小麦、大麦等已经建立起了品种鉴定的快速检测方法，但目前在高丹草还没有 相关报道，由于SSR引物的种间特异性，每种植物都需要开发新的引物和检测流程。
发明内容
本发明的一个目的是提供一组用于检测或辅助检测待测草种是否为高丹草国审品种的引物组，由引物对POl-引物对P20共20个引物对组成；所述引物对POl由序列表中序列I所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对P02由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；所述引物对P03由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；所述引物对P04由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；所述引物对P05由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；所述引物对P06由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；所述引物对P07由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；所述引物对P08由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；所述引物对P09由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；所述引物对PlO由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；所述引物对Pll由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；所述引物对P12由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；所述引物对P13由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；所述引物对P14由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；所述引物对P15由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；所述引物对P16由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成；所述引物对P17由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成；所述引物对P18由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成；所述引物对P19由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成；所述引物对P20由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成。上述引物组中的各条引物均独立包装；所述高丹草国审品种为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号或晋牧I号。本发明的另一个目 的是提供一种用于检测或辅助检测待测草种是否为高丹草国审品种的PCR试剂组。本发明提供的PCR试剂组，由如下20种PCR试剂组成:
I)由上述引物组中的引物对POUPCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；2)由上述引物组中的引物对P02、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；3)由上述引物组中的引物对P03、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；4)由上述引物组中的引物对P04、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；5)由上述引物组中的引物对P05、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；6)由上述引物组中的引物对P06、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；7)由上述引物组中的引物对P07、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；8)由上述引物组中的引物对P08、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；9)由上述引物组中的引物对P09、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；10)由上述引物组中的引物对P10、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；11)由上述引物组中的引物对P11、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；12)由上述引物组中的引物对P12、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；13)由上述引物组中的引物对P13、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；14)由上述引物组中的引物对P14、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；15)由上述 引物组中的引物对P15、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；16)由上述引物组中的引物对P16、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；17)由上述引物组中的引物对P17、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；18)由上述引物组中的引物对P18、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；19)由上述引物组中的引物对P19、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；20)由上述引物组中的引物对P20、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水。上述的PCR试剂组中，每个引物对中的每条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度为20pmol ;所述PCR试剂均独立包装；所述高丹草国审品种为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号或晋牧I号。含有上述引物组的试剂盒或含有上述PCR试剂组的试剂盒也是本发明保护的范围。上述引物组、上述PCR试剂组或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否为高丹草国审品种中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述高丹草国审品种为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号或晋牧I号。待测样品为高丹草或疑似高丹草品种。本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测草种是否为7个高丹草国审品种中任一种的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:I)用上述引物组中的20个引物对、上述PCR试剂组或上述的试剂盒分别对待测草种和7个高丹草国审品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的20种电泳图谱和7个高丹草国审品种中每个的20种含有特异扩增条带电泳图谱；所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的每个高丹草国审品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应；2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与其对应的7个高丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带均具有与其对应的任一个高丹草国审品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种为或候选为对应的高丹草国审品种；若少于18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带具有与其对应的任一个高丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种不为或候选不为对应的高丹草国审品种；所述7个高丹草国审品种具体为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号和晋牧I号。每个闻丹草国审品种可以为对应的闻丹草国审品种也可以为确定的闻丹草国审品种。上述每个高丹草国审品种的20对引物扩增的电泳图谱中特异扩增条带的组成如表3所示。上述待测草种为高丹草或疑似高丹草品种。本发明第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测草种与对照高丹草品种是否为同一品种的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:I)用上述引物组中的20个引物对、上述PCR试剂组或上述的试剂盒分别对待测草种和对照高丹草品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的20种电泳图谱和对照高丹草品种的20种含有特异扩增条带电泳图谱；所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的对照高丹草品种的电泳图谱相对应；2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与对照高丹草品种的电泳图谱分别进行比对，若至少18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带均与其对应的对照高丹草品种的电泳图谱一致的条带，则待测草种与对照高丹草品种为或候选为同一品种；若小于18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带与其对应的对照高丹草品种的电泳图谱一致，则待测草种与对照高丹草品种不为或不候选为同一品种；上述对照高丹草品种为高丹草国审品种标准品或已经表型鉴定的高丹草国审品种。上述高丹草国审品种20对引物扩增的电泳图谱中特异扩增条带的组成如表3所
/Jn ο上述方法中，所述电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶；所述PCR的模板为基因组DNA，在本发明的实施例中具体采用的是40株混样的基因组DNA。上述待测草种为高丹草或疑似高丹草品种。本发明的实验证明，本发明筛选出20对SSR引物，用其对牧草进行PCR扩增，得到的20种产物的电泳图谱与7种高丹草国审品种的电泳图谱进行目的特异条带的谱带比较，若20种产物的电泳图谱中至少18种与目的特异条带的谱带一致，则可以候选判断该牧草与为同一品种。根据 本发明的引物和方法进行鉴定，可以简单、快速、高效、准确鉴定出待测高丹草是否为7个国审品种真伪性。
图1为P17引物扩增样本1-9的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图2为P01、P02、P03引物扩增样本1_11的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图3为P04-08引物扩增样本1_11的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图4为P09-11引物扩增样本1_11的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图5为P12-17引物扩增样本1_11的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图6为P18引物扩增样本1-9的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
图7为P18引物扩增样本10-11的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图8为P19-20引物扩增样本1_11的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用七个高丹草国审品种:皖草2号、天农青饲I号、乐食、皖草3号、天农2号、冀草2号、晋牧I号，均可从市场购买；各种的背景如表I所示:下述实施例中所用的其他的4个非高丹草国审品种的草种如表I所示。表I为实验相关11个品种的基本信息
权利要求
1.一组用于检测或辅助检测待测草种是否为高丹草国审品种的引物组，由引物对POl-引物对P20共20个引物对组成； 所述引物对POl由序列表中序列I所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P02由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P03由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P04由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P05由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P06由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P07由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P08由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P09由序列表 中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成； 所述引物对PlO由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成； 所述引物对Pll由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P12由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P13由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P14由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P15由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P16由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P17由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P18由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P19由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P20由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于:所述引物组中的各条引物均独立包装; 所述高丹草国审品种为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号或晋牧I号。
3.一种用于检测或辅助检测待测草种是否为高丹草国审品种的PCR试剂组，由如下20种PCR试剂组成: 1)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P01、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 2)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P02、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 3)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P03、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 4)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P04、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 5)由权 利要求1或2所述引物组中的引物对P05、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 6)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P06、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 7)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P07、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 8)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P08、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 9)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P09、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 10)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P10、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 11)由权利要求1或2所述引物组中的引物对PlUPCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 12)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P12、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 13)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P13、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 14)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P14、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 15)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P15、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；16)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P16、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 17)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P17、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 18)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P18、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 19)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P19、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 20)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P20、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂组，其特征在于:每个引物对中的每条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度为20pmol ;所述PCR试剂均独立包装；所述高丹草国审品种为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号或晋牧I号。
5.含有权利要求1或2所述引物组的试剂盒或含有权利要求3或4所述PCR试剂组的试剂盒。
6.权利要求1或2所述引物组、权利要求3或4所述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否为高丹草国审品种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述高丹草国审品种为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号或晋牧I号。
8.—种检测或辅助检测待测草种是否为7个高丹草国审品种中任一种的方法，包括如下步骤: 1)用权利要求1或2所述引物组中的20个引物对、权利要求3或4所述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒对待测草种和7个高丹草国审品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的20种电泳图谱和7个高丹草国审品种中每个的20种含有特异扩增条带电泳图谱； 所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的每个高丹草国审品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应； 2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与其对应的7个高丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带均具有与其对应的任一个高丹草国审品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种为或候选为对应的高丹草国审品种；若少于18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带具有与其对应的任一个高丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种不为或候选不为对应的闻丹草国审品种； 所述7个高丹草国审品种具体为天农青饲I号、天农2号、皖草3号、乐食、皖草2号、冀草2号和晋牧I号。
9.一种检测或辅助检测待测草种与对照高丹草品种是否为同一品种的方法，包括如下步骤: I)用权利要求1或2所述引物组中的20个引物对、权利要求3或4所述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒对待测草种和对照高丹草品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的20种电泳图谱和对照高丹草品种的20种含有特异扩增条带电泳图谱；所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的对照高丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应； 2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与对照高丹草品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带均具有与其对应的对照高丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种与对照高丹草品种为或候选为同一品种；若少于18个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带具有与其对应的对照高丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种与对照高丹草品种不为或不候选为同一品种。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶；所述PCR的模板为基因组DNA。`
全文摘要
本发明公开了一种检测或辅助检测高丹草国审品种方法。本发明提供了一组用于检测或辅助检测高丹草国审品种的引物组，由引物对P01-引物对P20共20个引物对组成。本发明的实验证明，本发明筛选出20对SSR引物，用其对牧草进行PCR扩增，得到的20种产物的电泳图谱与7种高丹草国审品种的电泳图谱进行谱带比较，若20种产物的电泳图谱中至少18种与谱带一致，则可以候选判断该牧草与为同一品种。根据本发明的引物和方法进行鉴定，可以简单、快速、高效、准确鉴定出待测牧草是否为7个国审品种真伪性。
文档编号C12Q1/68GK103146832SQ201310089660
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者高秋, 苏红田, 李玉荣, 屠德鹏, 冯葆昌, 马金星, 李存福 申请人:全国畜牧总站