专利名称：一种利用羰基还原酶不对称还原制备(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用羰基还原酶不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法及应用。
背景技术：
(S) -4-氯-3 轻基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S) -CHBE)是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-轻基批唳烧酮(4_hydroxypyrrolidone)等[I]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括起来主要有化学催化不对称还原法和微生物法。化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂的贵铑、釕等金属，采用化学法合成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗能闻，污染大。微生物法分为酶 催化和全细胞催化法，Shimizu等用来自SporobolomycessalmonicolorAKU4429的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系[2]和水/有机溶剂两相体系[3]催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相比，应用较少。全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S) - CHBE两种，Yasohara等[4]从400株酵母菌中筛选得到了一株Candida magnoliae,在水/乙酸正丁酯体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的条件下产物(S) -CHBE在有机相的积累浓度可达90g/L,产物的光学纯度对映体过量值(enantiomeric excess e.e)达到96%。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化COBE为不同构型CHBE的还原酶，因此采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。Yasohara等[5]从木兰假丝酵母菌Candida magnoliae中分离得到了一个辅酶NADPH依赖型的羰基还原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定时添加适量的辅酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE的不对称还原(S)-CHBE，其得率和光学纯度分别为85%和100%e.e.[6]。综上所述，现有催化COBE为(S) -CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性底、成本高等问题。本专利中涉及到的还原酶是羰酰还原酶的一种，其包含279个氨基酸，其在Uniprot 蛋白质序列数据库中的收录号为 G8YAY6, (http://www.uniprot.0rg/uniprot/G8YAY6)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。编码该蛋白的基因含有840bp碱基，其在European Nucleotide Archive 数据库中的收录号为 CCE83650，(http://www.eb1.ac.uk/ena/data/view/CCE83650)，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。至今未发现该羰酰还原酶用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE的报道。参考文献:[l]Karanewsky DSj Badia MCj Ciosek CP Jrj Robl JFj Sofia MJ，SimpkinsLMjDeLange B，Harrity TWj Biller SAjGorden EM(1990)Phosphorus-containinginhibitors of HMG-CoA reductase.1.4-[2-arylethyl]-hydroxyphosphinyl]-3-hydroxybutanoic acids:a new class of cell-selective inhibitors of cholesterolbiosynthesis.J Med Chem33:2925 - 2956。[2] Shimizu S，Kataoka M，Morishita A Katoh Mj Morikawa Tj Miyoshi T，YamadaH(1990a)Microbial asymmetric reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutaoate tooptically active ethyl4-4-chloro-3-hydroxybutanoate.Biotechnol lettl2:593—596。[3] Shimizu Sj Kataoka Mj Katoh Mj Morikawa Tj Miyoshi T，Yamada H (1990b)Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutaoate by a microbialaldehyde reductase ·in an organic solvent-water diphasic system.Appl EnvironMicrobiol56:2374-23770[4] Yasohara Yj Kizaki Nj Hasegawa J，Takahashi Sj Wada M，Kataoka Mj ShimizuS (1999)Synthesis of opticalIy activeethyl4~chloro-3~hydroxybutanoate bymicrobial reduction.Appl Microbiol Biotechnol51:847 - 851。[5] Wada M，Kataoka Mj Kawabata Hj Yasohara Yj Kizaki Nj Hasegawa Jj ShimizuS (1998)Purification and characterization of NADPH-ependent carbonyl reductaseinvolved in stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3_oxobutanoate，fromCandida magnoliae.Biosci Biotechnol Biochem62:280 - 285。[6] Yasohara Yj Kizaki Nj Hasegawa Jj Wada M，Kataoka Mj Shimizu S (2000)Molecular cloning and overexpression of the gene encoding an NADPH—dependentcarbonyl reductase, involved in stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate，from Candida magnoliae.Biosci Biotechnol Biochem64:1430 - 1436。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种利用羰基还原酶不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法。本发明的另一个目的是提供羰酰还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备
(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。本发明的目的是通过下列技术方案实现的:一种利用羰基还原酶不对称还原制备(S)-4_氯-3羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(还原型辅酶II，NADPH)为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
所述的方法，其中所述的羰酰还原酶是通过表达基因序列如SEQ ID NO:1所示的重组菌表达得到的。所述的方法，其中表达基因序列如SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌重组菌，经诱导表达培养(诱导表达采用IPTG或乳糖)，收集菌体，破碎后与200mmol/L 2mol/L葡萄糖、1.5 300g/L的4_氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,⑶H)和0.05 0.5mmol/L的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(氧化型辅酶II，NADP)，在pH6.0 7.5、20 30°C、180 280rpm条件下反应16 32h，得到(S) ~4~氯-3羟基丁酸乙酯。其中，加入NADP与⑶H即生成NADPH，且使反应循环进行，降低了加入量以减少了生产成本。所述的方法，其中羰酰还原酶用量按酶活计为100U-80000U ;优选3100U-62000U。所述的方法，其中羰酰还原酶与底物的用量关系为催化每克底物需酶66.66U-2066.66U ;优选 206.66U-2066.66U。氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的羰酰还原酶在4_氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。本发明的有益效果:发明人基于现代生物信息学思想，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段嗜山梨酵毕赤氏酵母(Pichia sorbitophila)克隆羰酰还原酶的基因,在大肠杆菌中I禹合表达后发现其在水相中能够高效的催化COBE为(S)-CHBE，e.e值为100%。同时，通过在水/有机相中反应、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和产物对细胞和酶的抑制作用，显著的提高了转化效果。通过对 羰酰还原酶的基因进行重组表达，获得了具有新型催化功能的酶蛋白，开发了该条基因的新功能——催化非天然底物COBE为高立体选择性的(S)-CHBE。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的羰酰还原酶应用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE中，取得很好的效果，在不添加辅酶的情况下，可以催化合成300g/I(S)-CHBE0氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的羰酰还原酶对底物COBE的得率高(大于95%)、产物CHBE的光学活性高(e.e%为100% )，且产量高，大大降低了生产成本。
:图1为羰酰还原酶基因表达载体的构建图。
具体实施方式
:根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1步骤1、羰酰还原酶基因的获取嗜山梨酵毕赤氏酵母(Pichiasorbitophila CBS7064)(购于 Centraalbureauvoor Schimmelcultures (CBS), Fungal Biodiversiry Centre),培养基 YPD (g.L-1):酵母提取物IOg,蛋白胨20g,葡萄糖20g,补蒸懼水至1L。将嗜山梨酵毕赤氏酵母(Pichiasorbitophila)接种于5mL YPD液体培养基中30°C培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试剂盒)，提取基因组。构建表达载体所用的引物(上游引物:ATGTCTCAAGCTATCTCAG ;下游引物:TTATGGTACAGTGTAGCCA)加设酶切位点，基因的PCR条件:94°C变性7min，按如下参数循环30次:94°C变性lmin，60°C退火50s，72°C延伸
1.5min。最后 72°C延伸 IOmin0步骤2、表达载体的构建用Nde I及BamH I分别酶切pET-22b(pET_22b购于Novagen (默克中国))及所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-22b与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，得到重组载体pET-22b-CR ；将IOyL的连接产物pET-22b-CR加入100 μ L的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42°C热激 90sec。冰上放置 2min。加入预热的 0.45mL LB 培养基。220rpm37°C lh。将200 μ L菌液加入分别含有100 μ g/mL的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C过夜培养12 — 16h，得到重组菌E.coli Rosseta(含pET-22b-CR)。构建图谱见图1。步骤3、酶活的测定分别挑取重组菌E.coli Rosseta (含pET_22b_CR)及出发大肠杆菌Rosseta(DE3)至含100 μ g/mL氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜LB培养液中，37°C培养至OD6tltl约为0.6时，加入IPTG至终浓度
0.Hmmol.L-1, 25°C, 220rpm,诱导表达 IOh 后，离心(4°C, 5000rpm, 15min),菌泥用 IOOmM 憐酸钾缓冲(ρΗ6.2)重悬，超声破碎细胞(功率300W，超声5s,间歇5s，共5min)，离心(4°C，12000rpm, 15min),测定上清中的酶活。酶反应体系包括 IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，5mM NADPH, 20mM COBE, 30°C，340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化lymol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，出发大肠杆菌Rosseta (DE3)的比酶活为0.12U/mg,而重组菌E.coliRosseta (pET_22b_CR)的比酶活为 6.2U/mg。步骤4、重组大肠杆菌Ε.coli Rosseta (pET_22b_CR)的发酵挑取重组菌E.coli Rosseta (pET_22b_CR)至含100 μ g/mL氨节青霉素抗生素的LB培养液，37°C振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜LB培养液中，37°C培养至0D_约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8mmol.Γ1，25°C，220rpm，诱导表达IOh后，8000rpm,4°C离心IOmin,弃上清,沉淀(菌泥)备用。步骤5、取步骤4的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol *L-l,pH6.5)洗漆两次,按每升反应体系称取0.5g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH6.5磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)后(取样检测羰酰还原酶活性约为3100U)加入反应体系(1L)，反应体系中各物质的初始浓度为:葡萄糖200mmol/L，COBE1.5g/L，⑶H50U/L,NADP0.05mmol/L，20°C，180rpm，反应 16h。气相色谱测定产物(S)-CHBE 的产量为 1.45g/L，产物的得率为:96.7%，液相色谱测定光学纯度e.e%为100%。实施例2重复实施例1的步骤I至步骤4,取步骤4的沉淀用磷酸钾缓冲(IOOmmol.L-1,pH6.5)洗漆两次,按每升反应体系称取IOg (湿重)的大肠杆菌菌泥,悬浮于200mL的pH6.5磷酸钾缓冲中，取样检测羰酰还原酶活性约为62000U，加入200mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入反应体系(1L)，反应体系中各物质的初始浓度为:加入葡萄糖 2mol/L，C0BE300g/L,⑶H5KU/L，NADP0.5mmol/L, 25°C , 280rpm,32h。产物(S)-CHBE的产量为288.7g/L，产物的得率为:96.2%，光学纯度e.e%为100%。产物的检测方法:对于水相反应:反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡IOmin然后放置两小时，8000rpm离心IOmin分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保
存测样。对于水/有机两相反应:反应结束后8000;rpm尚心IOmin分尚有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。PEG-20M毛细管柱，内标物为萘。程序为:检测器FID，温度210°C，汽化室温度210。。，柱温 150。。，柱头压 0.03MPa,氢气 0.05MPa,空气 0.1MPa,尾吹 0.08MPa。用 HPLC 对
(S)-4-氯-3-轻基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱Chiralcel 0B, 4.6X250mm;DaicelChemical Industries,日本)，检测条件:流动相为正己烧:正己烧(体积比为9:1)，波长214nm，流量 为0.8mL/min, R型和S型CHBE的出峰时间分别为:10.5min和11.6min。
权利要求
1.一种利用羰基还原酶不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的羰酰还原酶是通过表达基因序列如SEQ ID NO :1所示的重组菌表达得到的。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于表达基因序列如SEQID NO :1所示的大肠杆菌重组菌，经诱导表达培养，收集菌体，破碎后与200mmol/L 2mol/L葡萄糖、I. 5 300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU的葡萄糖脱氢酶和O. 05 O. 5mmol/L的NADP,在pH6. O 7. 5、20 30°C、180 280rpm条件下反应16 32h，得到(S) -4-氯-3羟基丁酸乙酯。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于诱导表达采用IPTG或乳糖。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于羰酰还原酶用量按酶活计为100U-80000U。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于羰酰还原酶用量按酶活计为3100U-62000U。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于羰酰还原酶与底物的用量关系为催化每克底物需酶 66. 66U-2066. 66U。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于羰酰还原酶与底物的用量关系为催化每克底物需酶 206. 66U-2066. 66U。
9.氨基酸序列如SEQID NO :2所示的羰酰还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用羰基还原酶不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法及应用。该方法以氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。该方法采用的酶活性高达6.2U/mg，其对底物的得率高达95%、产物的对映体过量值为100％，且产量高，大大降低了生产成本。
文档编号C12P7/62GK103255183SQ20131013506
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年1月8日
发明者方明, 赵 权 申请人:南京昌信嘉生物技术有限公司