专利名称：一株抗冻能力强的酿酒酵母菌株及其在冷冻生胚加工中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物技术领域，主要涉及一株抗冻能力强的酿酒酵母菌株及其在冷冻生胚加工中的应用。
背景技术：
冷冻生胚，是指含有酵母的面团经过切块、成型、速冻加工的面粉加工产品，可以长期冻藏。目前，美国、欧洲、日本等发达国家已广泛使用冷冻生胚制作面包。1997年美国已有80%的烘焙房使用冷冻生胚，1998年法国的冷冻生胚生产量已占面包生产量的50%以上，2006年日本的冷冻生胚销售额已达1470亿日元，其生产量占面包生产量的6.8%。采用冷冻生胚，商店、餐饮店、食堂可以保证面包的新鲜度和品质稳定性，同时减少生产经营所需场地和时间，节约劳力和 成本。此外，消费者也可以在家里享受面包制作的乐趣，随时吃上美味可口的新鲜面包。近年来，冷冻生胚技术及其应用在韩国、中国也已经开始受到关注。冷冻生胚除了用于面包加工外，还可以用于馒头、包子等传统中式食品的加工。冷冻生胚加工的过程中，酵母在胞外冻结和胞内冻结的双重作用下，细胞质膜容易受到损伤，其代谢途径、酶活力也受到相应影响，存活率和发酵能力也大大降低。因此，冷冻生胚加工的关键是选择抗冻酵母，即具有抗冻能力的面包酵母。抗冻酵母的标准是，其必须在经过超低温速冻、解冻后仍然保持活力，以保证冷冻面团解冻的醒发、以及焙烤产品的大小、形状和口感等产品质量。现有技术中，抗冻酵母的选育方法有:(I)天然选育江正强等(江正强，齐金姗，邓红等.耐冷冻酵母菌的筛选[J].中国农业大学学报，2002，7(6):87-91)从自然界(土壤、谷物、果蔬和空气等)中筛选分离出60多株酵母菌，通过冷冻面团初筛和复筛，最后得到了 3株抗冻酵母FTY-28、FTY-31和FTY-56。这3株酵母在冷冻面团中冻藏7天后，酵母细胞存活率均在70%以上。Alves-Araiijo 等(Alves-Araii jo C，Almeida M J, Sousa M J, et al.Freezetolerance of the yeast Torulaspora delbruecki1: cellular and biochemicalbasis [J].FEMS Microbiology Letters, 2004, 240:7-14)从自然界筛选分离出的德尔布有孢圆酵母(T.delbrueckii PYCC5323)，在-20 V冻藏120天后，酵母细胞存活率能达到80%，而酿酒酵母(S.cerevisiae PYCC5325)只有20%的存活率。中国专利(俞学峰，李知洪，余明华等.一种耐冷冻酵母及其组合物、面团[P].中国专利:CN101575577，2009)公开了从自然界和细胞杂交的菌株中筛选得到一株耐冷冻酵母，采用该耐冷冻酵母的冷冻面团在解冻7天后的发酵力为530mL，是新鲜面团的85%。(2)诱变选育耿瑞玲等(耿瑞玲.酵母抗冻性研究及其在冷冻面团中的应用[D].河南:河南农业大学，2011，06)对酿酒酵母216分别进行紫外诱变和硫酸二乙酯诱变。紫外诱变时，距离菌悬液28.5cm以15w的紫外灯照射，分别照射0、30、60、90、120、150、180s后，进行抗冻性测定。硫酸二乙酯诱变时，在菌悬液中分别加入0.5%、1.0%和1.5%的硫酸二乙酯，27°C，150rpm恒温振荡20、40、60min后，加入0.5mLNa2S203溶液终止反应，进行抗冻性测定。结果表明，紫外诱变90s时，得到的突变菌株抗冻性最强；硫酸二乙酯添加量为l%，150rpm振荡40min时，突变菌株抗冻性最强。Teunissen A 等(Teunissen A, Dumortier F，Gorwa M-F, et al.1solation andcharacterization of a freeze-tolerant diploid derivativeof an industrialbaker's yeast strain and its use in frozen doughs[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2002, 10(68):4780-4787)对工业二倍体酵母S47和多倍体酵母L13进行紫外(10mJ/m2)诱变，并将诱变后的酵母加入面团中，“冷冻-解冻”循环筛选抗冻酵母菌株。结果显示，以S47为亲本诱变后得到的酵母AT25，具有较好的抗冻能力。中国专利(石彦国，孙冰玉，梁金钟等.一种生冻包子的制作方法[P].中国专利:CN102871007A，2013)采用耐酒精菌株选育、杂交和原生质体融合技术，选育到一株抗冻酵母。(3)基因改造Shima J等(Shima J, Hino A, Yamada-1yo C，et al.Stress tolerance in doughsof Saccharomyces cerevisiae trehalase mutants derived from commercial baker’ syeast [J].Applied and Environmental Microbiology, 1999，7 (65): 2841-2846)发现，海藻糖对酵母的抗冻性有重要作用。以商业面包酵母为亲本菌株，利用基因破碎法构建出纯合二倍体海藻糖突变株(Anthlathl，Anthl, Λ athl)，所有突变株的海藻糖降解得到抑制，在稳定期后期均可积累2倍于亲本的海藻糖，耐冷冻能力明显优于亲本，而且产气能力也得到提高，尤其是Λ nthl菌株。
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Takagi 等(Takagi H, Sakai K, Morida K, et al.Proline accumulation bymutation or disruption of the proline oxidase gene improves resistanceto freezing and desiccation stresses in Saccharomyces cerevisiae[J].FEMSMicrobiology Letters, 2000, 184:103-108)构建了一株脯氨酸酶缺陷型(不能利用脯氨酸)的酵母菌株putl，其胞内脯氨酸的含量为8.7%，而其出发酵母菌株的含量仅为
0.5%。将这两种菌株的菌悬液在-20°C下冻藏3天后，平铺在无菌平皿上于20°C条件下保藏4天，脯氨酸酶缺陷型酵母菌株的细胞存活率约为野生型酵母菌株的2倍。同样，破坏面包酵母的基因putl (编码脯氨酸氧化酶)，将基因prol (编码Y-谷氨酰激酶)替换为其等位基因prol (D154N)或prol (I150T)，得到的工程菌积累了大量的脯氨酸，其中prol-1150T/ Δ putl菌株比亲本菌株高6.3%，但是此菌株胞内谷氨酸和精氨酸的含量较低。此夕卜，SasanoY等(SasanoY, Haitani Y, Hashida K, et al.Simultaneousaccumulation of proline and trehalose in industrial baker's yeast enhancesfermentation ability in frozen dough[J].1nternational Journal of Food Microbiology, 2012，113(5):592-595)通过基因重组等生物技术构建出一株同时富含海藻糖和脯氨酸的酵母菌株prol-1150T/Anthl，且其胞内海藻糖和脯氨酸的含量比prol-1150T酵母菌株和Anthl酵母菌株的都要高，抗冻能力也最强。综上可知，抗冻酵母可以通过天然选育、诱变选育和基因改造等途径获得。但是从文献和公开专利中可以发现，目前适用于冷冻生胚生产的抗冻酵母菌非常有限。其主要原因有:(1)抗冻酵母的抗冻能力不强，冻藏稳定性较差，在冷冻面团中的发酵力低；(2)基因工程酵母菌一方面受到人们对其食品安全的担忧，另一方面也很难通过一系列的基因改组来获得细胞在各方面的催化能力。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一株抗冻能力强、可以在冷冻生胚加工中应用、符合食品安全标准的酵母菌株。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下:一、本发明采用室温等离子体诱变技术，选育出一株发酵能力强的抗冻酵母菌株，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1,保藏编号为CCTCC NO:M2013079)。二、本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1在制备冷冻生胚中的应用:将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1按照冷冻生胚的酵母需求量加入配方中，制备成新鲜胚料，冷冻后制得冷冻生胚。本发明的有益效果在于:(1)本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1菌株是通过对出发菌株进行室温等离子体诱变得到的高抗冻性能菌株，其改变了出发酵母自身的基因组序列以及基因表达，没有外源基因的引入，因此其应用于冷冻生胚中，能保证冷冻生胚食品的安全性。(2)本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1菌株对冷冻速度的适应能力强，冻藏稳定性好，在-20 _80°C条件下的冷冻并冻藏128天后细胞存活率仍然保持在83%以上，相对于现有技术的菌株，其抗冻能力大大增强；(3)本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1菌株在冷冻生胚中的发酵能力强，对冷冻生胚中成分的适应范围广。本发明的抗冻酵母可以用于各种发酵面点冷冻面胚的生产，例如但不局限于:包子、馒头、花卷、发糕等中式面点；面包、蛋糕底、pizza底、蛋挞等西式面点。(4)本发明为冷冻面包、冷冻面点等冷冻生胚的产业化生产提供了核心技术和材料。采用冷冻生胚加工技术，能够将生胚制作和蒸、烤分离，有利于面点、面包的专业化生产，降低产品的生产成本，提高和产品新鲜度控制。冷冻生胚加工是面点、面包产业的发展方向，市场潜力巨大。
图1出发酵母在种子培养基中的生长曲线(培养温度:30°C)。图2等离子体照射中的细胞存活率曲线(放射功率:360W)。图3出发酵母菌株和目的菌株AFY-1在冻藏中的细胞存活率变化；
其中，籲:-20°C冻藏出发酵母菌株；O:-20°C冻藏抗冻酵母AFY-1 ；▲:-80°C冻藏出发酵母:-80°C冻藏抗冻酵母AFY-1。图4新鲜面团体积随醒发时间的变化关系图；其中，醒发条件:30°C、85%湿度；籲:出发酵母；〇:抗冻酵母AFY-1。图5最大面团体积随冻藏时间的变化；其中，冻藏条件:-20°C，醒发条件:30°C、85%湿度；.:出发酵母；〇:抗冻酵母AFY-1。图6平均醒发速度随冻藏时间的变化；其中，冻藏条件:-20°C，醒发条件:30°C、85%湿度；.:出发酵母；〇:抗冻酵母AFY-1。 图7菌株发酵力测定装置简图；其中，A:1000mL广口玻璃瓶；B:2500mL小口试剂瓶；C =IOOOmL玻璃量筒；D:恒温
水浴；E:面团。图8发酵力随冻藏时间的变化；其中，冻藏条件:-20°C ;醒发温度:30°C ；.:出发酵母；〇:抗冻酵母AFY-1)图9用新鲜面团和冷冻面团烘烤的面包(冻藏条件:-20°C,70d)。本发明的生物材料酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1的保藏日期为2013年03月12日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为:中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCCN0:M2013079。
具体实施例方式实施例1本实施例说明本发明的目的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AFY_1菌株的获取方法。A、出发菌株及其来源以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) (CGMCC2.1423)为出发出发菌株，该菌种购买自中国微生物菌种保藏管理中心。B、出发菌种活化与保藏(I)固体培养基的配制:按照质量百分比:葡萄糖:1%、蛋白胨:1%、酵母膏:0.5%、琼脂:2%。(2)菌种活化用接种环将出发菌株从安瓿管中取出，接种到斜面培养基中。将斜面培养基放于30°C的生化培养箱中培养48h。(3)菌种保藏经斜面培养连续传两代后，分别在4°C和_80°C的温度条件下保藏出发菌株。C、出发菌株的生长曲线(I)种子培养基(液体培养基)按照质量百分比:葡萄糖:3%、酵母膏:1%、氯化钠:0.8%、磷酸二氢钾:0.1%、硫酸镁:0.05%, pH 为 4.8。
(2)生长曲线绘制用接种环将出发菌株从斜面培养基接种至种子培养基中。接种过程注意接种量一致。每瓶种子培养基约15mL,培养条件为30°C、180rpm、48h。培养过程中，每隔2h取样ImL,并稀释一定倍数，采用紫外分光光度计，用石英比色皿在660nm处测定菌液光密度(即OD值)。测定过程中，须使样品在稀释一定倍数后，其OD在0.2 0.9范围内。(3)生长曲线图1表示出发菌株在种子培养基中的生长曲线。约20h内，菌液OD值随着培养时间的增加而迅速增加。约20h后，OD值不再发生显著变化。由于菌浓度与菌液光密度值成正比。因此，可以认为该菌株在培养4 20h内处于对数生长期，而约20h时进入生长稳定期。D、出发菌株的室温等离子体诱变及抗冻突变株选育I)室温等离子体诱变采用次大气辉光放电室温等离子体表面处理系统(HPD-280，南京苏曼电子)作为菌种诱变装置。将出发菌株培养至对数中期(即图1的生长曲线的第10小时)，取0.1mL菌液(细胞浓度:107个/mL)滴在无菌平皿上，将平皿放入等离子仓中，进行等离子体照射。诱变条件:在照射功率360W的条件下对出发酵母进行处理。等离子体照射结束后，用ImL的无菌生理盐水洗脱菌体，采用血小板计数法测定菌液试样中的活细胞浓度。诱变细胞存活率为等离子体照射后与照射前菌液的活细胞浓度之比。如图2所示，在照射功率360W的 条件下对出发酵母进行处理时，细胞存活曲线呈明显的马鞍形曲线，其峰值出现在处理时间90s。2)抗冻突变株筛选对突变株进行初选后，接种到实施例1所述的固体培养基上，30°C培养48h后，划线分离出5株，并编号。然后，将各菌株转接到装IOOmL种子培养基(同实施例1)的250mL三角烧瓶中，30°C、180rpm振荡培养到稳定期(5株菌株的生长曲线制作方法同上)，3000rpm离心，收集菌体，用去离子水洗涤2次后抽滤脱水得到酵母泥。分别称取酵母泥2g，加入适量生理盐水搅拌均匀，IOOmL定容，制成酵母菌液。将得到的酵母菌液分别在_20°C和_80°C条件下冻藏120d。冻藏过程中，取冻藏试样，在30°C的水浴锅中解冻lOmin，采用血小板计数法测定菌液试样中的活细胞浓度。筛选出抗冻能力最强的菌株，接入斜面培养基，作为抗冻酵母菌种，并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) AFY-1,与CCTCC保存,其编号为 CCTCCNO:M2013079)。冻藏细胞存活率为冻藏后与冻藏前菌液的活细胞浓度之比。出发酵母菌株和目的菌株AFY-1在-20°C和_80°C冻藏过程中的存活率变化如图3所示。起始20天内，出发酵母菌株和目的菌株AFY-1的细胞存活率都有所下降。冻藏20天后，抗冻酵母AFY-1细胞存活率稳定在83.2%，而原始酵母的细胞存活率则连续下降。实施例2本实施例说明本发明的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AFY_1的酵母细胞数测定方法。细胞数测定前，将酵母菌液试样稀释适当倍数后，取0.1mL和美蓝液0.9mL于试管中，染色lOmin。每个试样取3个平行样。
先将计数室与盖玻片用擦镜纸轻轻擦拭，将盖玻片盖于计数室上面，再用接种环取处理好的样液，接触盖玻片边缘，使菌液沿载玻片与盖玻片之间的间隙渗入计数室内，并充满室内。将计数板置于显微镜载物台上，先在低倍镜下找到计数板上的大方格网，再将计数室移至视野中央，转换高倍镜，调节焦距与光亮使感到清晰后开始计数。随机记下5个中格(四角与中央)内的菌数。为避免计数重复或遗漏，采用先上后下，先左后右的原则进行计数。另外分格线上的菌则按照记上不计下、记右不计左的原则计数。遇到未脱离母体的牙体则与母体合计记为一个。每个计数室需分别记下5个中格内死、活细胞数(死者染成蓝色，活者不染色)。根据测出的细胞数、原菌液试样稀释倍数，计算出原菌液的细胞浓度。每一菌液计三次再求其平均。实施例3本实施例说明本发明的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AFY-1菌株细胞内成分含量测定方法。对冷冻前、冷冻后出发酵母和抗冻酵母细胞内的海藻糖、甘油、氨基酸含量进行测定。冷冻条件为_20°C、24h。I)海藻糖、甘油含量测定(I)酵母胞内海藻糖、甘油的提取精确称取酵母泥1.0g置于烧杯中，加入20mL去离子水制成菌悬液，然后将烧杯放入微波炉(PJ23C-SC1型，美的微波炉制造有限公司)中，在2450MHz (中高火)条件下处理3次，每次25s，加热至菌悬液微沸使酵母细胞破碎，每次均需等菌悬液的温度冷却至室温再进行下I次处理，将处理后的试样在 室温下静置提取Ih (冷冻酵母则直接放入微波炉中进行下面的步骤)。随后在4°C、3000rpm条件下离心lOmin，取上清液，加入稀盐酸以沉淀试样中的蛋白质，再离心(4°〇、3000印111、101^11)，取上清液并将其？!1调至中性后，定容至50mL，得到酵母胞内海藻糖、甘油的测试液。(2)海藻糖浓度测定测试液中的海藻糖浓度采用高效液相色谱法测定(LiLi Li，YanRui Ye1Li Pan, etal.The induction of trehalose and glycerol in Saccharomyces cerevisiae inresponse to various stresses[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 387:778-783)。高效液相色谱分析条件:高效液相色谱仪(Summit，美国戴安)；示差折光检测器(R1-101，H本 Shodex); Aminex HPX-87H 柱(300mmX7.8mm,Bio-Rad)柱温:室温；流动相为0.005mol/L的硫酸；流速0.6mL/min ;进样量20 μ L ;分析时间20min。取测试液lmL，0.22 um微滤膜过滤后，取20 μ L上样分析。(3)甘油浓度测定测试液中的甘油浓度采用比色法测定(张永生，高辉，王艳萍.克拉维酸发酵液中碳源一甘油含量的比色法测定[J].天津科技大学学报，2006，21 (I):15-17;周丽，孟祥红，刘成圣等.渗透胁迫对杜氏盐藻胞内甘油含量及相关酶活性影响[J].植物学通报，2006，23(2):145-151 )。取ImL测试液，加入去离子水稀释至2mL，加入ImL0.015mol/L的高碘酸钠溶液混匀，室温放置IOmin。随后加入4mLNash试剂，在60°C的水浴锅中反应30min。冷却后，在波长410nm下(752S型紫外分光光度计，上海棱光技术有限公司)测定吸光值。
2)氨基酸含量测定细胞内的氨基酸含量用氨基酸分析仪(A200，德国membraPure)测定。精确称取酵母泥1.0g置于烧杯中，加入20mL去离子水制成菌悬液。将其置于沸水浴中加热IOmin,使酵母细胞破碎并提取氨基酸(冷冻酵母则直接进行沸水浴)。待菌悬液冷却后，再离心(4°C、1500rpm、5min),取上清液定容至5OmL,作为氨基酸的测试液(Sasano Y, HaitaniY，Ohtsu I，et al.Proline accumulation in baker’s yeast enhances high-sucrosestress tolerance and fermentation ability in sweet dough[J].1nternationalJournal of Food Microbiology，2012， 152:40-43 ;Morita Y，Nakamori S，TakagiH.Effect of proline and arginine metabolism on freezing stress of Saccharomycescerevisiae[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，94(5):390-394)。原始酵母和抗冻酵母细胞内的海藻糖、氨基酸、甘油含量如表I所示。各成分的含量都以酵母细胞体干物基准表示。抗冻酵母AFY-1的海藻糖含量为3.25%，是出发酵母的3.7倍。抗冻酵母AFY-1的总氨基酸含量为13.00mg/g，是出发酵母的2.1倍。特别是，谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和丝氨酸在出发酵母中无检出，而在抗冻酵母AFY-1中的含量分别达到5.10,1.80,0.59,0.15mg/g。脯氨酸在出发酵母中的含量为0.26mg/g，而在抗冻酵母AFY-1中的含量增加到0.97mg/g。抗冻酵母AFY-1的甘油含量为0.23%，略高于原始酵母。据文献报道，在酵母细胞中，海藻糖是典型的应激代谢产物，能保护细胞在冷冻、脱水、高渗、高温、放射线及有毒试剂等不良环境下免遭伤害(和东芹，肖冬光，邹静.面包酵母耐冷冻性影响因子的研究进展[J].食品与发酵工业，2007，5(33):92-96)。此外谷氨酸、精氨酸和脯氨酸等带电氨基酸的积累可以提高酵母细胞的耐冻性(TakagiH, Iwamot F，Nakamori S.1solation of freeze-tolerant laboratory strainsof Saccharomyces cerevisiae from proline-analogue-resistant mutants[J].Appliedand Environmental Microbiology, 1997，47:405—411;Shima Jj Sakata-Tsuda Yj SuzukiY，et al.Disruption of the CARlgene encoding arginase enhances freeze toleranceof the commercial baker’ s yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Applied andEnvironmental Microbiology，2003，I (69):715-718;Sasano Yj Haitani Yj Hashida K，etal.Simultaneous accumulation of proline and trehalose in industrial baker’syeast enhances fermentation ability in frozen dough[J].1nternational Journal ofFood Microbiology, 2012，113(5):592_595)。这些成分在抗冻酵母AFY-1细胞中的含量都比原始酵母高，进一步证实了抗冻酵母AFY-1的耐冻性。表1原始酵母和抗冻酵母细胞内的主要成分含量
权利要求
1.一株发酵能力强的抗冻酵母菌株，其分类命名为酿酒酵母iSaccharomycescerehsiae) AFY-1，保藏编号为 CCTCC NO:M 2013079。
2.权利要求1所述的酿酒酵母cerevisiae)AFY-1在制备冷冻生胚中的应用:将酿酒酵母cerevisiae) KFi~l按照冷冻生胚的酵母需求量加入配方中，制备成新 鲜胚料，冷冻后制得冷冻生胚。
全文摘要
本发明涉及一株发酵能力强的抗冻酵母菌株，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AFY-1，保藏编号为CCTCCNOM2013079)。本发明还涉及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AFY-1在制备冷冻生胚中的应用将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AFY-1按照冷冻生胚的酵母需求量加入配方中，制备成新鲜胚料，冷冻后制得冷冻生胚。本发明为冷冻面包、冷冻面点等冷冻生胚的产业化生产提供了核心技术和材料。采用冷冻生胚加工技术，能够将生胚制作和蒸、烤分离，有利于面点、面包的专业化生产，降低产品的生产成本，提高和产品新鲜度控制。冷冻生胚加工是面点、面包产业的发展方向，市场潜力巨大。
文档编号A21D8/04GK103194401SQ20131013502
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者缪冶炼, 时晓剑, 陈玲, 陈君 申请人:南京工业大学, 陈玲